TransFLP - שיטה גנטית לשינוי<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; בהתבסס על שינוי הטבעי וFLP-רקומבינציה

Summary

שיטה מהירה כדי לשנות את הגנום של V. cholerae הוא תאר. שינויים אלה כוללים מחיקה של גנים בודדים, אשכולות גנים ואיים הגנומי כמו גם האינטגרציה של רצפים קצרים (למשל אלמנטים של פרומוטר או רצפי זיקת תג). השיטה מבוססת על השינוי הטבעי וFLP-רקומבינציה.

Abstract

מספר שיטות זמינות כדי לתפעל כרומוזומים חיידקים ^1-3. רוב הפרוטוקולים הללו מסתמכים על ההחדרה של פלסמידים replicative מותנה (למשל חסת replicons תלוי-PIR או רגיש לטמפרטורת ^1,2). פלסמידים אלה משולבים לתוך הכרומוזומים חיידקים המבוססים על רקומבינציה הומולוגיה בתיווך. מוטנטים insertional כאלה לעתים קרובות להשתמש ישירות בהגדרות ניסיוניות. לחלופין, בחירה לכריתת פלסמיד ואחרי ההפסד שלה ניתן לבצע, אשר לחיידקים גראם שליליים, לעתים קרובות מסתמכת על אנזים sucrase נגד בחירת levan מקודד על ידי גן sacB ^4. הכריתה יכולה לשחזר את הגנוטיפ טרום כניסה או תוצאה בחילופים בין כרומוזום והעתק פלסמיד המקודד של הגן השונה. חסרון בשיטה זו הוא שזה זמן רב. פלסמיד יש המשובט ראשון, זה דורש העברה אופקית לV. cholerae (ביותר n otably ידי הזדווגות עם E. זן חיידק תורם) או שינוי מלאכותי של האחרון, והכריתה של פלסמיד הוא אקראי וגם תוכל לשחזר את הגנוטיפ הראשוני או ליצור שינוי הרצוי, אם אין ברירה חיובית הוא הפעיל. כאן, אנו מציגים שיטה למניפולציה מהירה של V. כרומוזום cholerae (הים) ⁵ (איור 1). שיטת TransFLP זה מבוסס על האינדוקציה גילתה לאחרונה כיטין בתיווך של כישורים טבעיים באורגניזם ⁶ והשני נציג זה של Vibrio הסוג כמו V. ⁷ fischeri. יכולת הטבעית מאפשרת את הספיגה של דנ"א בחינם כולל שברי DNA PCR שנוצר. ברגע שמתחיל לעלות ומשלב מחדש את ה-DNA בכרומוזום נתון הנוכחות מינימאלית של 250-500 נקודתי בסיס של איגוף האזור ⁸ הומולוגיים. כולל סמן בחירה שבין אזורי איגוף אלה מאפשר זיהוי קל של transformants לעתים קרובות המתרחש. t "> שיטה זו יכולה לשמש למניפולציות גנטיות שונות של V. cholerae וחיידקים באופן טבעי מוסמכים פוטנציאלי גם אחרים. אנו מספקים שלוש דוגמאות רומן על מה שניתן להשיג בשיטה זו בנוסף למחקר שלנו שפורסם בעבר על מחיקות גן יחידות ו תוספת של רצפי זיקת תג ^5. צעדי ייעול כמה נוגעים לפרוטוקול הראשוני של שינוי כיטין המושרה טבעי ⁶ תשולבנה בפרוטוקול TransFLP זה. אלה כוללים בין השאיר את ההחלפה של רסיסי פגז סרטנים ידי כיטין פתיתים זמינות מסחרי ^8, התרומה של ה-PCR דנ"א המופק כהפיכת חומר ^9, ותוספת של אתרי יעד FLP-רקומבינציה (FRT) ^5. אתרי FRT לאפשר כריתת אתר ביים של סמן הבחירה מתווך על ידי FLP recombinase ^10.

Protocol

שיטת TransFLP (איור 1) באה לידי ביטוי בשלוש גישות שונות: אני) את המחיקה של שני גנים סמוכים מקודדים גורמים ארסיים של V. cholerae (למשל, ΔctxAB); השני) הסרת אי פתוגניות (למשל, ΔVPI-1), ושלישי) שילוב של רצף T7 RNA פולימראז תלוי מקדם מכירות במעלה זרם של גנים של אינטרס, אשר לאחר מכן מאפשר לו ביטוי מלאכותי ברקע המתח המתאים (למשל, T7-tfoX) (איור 2).

1. הכנת פתיתי כיטין

1. 50-80 מ"ג המשקל של פתיתי כיטין בצינור פלסטיק סטנדרטי 1.5 מ"ל. זה יכול להיות מוכן בכמויות גדולות. פתיתי כיטין זמינות מסחרי מסיגמא (מספר קט C9213).
2. חיטוי את הפתיתים שומרות את המכסים של הצינורות פתוחים.
3. מייד לסגור את המכסים לאחר החיטוי התקרר.
4. חנות autoclaved פתיתי כיטיןבטמפרטורת חדר.

2. אופציונלי: שינוי מלאכותי של ו ' cholerae עם FLP recombinase קידוד פלסמיד

1. הכן electrocompetent V. תאי cholerae באמצעות שיטות סטנדרטיות ^11. אחסן aliquots של תאים מוסמכים ב-80 ° C.
2. הוסף 1-2 μl של מיני הכנה רגילה של פלסמיד PBR-FLP ⁵ עד electrocompetent V. תאים וcholerae להעביר את התערובת לתוך electroporation קובט (0.2 רוחב פער סנטימטרים).
3. החל דופק ב1.6 קילו וולט.
4. הוסף 0.9 מיליליטר מדיום SOC, בעדינות להעביר לתא צינור מ"ל סטנדרטי 14. דגירה הלא מרגשת עבור 2.5-3 שעות ליום 30 ° C.
5. 100 μl פלייט ו300 μl על צלחות המכילות LB 100 מיקרוגרם / המ"ל אמפיצילין ולדגור על 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
6. לטהר שיבוט אחת וחנות כמניית גליצרול לניסויי TransFLP עתידיים.

3. עיצוב oligonucleotide ושרשרת פולימראז

1. לפחות שישה oligonucleotides נדרש להגביר אזור הדנ"א (הים) של עניין, כמו גם FRT-המוקף קלטת האנטיביוטיקה באמצעות PCR (איור 3). מומלץ לכלול גם זוג יחול oligonucleotides מחוץ לבר PCR המוכנס. זה מאפשר את הבדיקה לשילוב וכריתה נכונה של קלטת עמידות לאנטיביוטיקת FRT מוקף-(לדוגמה מתוארת כפריימרים 'CHK מטה' למעלה CHK 'ובתרשימי 3 עד 5).
2. עצב את oligonucleotides # 2, # 3, # 4, ו# 5 עם טיפול. הם צריכים להיות מסוגלים מספיק כדי לחשל (למשל ~ 28 נ"ב) ל-DNA התבנית. ה-DNA היא תבנית הדנ"א הגנומי (gDNA) לפריימרים # 2 ו # 5 וFRT קאן-FRT המכיל DNA פלסמיד כגון pROD17 ¹² ו PBR-FRT קאן-FRT (מחקר זה) לפריימרים # 3 ו # 4 ( איור 3 א).
3. עצב את פריימרים # 2 # 5 מאפשרים לבסיס שיוך נרחב בקצה 5'בין # 2 / # 3 ו # 4 / # 5, בהתאמה (האיור 3A הבלעה). שני סבבים של PCR לעקוב.
4. בצע 3 תגובות עצמאיות PCR כמו סיבוב 1 ^st של ה-PCR. הראשון יהיה להגביר את האזור במעלה הזרם של הגן / DNA-אזור של אינטרס בסיוע oligonucleotides # 1 ומס '2. PCR צריך לגרום שבר של לפחות 500 נ"ב באורך המאפשרים הומולוגי רקומבינציה בתוך התאים. ברים קצרים יותר (~ 250 נ"ב) יכולים להיות ⁸ מספיק אבל לא מומלצים.
5. במקביל לבצע PCR השני, אשר מגביר את קלטת אנטיביוטיקת FRT המוקף-. לדוגמות שניתן כאן אנחנו בעיקר משמשים APH (קאן ^R). oligonucleotides שימוש # 3 ומס '4 לתגובה זו (איור 3 א).
6. במקביל, מגביר את אזור מורד DNA באמצעות PCR (מדגם שלישי). בר PCR צריך להיות גם לפחות 500 נ"ב באורך. לבצע PCR עם gDNA כתבנית וoligonucleotides # ​​5 ו # 6 (איור 3 א).
7. לאחר טיהור של כל השלושה PCRברים, לבצע סיבוב 2 ^nd של ה-PCR. השתמש בתערובת שווה של כל שלושת שהברים שהושגו בסיבוב הראשון כתבנית. ההגברה מזורזת על ידי oligonucleotides # 1 # 6. בר PCR שהתקבל (איור 3 ב ') משמש כהפיכת ה-DNA בניסוי השינוי הטבעי (איור 1).

4. שינוי טבעי כיטין מושרה

1. לגדול V. תאי cholerae האירובי במדיום עשיר ב30 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים צפיפות אופטית ב 600 ננומטר של כ -0.5.
2. לקצור את החיידקים על ידי צנטריפוגה. שטוף את הכדור פעם אחת במצע מלאכותי מוגדר ⁽⁶ DASW) לפני resuspending התאים ב2 כרכים של DASW. הוסף 1 מ"ל של תרבות ל50-80 מ"ג פתיתי כיטין סטרילי (הסביר בנקודת 1). אם חיידקי הנמל פלסמיד PBR-FLP (נקודה 2 אופציונליים), תוספת אמפיצילין (50 מיקרוגרם / מ"ל) לתרבות. לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 16-24 שעות ללא תנועה.
3. הוסף & Gדואר; 200 ננוגרם של 2 ^nd הבר בסיבוב PCR-derived (הסביר בנקודה 3). מערבב בזהירות בלי להרים את החיידקים בהרחבה ממשטחי כיטין. לדגור על 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ללא תנועה.
4. מערבולת התרבות נרחבת ל≥ 30 שניות. מורח 100-300 μl על צלחות בינוניות LB סלקטיבית (צלחות LB גנטמיצין המכיל למשל kanamycin או לדוגמאות המסופקות כאן). השתמש בצלחות כפולות סלקטיבית אם חיידק נמל PBR-FLP פלסמיד ידי הוספת אמפיצילין במקביל לאנטיביוטיקה האחרת. דגירת צלחות ב 30 מעלות צלזיוס במשך 16-24 שעות או עד מושבות גלויות.
5. מבודד transformants הבודד מצלחות סלקטיבית. transformants כאלה החליף את לוקוס הכרומוזומים המקורי על ידי בר PCR בשל אירוע מוצלב כפול. זנים אלה יכולים לשמש ישירות לניסויים נוספים במקרה של הסרת קלטת האנטיביוטיקה אינה הכרחית.

5. הסרת קלטת סלקטיבי (הים) על ידי FLP-רקומבינציה

1. מלאכותי להפוך transformants עם PBR-FLP פלסמיד כאמור בשלב 2, אם לא עשה לפני assay השינוי הטבעי.
2. לגדל את החיידקים על צלחות אגרו LB המכילים אמפיצילין על 37 מעלות צלזיוס במשך 16-24 שעות. אפשרויות: לשנות את הטמפרטורה בין 2-3 שעות לעד 40 מעלות צלזיוס כביטוי של FLP מפלסמיד PBR-FLP הוא דה ^{מודחקת-5,10} בטמפרטורות הגבוהה; חיידקי העברה לצלחות רעננים אחרי כ. 8 שעות של דגירה.
3. מבחן לרגישות לאנטיביוטיקה (הדגים כאן לkanamycin; איור 1) על ידי restreaking את השיבוטים במקביל על צלחות אגרו המכילות אנטיביוטיקה ואנטיביוטיקה חופשיות. מבודד מושבות רגישות בודדות. הקפא שיבוט אמפיצילין עמיד כמניית גליצרול אם אתה מתכוון לשנות את המאמץ במחיקה / הכנסה באמצעות TransFLP אחרות נוסף.

6. אשפרה פלסמיד

1. לגדול תרבות לילה בתנאים אירוביים ויום 30 ° C. השתמש במדיום עשיר ללא תוספת של כל אנטיביוטיקה.
2. אופציונלי: לגדול תרבות טריה עבור 3-6 שעות על ידי דילול 1:100 תרבות הלילה במדיום טרי אנטיביוטיקה חופשיה.
3. דילול צלחת או פס (הים) של תרבות על צלחת אגר LB הרגילה (הים) ו דגירה של 30 ° C עבור 8-16 שעות (עד מושבות גלויות).
4. מבחן לאמפיצילין רגישות של השיבוטים ידי restreaking את השיבוטים במקביל על צלחות אגרו המכילות אנטיביוטיקה ואנטיביוטיקה חופשיות (איור 1). הקפא מתח אמפיצילין רגיש כמניית גליצרול.

תוצאות

תוצאות מייצגות של השלוש הדוגמות מוצגות באיורים 4 עד 6. הגישה הראשונה שמטרתו למחוק את הגנים השכנים ctxA וctxB. יחד הם לקודד גורם הארסיות המרכזית של ו ' cholerae, רעל כולרה. אנו מעוצבים oligonucleotides לשיטת TransFLP כפי שתואר לעיל ובהתאם לאיור 3. הלחץ של ה?...

Discussion

שיטת TransFLP שתוארה לעיל ובמקומות אחרים ⁵ כבר נעשה שימוש נרחב במעבדה שלנו. הסוג של מניפולציות גנטיות שישימות כולל בין שאר: מחיקה של גנים בודדים ואשכולות גנים, מחיקה של איים גנומיים (למשל, VPI-1), החדרה של רצפים במעלה זרם של גן של עניין (למשל, רצפי פרומוטר) והחד?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
פתיתי כיטין	סיגמא	C9213	מעוקר נדרש
אופציונלי: Micropulser (במקרה קלטת אנטיביוטיקה צריכה להיות מצונזרת על ידי recombinase FLP מקודד על PBR-FLP)	Biorad	165-2100	או electroporators דומה