TransFLP - un metodo per modificare geneticamente<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Sulla base di trasformazione naturale e FLP-ricombinazione

Riepilogo

Un metodo rapido per modificare il genoma di V. cholerae È descritto. Queste modifiche includono la cancellazione dei singoli geni, i cluster di geni e le isole genomiche, nonché l'integrazione di brevi sequenze (ad esempio, elementi promotori o per affinità tag sequenze). Il metodo si basa sulla trasformazione naturale e FLP-ricombinazione.

Abstract

Sono disponibili diversi metodi per manipolare cromosomi batterici ^1-3. La maggior parte di questi protocolli invocare l'inserimento di plasmidi replicativi condizionale (es. ospitano repliconi pir-dipendenti ovvero termosensibili ^1,2). Questi plasmidi sono integrati in cromosomi batterici basati su omologia-mediata ricombinazione. Tali mutanti inserzionali sono spesso direttamente utilizzati in contesti sperimentali. In alternativa, la selezione per escissione plasmide seguita dalla perdita può essere eseguita, per cui batteri Gram-negativi dipende spesso contro-selezionabile enzimatico saccarasi Levan codificata dal gene sacB ^4. L'escissione può ripristinare il pre-inserimento genotipo o provocare uno scambio tra il cromosoma e il plasmidica copia del gene modificato. Uno svantaggio di questa tecnica è che richiede tempo. Il plasmide deve essere clonato prima, richiede trasferimento orizzontale in V. cholerae la maggior parte (n otably con l'accoppiamento con una E. coli ceppo donatore) o trasformazione artificiale di quest'ultimo, e l'escissione del plasmide è casuale e può ripristinare il genotipo iniziale o creare la modifica desiderata in assenza di selezione positiva viene esercitata. Qui, presentiamo un metodo per la manipolazione rapida V. cholerae cromosoma (s) ⁵ (Figura 1). Questo metodo TransFLP si basa sulla recente scoperta chitina-mediata induzione di competenza naturale in questo organismo rappresentativo ⁶ e altri del genere Vibrio come V. fischeri ^7. Competenza naturale permette l'assunzione di DNA libero tra cui PCR generati frammenti di DNA. Una volta assunto, il DNA ricombina con il cromosoma data la presenza di un minimo di 250-500 bp fiancheggianti della regione omologa ^8. Compreso un marcatore di selezione in-tra le regioni a fianco permette la facile individuazione dei trasformanti frequenti. t "> Questo metodo può essere utilizzato per diverse manipolazioni genetiche V. cholerae e batteri naturalmente competenti potenzialmente anche altri. Forniamo tre esempi nuovi su ciò che può essere realizzato con questo metodo, oltre al nostro studio precedentemente pubblicato sul gene delezioni singole e la aggiunta di affinità-tag sequenze ^5. procedura di ottimizzazione in materia di protocollo iniziale di chitina-trasformazione indotta naturale ⁶ sono incorporati nel presente protocollo TransFLP., tra cui tra l'altro la sostituzione di frammenti di conchiglie granchio disponibile in commercio da chitina fiocchi ^8, la donazione di PCR derivato da DNA trasformante materiale ^9, e l'aggiunta di FLP-ricombinazione siti bersaglio (FRT) ^5. siti FRT consentono escissione sito-diretta del marcatore di selezione mediata dalla ricombinasi Flp ^10.

Protocollo

Il metodo TransFLP (Figura 1) è esemplificato da tre diversi approcci: I) la delezione di due geni adiacenti codificano determinanti di virulenza di V. cholerae (ad esempio, ΔctxAB), II), la rimozione di un'isola patogenicità (ad esempio, ΔVPI-1) e iii) l'integrazione di una sequenza polimerasi dipendente dal promotore T7 RNA monte di un gene d'interesse, che consente successivamente il suo espressione artificiale in background ceppo corrispondente (ad esempio, T7-TFox) (Figura 2).

1. Preparazione di fiocchi chitina

1. Peso 50-80 mg di fiocchi chitina in un tubo di plastica standard da 1,5 ml. Questo può essere preparato in bulk. Fiocchi di chitina sono disponibili in commercio da Sigma (cat. numero C9213).
2. Autoclavare i fiocchi mantenendo i coperchi dei tubi aperto.
3. Immediatamente chiudere i coperchi dopo l'autoclave si è raffreddato.
4. Conservare autoclavato chitina fiocchia temperatura ambiente.

2. Opzionale: trasformazione artificiale di V. cholerae con ricombinasi Flp-plasmide codificante

1. Preparare electrocompetent V. cellule cholerae utilizzando metodi standard ^11. Memorizzare aliquote di cellule competenti a -80 ° C.
2. Aggiungere 1-2 ml di un normale mini-preparazione del plasmide PBR-FLP ⁵ al electrocompetent V. cellule cholerae e trasferire il composto in una cuvetta elettroporazione (0,2 fessura cm).
3. Applicare un impulso a 1,6 kV.
4. Aggiungere 0,9 ml di terreno SOC, delicatamente trasferire cella a una standard 14 ml tubetto. Incubare non in movimento per 2,5 a 3 ore a 30 ° C.
5. Piastra 100 ul e 300 ul su piastre LB contenenti 100 pg / ml di ampicillina e incubare a 30 ° C per una notte.
6. Purificare singolo clone e negozio come stock in glicerolo per esperimenti TransFLP futuri.

3. Progettazione Oligonucleotide e Polymerase Chain Reaction

1. Almeno sei oligonucleotidi sono necessari per amplificare la regione di DNA (s) di interesse e l'FRT-fiancheggiato cassetta antibiotico mediante PCR (Figura 3). Si raccomanda di includere anche una coppia di oligonucleotidi innesco fuori del frammento inserito PCR. Ciò consente il controllo per l'integrazione e escissione corretta FRT-fiancheggiato cassette resistenza agli antibiotici (ad esempio raffigurato come 'chk-up' e 'chk-down' primer nelle figure 3 a 5).
2. Progettare gli oligonucleotidi # 2, # 3, # 4 e # 5 con cura. Essi dovrebbero essere in grado di ricottura sufficiente (ad es ~ 28 bp) al DNA stampo. Il DNA stampo il DNA genomico (gDNA) per i primer # 2 e # 5 e FRT-Kan-FRT-DNA plasmide contenente come pROD17 ¹² e pBR-FRT-KAN-FRT (questo studio) per i primer # 3 e # 4 ( Figura 3A).
3. Progettare i primer # 2 a # 5 che consente ampia base-accoppiamento alla loro 5'-end tra # 2 / # 3 e # 4 / # 5, rispettivamente (Figura 3A riquadro). Due cicli di PCR seguire.
4. Eseguire tre reazioni PCR indipendenti come un giro 1 ^° di PCR. Il primo sarà amplificare la regione a monte del gene / DNA regione d'interesse con l'ausilio di oligonucleotidi # 1 e # 2. La PCR dovrebbe risultare in un frammento di almeno 500 bp di lunghezza per consentire ricombinazione omologa all'interno delle cellule. Brevi frammenti (~ 250 bp) può essere sufficiente ⁸ ma non sono raccomandati.
5. Parallelamente effettuare la seconda PCR, che amplifica la cassetta FRT-fiancheggiata antibiotico. Per gli esempi forniti qui abbiamo usato principalmente aph (kan ^R). Oligonucleotidi uso # 3 e # 4 di questa reazione (Figura 3A).
6. Allo stesso tempo, amplificare la regione a valle del DNA mediante PCR (terzo campione). Il frammento PCR deve essere almeno 500 bp di lunghezza. Eseguire la PCR con gDNA come stampo e oligonucleotidi # 5 e # 6 (Figura 3A).
7. Dopo purificazione di tutti e tre PCRframmenti, eseguire il 2 ^turno di PCR. Usare una miscela uguale di tutti e tre i frammenti ottenuti al primo turno come template. L'amplificazione è catalizzata da oligonucleotidi # 1 e # 6. Il risultante frammento di PCR (Figura 3B) serve da trasformare DNA nell'esperimento trasformazione naturale (Figura 1).

4. La chitina-indotta trasformazione naturale

1. Grow V. cellule cholerae aerobiosi in terreno ricco a 30 ° C fino a raggiungere una densità ottica a 600 nm di circa 0,5.
2. Raccogliere i batteri mediante centrifugazione. Lavare pellet volta in mezzo artificiale definito (DASW ⁶⁾ prima di risospendere le cellule in 2 volumi di DASW. Aggiungere 1 ml di coltura a 50-80 mg di sterile fiocchi di chitina (spiegato al punto 1). Se i batteri porto plasmide pBR-FLP (opzionale punto 2), add ampicillina (50 pg / ml) alla cultura. Incubare a 30 ° C per 16-24 hr senza movimento.
3. Aggiungi & ge, 200 ng ^del II-tutto PCR derivato da due frammenti (indicato al punto 3). Mescolare con cura, evitando ampiamente staccare i batteri dalle superfici chitina. Incubare a 30 ° C per 24 ore senza movimento.
4. Vortex la cultura ampiamente per ≥ 30 sec. Stendere 100-300 microlitri su piastre di terreno selettivo LB (ad esempio gentamicina o kanamicina contenenti piastre LB per gli esempi forniti qui). Utilizzare doppio selettive piastre se i batteri ospitano il plasmide pBR-flp aggiungendo ampicillina concomitanza ad altri antibiotici. Incubare le piastre a 30 ° C per 16-24 ore o fino colonie sono visibili.
5. Isolare trasformanti singoli dalle piastre selettive. Tali trasformanti hanno sostituito il locus cromosomico originale dal frammento PCR a causa di un evento di crossover doppia. Questi ceppi possono essere direttamente utilizzati per ulteriori esperimenti nel caso la rimozione della cassetta antibiotico non è necessario.

5. Rimozione di cassetta selettivo (s) da Flp-Ricombinazione

1. Artificialmente trasformare i trasformanti con il plasmide PBR-flp come descritto al punto 2, se non ancora effettuato il test di trasformazione naturale.
2. Crescere i batteri su piastre di agar LB contenenti ampicillina a 37 ° C per 16-24 ore. Opzioni: consente di modificare la temperatura in mezzo per 2-3 ore a 40 ° C come espressione della FLP dal plasmide PBR-FLP è de-represso alle alte temperature; ^5,10 batteri trasferimento a piatti freschi dopo ca. 8 ore di incubazione.
3. Di prova per antibiotico-sensibilità (dimostrato qui per kanamicina, figura 1) da restreaking i cloni in parallelo su piastre di agar contenenti antibiotici e antibiotico-free. Isolare singole colonie sensibili. Congelare ampicillina-clone resistente come stock in glicerolo se si intende modificare ulteriormente la tensione con delezione altri / inserimento utilizzando TransFLP.

6. Polimerizzazione plasmide

1. Crescere la cultura durante la notte in condizioni aerobiche ea 30 ° C. Utilizzare terreno ricco senza l'aggiunta di qualsiasi antibiotico.
2. Opzionale: crescere coltura fresco per 3-6 ore diluendo il 1:100 notte cultura in fresco antibiotici terreno privo.
3. Piatto o striscia di diluizione (s) della cultura sulla piastra piana agar LB (s) e incubare a 30 ° C per 8-16 ore (fino a quando le colonie sono visibili).
4. Test per ampicillina sensibilità dei cloni restreaking dai cloni in parallelo su piastre di agar contenenti antibiotici e antibiotico-libera (figura 1). Congelare ampicillina sensibile ceppo stock in glicerolo.

Risultati

Risultati rappresentativi di tre esempi sono mostrati nelle figure 4 a 6. Il primo approccio volto a eliminare i geni vicini ctxA e ctxB. Insieme codificare il principale fattore di virulenza V. cholerae, tossina del colera. Abbiamo progettato oligonucleotidi per il metodo TransFLP come sopra descritto e secondo la figura 3. Il ceppo parentale, il ceppo intermedio ospitare la FRT-fiancheggiato cassetta antibiotico resistenza al locus DNA originale ctxAB

Discussione

Il metodo sopra descritto TransFLP e altrove ⁵ è stato ampiamente utilizzato nel nostro laboratorio. Il tipo di manipolazioni genetiche che sono fattibili includono tra gli altri: delezione di geni singoli e gruppi di geni, delezione di isole genomiche (es., VPI-1), l'inserimento di sequenze a monte di un gene di interesse (ad esempio, sequenze promotore) ed inserimento di sequenze alla fine di un gene specifico (ad esempio, codifica tag di affinità).

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Chitina fiocchi	Sigma	C9213	Sterilizzazione in autoclave necessaria
OPTIONAL: Micropulser (nel caso in cui cassetta antibiotica deve essere asportato da ricombinasi Flp codificati su PBR-FLP)	Biorad	165-2100	O electroporators comparabili