TransFLP - 유 전적으로 수정하는 방법<em&gt; 장염 cholerae</em&gt; 자연 변화와 FLP-재조합에 근거

요약

의 게놈을 수정하는 빠른 방법 V. cholerae이 설명되어 있습니다. 이 수정 한 유전자, 유전자 클러스터와 게놈 섬뿐만 아니라 짧은 시퀀스 (예 : 프로모터 요소 또는 선호도 태그 시퀀스)의 통합의 삭제가 포함되어 있습니다. 방법은 자연의 변화와 FLP-재조합에 기반을두고 있습니다.

초록

몇 가지 방법이 박테리아 염색체 ^1-3 조작 할 수 있습니다. 이러한 프로토콜의 대부분은 (예 : PIR에 따라 달라 나 온도에 민감한 replicons에게 ^1,2을 품고) 조건 replicative의 plasmids의 삽입에 의존하고 있습니다. 이러한 plasmids은 호몰 로지로 인한 재조합에 따라 세균​​ 염색체에 통합되어 있습니다. 이러한 insertional 돌연변이는 종종 직접 실험 설정에 사용됩니다. 또는 손실에 이어 플라스미드 절단에 대한 선택은 종종 sacB 유전자 ^넷으로 인코딩 된 카운터 선택 레반의 sucrase 효소에 의존 그람 음성 박테리아있는 수행 할 수 있습니다. 절단 중 하나 미리 삽입 유전자형 또는 염색체와 수정 된 유전자의 플라스미드 인코딩 복사본 사이의 교류의 결과를 복원 할 수 있습니다. 이 기법의 단점은 시간이 많이 걸리는 점입니다. 플라스미드는 먼저 복제 할 수 있습니다, 그것은 V.으로 수평 이동이 필요합니다 cholerae (대부분 N otably E.와 결합하여 대장균의 기증 부담) 또는 후자의 인공 변환 및 플라스미드의 절단은 임의입니다하거나 초기 유전자형을 복원하거나 더 긍정적 인 선택이 가해되지 않을 경우 원하는 수정을 만들 수 있습니다. 여기, 우리는 V.의 빠른 조작하기위한 방법을 제시 cholerae의 염색체 (들) ⁵ (그림 1). 이 TransFLP 방법은 같은 V.으로 속 장염의 유기체 ⁶ 다른 대표의 자연 능력의 최근에 발견 된 키틴로 인한 유도를 기반으로 fischeri ^7. 자연 능력은 PCR 생성 된 DNA 조각을 포함한 무료 DNA의 이해 할 수 있습니다. 일단 차지하고, DNA가 일치하는 지역 ^{8 측면을 노릴의} 250-500 BP의 최소의 존재 주어진 염색체와 recombines. 이러한 측면을 노릴 지역에서 중간 선택 마커를 포함하면 자주 발생 transformants을 쉽게 감지 할 수 있습니다. t는 ">이 방법은 V. cholerae의 다른 유전자 조작에 사용되며 잠재적으로 다른 자연적 능력이 박테리아 할 수 있습니다. 우리는 이전에 다음 ID로 출판 단일 유전자 삭제에 대한 연구와에 추가이 방법에 의해 수행 될 수있는 세 개 소설 예제를 제공합니다 연관성 태그 시퀀스 ⁵ 추가가. 키틴 유발 자연 변화 ^6의 초기 프로토콜에 관한 몇 가지 최적화 단계는이 TransFLP 프로토콜에 통합되어 있습니다.이 다른 사람들 사이에 상업적으로 이용 가능한 키틴 조각 ^8, PCR의 기부에 의한 게 껍질 조각의 교체를 포함 자료 ^9, FLP - 재결합 대상 사이트 (FRT) ^5의 추가를 변형 등의 파생 DNA. FRT 사이트는 Flp recombinase ^(10)에 의해 중재 선택 마커의 사이트 감독 절단 할 수 있습니다.

프로토콜

TransFLP 방법 (그림 1)은 세 가지 다른 방법으로 예시되어 있습니다 : I) V.의 독성의 determinants를 인코딩 두 개의 인접한 유전자의 삭제 cholerae (예를 들어, ΔctxAB), II) pathogenicity 섬 (예 : ΔVPI-1)의 제거 및 III) T7 RNA의 효소에 의존 발기인 시퀀스의 통합은 업스트림 유전자 수준의 관심, 이후 수의 각각의 변형을 배경으로 인공 표현 (예를 들어, T7-tfoX) (그림 2).

1. 키틴 플레이크의 작성

1. 표준 1.5 ML 플라스틱 관 키틴 조각의 무게 50-80 밀리그램. 이것은 대량으로 준비 할 수 있습니다. 키틴 조각은 시그마 (cat. 번호 C9213)에서 상업적으로 이용할 수 있습니다.
2. 관의 뚜껑이 열려 유지 그 조각을 압력솥.
3. 압력솥이 냉각 된 후 즉시 뚜껑을 닫습니다.
4. 스토어 autoclaved 키틴 조각상온에서.

2. 선택 사항 : V.의 인공 변환 Flp Recombinase 인코딩 플라스미드로 cholerae

1. electrocompetent 준비 V. 표준 방법가 ^11를 사용하여 cholerae 세포. -80에서 관할 세포의 aliquots를 저장 ° C.
2. electrocompetent에 플라스미드 PBR-flp ⁵ 일반 미니 준비 1-2 μl를 추가 V. cholerae 세포와는 electroporation 큐벳 (0.2 cm 간격 폭)에 혼합물을 전송합니다.
3. 1.6 KV에서 펄스을 적용합니다.
4. 0.9 ML SOC 매체를 추가 부드럽게 표준 14 ML 튜브에 세포를 전송할 수 있습니다. 30에서 2.5-3 시간에 대한 비 이동 품다 ° C.
5. 판 100 μl와 30 ° C 하룻밤 100 μg / ML 암피실린 및 배양을 포함하는 LB 플레이트에 300 μl.
6. 미래 TransFLP 실험을위한 글리세롤 주식 등의 단일 클론과 상점을 정화.

3. Oligonucleotide 설계 및 중합 효소 연쇄 반응

1. 최소 6 oligonucleotides는 관심의 DNA 영역 (들)뿐만 아니라 PCR에 의한 FRT-둘러싸인 항생제 카세트를 (그림 3) 증폭 할 필요가 있습니다. 또한 삽입 된 PCR 조각 이외의 oligonucleotides의 프라이밍 한 쌍을 포함하는 것이 좋습니다. 이 통합 및 FRT-둘러싸인 항생제 저항 카세트 (예 : 그림 3-5의 '확인해 업'과 '해봐 다운'프리 머으로 묘사)의 정확한 절단을 확인 할 수 있습니다.
2. oligonucleotides # 2, # 3, # 4, # 5주의를 디자인합니다. 그들은 충분히 템플릿 DNA에 (예를 들면 ~ 28 BP) 단련 할 수 있어야합니다. 템플릿 DNA는 프리 머에 대한 게놈 DNA (gDNA) 등 pROD17 ¹² PBR-FRT 관 - FRT (본 연구) 프리 머에 대한 # 3와 # 4 (등 # 2와 # 5 FRT - 칸 FRT - 포함 플라스미드 DNA입니다 그림 3A).
3. 수 # 5 프리 머에게 # 2 디자인을 각각 # 2 / # 3와 # 4 / # 5 사이의 5'-끝에서베이스 페어링 다양한 (그림 3A 삽입). PCR의 두 발은 다음과 같습니다.
4. PCR의 ^{1 라운드} 3 개 독립 PCR 반응을 수행합니다. 첫번째 oligonucleotides # 1과 # 2의 도움을 유전자 / DNA 지역 수준의 관심 상류 지역을 증폭됩니다. PCR은 세포 내에서 상동 재조합을 허용하는 길이 최소 500 BP의 조각 될 것입니다. 짧은 조각 (~ 250 BP)은 충분한 ^팔 수 있지만 권장되지 않습니다.
5. 병렬로 FRT-둘러싸인 항생제 카세트를 증폭 두 번째 PCR을 수행합니다. 예제는 여기에 제공을 위해 주로 aph (관 ^R)를 사용했습니다. 사용 oligonucleotides이 반응 (그림 3A)에 # 3와 # 4.
6. Concomitantly, PCR (3 샘플)로부터 하류 DNA 지역을 증폭. PCR 조각은 길이가 적어도 500 BP해야합니다. 템플릿 및 oligonucleotides # ​​5와 # 6 (그림 3A)과 같은 gDNA로 PCR을 수행합니다.
7. 세 PCR의 정화 후조각은 PCR의 2 ^차 라운드를 수행합니다. 템플릿으로 첫 라운드에서 얻은 세 조각 같은 혼합을 사​​용합니다. 증폭은 oligonucleotides # 1과 # 6 촉매 있습니다. 그 결과 PCR 조각 (그림 3B)는 자연 변화 실험 (그림 1)에서 DNA를 변형 역할을합니다.

4. 키틴 유발 자연 변화

1. 성장 V. 30에서 풍부한 미디어에서 aerobically cholerae 세포 ° C는 약 0.5의 600 nm의에서 광학 밀도에 도달 할 때까지.
2. 원심 분리하여 박테리아를 수확. DASW 2 권에있는 셀을 resuspending하기 전에 정의 인공 매체 (DASW ^6)에 한 번 펠렛을 씻으십시오. 멸균 키틴 조각 (지점 1 아래에 설명)의 50-80 MG에 문화의 1 ML을 추가합니다. 문화 경우 세균 항구 플라스미드 PBR-flp (선택 사항 점 2), 추가 암피실린 (50 μg / ML). 운동없이 16-24 시간에 30 ° C에서 알을 품다.
3. g 추가 (& A)전자, 2 ^차 라운드 PCR-파생 조각 (지점 3에서 설명) 200 것이다. 광범위하게 키틴 표면에서 박테리아를 분리하지 않고 조심스럽게 섞는다. 운동없이 24 시간을위한 30 ° C에서 알을 품다.
4. ≥ 30 초에 광범위하게 소용돌이 문화입니다. 선택 LB 매체 플레이트 (여기에 제공된 예제에 대한 예를 kanamycin 또는 gentamicin 함유 LB 플레이트)에 100-300 μl를 벌리고. 박테리아가 다른 항생제 concomitantly 암피실린을 추가하여 PBR-flp 플라스미드을 가지고 있고, 경우에 두 번 선택 접시를 사용합니다. 16-24 시간에 30 ° C에서 번호판을 길러 나 식민지가 표시 될 때까지.
5. 선택적 판에서 단일 transformants를 분리합니다. 이러한 transformants는 더블 크로스 오버 이벤트로 인해 PCR 조각하여 원본 염색체 궤적을 대체하고 있습니다. 항생제 카세트의 제거가 필요하지 않습니다 경우에 이러한 변종을 직접 추가 실험을 위해 사용될 수 있습니다.

5. Flp의 선택적 카세트의 제거 (들)- 재조합

1. 자연 변형 분석 해본하지 않을 경우 지점이 아래에 설명 된대로 인공 PBR-flp 플라스미드를 사용하여 transformants을 변환 할 수 있습니다.
2. 16-24 시간에 37 ° C에서 암피실린을 포함하는 LB 한천 플레이트에 박테리아를 성장. 옵션 : 40 2-3 시간에 대한 사이의 온도를 변경 ° C 플라스미드 PBR-flp에서 flp의 표현으로 높은 기온 ^5,10에 드 억압되어, 약 한 후 새로운 접시로 전송 세균. 부화 8 시간.
3. 항생제 함유하고 항생제 무료 한천 플레이트에 병렬로 클론을 restreaking하여, 항생제 - 감도 (그림 1 kanamycin 여기를 시연)을 테스트합니다. 하나의 중요한 식민지를 분리합니다. 당신이 더 다른 삭제 / TransFLP를 사용하여 삽입과 변형을 수정하고자하는 경우 글리세롤 주식 등의 암피실린 방지 복제를 고정.

6. 플라스미드 경화

1. 에어로빅 조건에서 하루 아침에 문화를 성장하고30의 ° C. 모든 항생제의 추가없이 다양한 매체를 사용하십시오.
2. 선택 사항 : 신선한 항생제없는 미디어의 밤 문화 1:100을 diluting하여 3-6 시간에 신선한 문화를 성장.
3. 판이나 연속으로 일반 LB 한천 플레이트 (들)에 문화의 희석 (들)과 30에서 배양 ° 8-16 시간에 대한 C (식민지을 볼 때까지).
4. 항생제 함유하고 항생제 무료 한천 플레이트 (그림 1)에 병렬로 클론을 restreaking하여 클론 암피실린 감도를 테스트합니다. 글리세롤 주식 등의 암피실린에 민감한 부담을 멈춰 봐.

결과

세 가지 예 대표 결과는 6도 4에 표시됩니다. 첫 번째 접근 방식은 이웃 한 유전자에게 ctxA과 ctxB을 삭제하기위한. 이들은 V.의 주요 독성 계수를 인코딩 cholerae, 콜레라 독소. 위에서 설명한 3 그림에 따라 우리는 TransFLP 방법에 대한 oligonucleotides를 설계했습니다. 부모의 변형은 ctxAB의 원래 DNA의 궤적과 ctxAB에 대한 삭제 저항 카세트의 해제 ...

토론

TransFLP 방법은 ⁵ 광범위하게 저희 연구실에서 사용 된 이상, 다른 곳에서 설명했다. 가능한 아르 유전자 조작의 종류는 다른 이들과 같습니다 : 하나의 유전자 및 유전자 클러스터의 삭제, 게놈 섬의 삭제 (예 : VPI-1) 관심 유전자 (예를 들어, 발기인 시퀀스)의 상류 시퀀스의 삽입과 삽입을 특정 유전자 (예를 들어, 인코딩 연관성 태그)의 끝 부분에 시퀀스.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
키틴 조각	시그마	C9213	필요 Autoclaving
선택 사항 : Micropulser (경우에 항생제 카세트는 PBR-flp에 인코딩 Flp의 recombinase에 의해 excised 수 있습니다)	Biorad	165-2100	또는 비교 electroporators