TransFLP - 遺伝的に変更する方法<em&gt;コレラ菌</em&gt;自然形質転換およびFLP組換えに基づき

要約

のゲノムを変更するための簡単​​な方法 V。コレラ記載されている。これらの変更は、単一の遺伝子、遺伝子クラスターおよびゲノムの島だけでなく、短い配列（例えばプロモーターエレメントまたはアフィニティータグ配列）の統合の削除があります。方法は自然形質転換およびFLP組換えに基づいています。

要約

いくつかの方法は^1-3細菌の染色体を操作することが可能です。これらのプロトコルの大部分は、条件付きで複製プラスミドの挿入^（1,2 PIR依存または温度感受性レプリコンを宿すなど ）に依存しています。これらのプラスミドは、相同性媒介組換えに基づく細菌染色体に組み込まれています。このような挿入変異体はしばしば直接実験の設定に使用されています。あるいはまた、その損失が続くプラスミド切除の選択はしばしばsacB遺伝子⁴でエンコードされたカウンターで選択レバンスクラーゼの酵素に依存しているグラム陰性細菌に、これを行うことができます。切除は、事前挿入遺伝子型または染色体と改変された遺伝子のプラスミドにコードされたコピーの間の交流の結果を復元することができます。この手法の欠点は、時間がかかるということです。プラスミドは、最初にクローンする必要があり、それは Vへの水平転送を必要とするコレラ菌 （最大n otably E.との交配によって大腸菌ドナー株）または後者の人工変換、およびプラスミドの切除は、ランダムであり、どちらかの初期遺伝子型を復元するか、正の選択が発揮されていない場合、必要な変更を作成することができます。ここでは、Vの迅速な操作のための方法を提示するコレラ菌染色体^（S）5（ 図1）。このTransFLP法はこの生物^6、などVのビブリオ属の他の代表の天然能力の最近発見されたキチン質を介した誘導に基づくシャリ ^7。自然な能力は、PCRによって生成されたDNA断片を含む自由なDNAの取り込みを可能にします。一度取り上げ、染色体とDNAの再結合は、相同領域^8に隣接^するの250から500 bpの最小値の存在を与えられた。これらの隣接領域の中間の選択マーカーを含めることは頻繁に発生した形質転換体を容易に検出することができます。 tは">このメソッドはコレラ菌の異なる遺伝子操作のために使用され、潜在的にも他の天然有能なバクテリアすることができます我々は、以前に公開された単一遺伝子欠失の研究とに加えて、この方法によって達成することができるものに3小説の例を提供アフィニティータグ配列^5。キチン誘発自然変換⁶の初期のプロトコルに関しては、いくつかの最適化のステップはこのTransFLPプロトコルに組み込まれているのに加え、これらは他の市販のキチンフレーク^8、PCRの寄付によってカニ殻断片の交換中に含める由来の材料^9の変換など、DNA、およびFLP組換え標的部位の付加^{（FRT）5。FRT}部位は、FLPリコンビナーゼ¹⁰によって媒介される選択マーカーの部位特異的切除を可能にします。

プロトコル

TransFLP法（ 図1）は、3つの異なるアプローチが例示される：I）Vの病原性決定因子をコードする2つの隣接した遺伝子の欠失コレラ菌 （ 例えば 、ΔctxAB）、病原性島のⅡ）除去（ 例えば 、ΔVPI-1）、およびその後にそのを可能にする目的遺伝子の上流にT7 RNAポリメラーゼ依存性のプロモーター配列のIII）の統合それぞれのひずみ背景に人工的な発現（ 例えば、T7-tfoX）（ 図2）。

1。キチンフレークの調製

1. 標準1.5mlのプラスチックチューブでキチンフレークの重量50から80ミリグラム。これは大量に調製することができます。キチンフレークは、Sigma（カタログ番号C9213）から市販されている。
2. チューブの蓋が開いたままのフレークをオートクレーブ。
3. オートクレーブを冷却した後、直ちに蓋を閉じます。
4. ストアオートクレーブ処理キチンフレーク室温で。

2。オプション：Vの人工変換FLPリコンビナーゼをコードするプラスミドでコレラ

1. エレクトロ準備V.標準的な方法^11を用い^て 菌の細胞。 -80℃でコンピテント細胞のアリコート℃で保存
2. エレクトロにプラスミドpBR-FLP ⁵のレギュラーミニ準備中1-2μlを加えV.コレラ菌は、細胞およびエレクトロポレーションキュベット（0.2 cm商品のギャップ幅）に混合物を移す。
3. 1.6 kVでパルスを印加します。
4. 0.9ミリリットルのSOC培地を加え、穏やかに、標準の14 mlチューブに細胞を移す。 30℃で2.5から3時間にわたり非移動インキュベート℃に
5. プレートを100μl、30℃で一晩100μg/ mlのアンピシリンとインキュベートを含むLBプレート上に300μlの。
6. 将来TransFLP実験のグリセロールストックのような単一のクローンや店舗を精製する。

3。オリゴヌクレオチドの設計およびポリメラーゼ連鎖反応

1. 少なくとも6つのオリゴヌクレオチドは、目的とするDNA領域（複数可）と同様にPCRによりFRT-挟まれた抗生物質カセット（ 図3）を増幅する必要があります。また、挿入されたPCR断片外オリゴヌクレオチドプライミングのペアを含めることをお勧めします。これは、統合とFRT-挟ま抗生物質耐性カセット（ 例えば 図3〜図5に'CHKアップ'と'CHKダウン'プライマーとして描かれている）の正確な切除をチェックすることができます。
2. オリゴヌクレオチド＃2、＃3、＃4、＃5の注意を払って設計を行ってください。彼らは十分に鋳型DNAに（ 例えば 〜28 bp）をアニールすることができるはずです。テンプレートDNA、プライマー＃2と＃5などpROD17 ¹²及びプライマー＃3と＃4のPBR-FRT-KAN-FRT（本研究）（としてFRT-カンイFRT含有プラスミドDNAのゲノムDNA（gDNA）です図3A）。
3. （それぞれ、＃2 /＃3、＃4 /＃5の間にそれらの5 '末端の塩基対広範図3Aを許可＃5＃2プライマーを設計 [挿入図）。 PCR法の2つのラウンドが続きます。
4. PCRの第^{1ラウンド}として3独立したPCR反応を行う。最初のものは、オリゴヌクレオチド＃1と＃2を用いて遺伝子/ DNA関心領域の上流領域を増幅する。 PCR法は、細胞内での相同組換えを可能にするために、長さが少なくとも500bpの断片をもたらすべきである。短い断片（約250 bp）は⁸で十分できますが、推奨されていません。
5. 並列にFRT-挟ま抗生物質カセットを増幅する第2のPCRを行う。例はここで提供されるために私達は主にAPH（館 ^R）を使用しました。この反応（ 図3A）のためのオリゴヌクレオチド＃3と＃4を使用します。
6. 付随して、PCR法（第三のサンプル）によって下流のDNA領域を増幅する。 PCR断片はまた、長さが少なくとも500bpである必要があります。テンプレートおよびオリゴヌクレオチド＃5と＃6（ 図3A）にgDNAを用いてPCRを行う。
7. すべての3つのPCR産物の精製後断片は、PCRの第²ラウンド^を行う。テンプレートとして、最初のラウンドで得られたすべての3つの断片の等量混合物を使用しています。増幅は、オリゴヌクレオチド＃1と＃6によって触媒される。得られたPCR断片（ 図3B）は、自然形質転換実験（ 図1）でDNAを変換として機能します。

4。キチン誘起自然形質転換

1. 成長V. 30℃における富栄養培地で好気的にコレラ菌は、細胞は、約0.5の600nmでの光学密度に達するまで。
2. 遠心分離により菌体を回収します。 DASW 2容量の中に細胞を再懸濁する前に、一度定義する人工培地（DASW ^6）でペレットを洗浄します。無菌キチンフレーク（ポイント1で説明）の50〜80 mgの培養液1 mlを加える。文化への細菌港プラスミドpBR-FLP（オプション2点）、ADDアンピシリン（50μg/ ml）の場合。運動せずに16から24時間30℃でインキュベートする。
3. G＆追加eであり、第²回目のPCR由来断片（ポイント3で説明）は200 ng。広くキチン表面から細菌を切り離さずに慎重に混ぜる。運動なしで24時間30℃でインキュベートする。
4. 渦≥30秒広く文化。選択LB培地プレート（ここで提供される例については、 例えばカナマイシン、ゲンタマイシン含有LBプレート）上に100から300μlを広げた。細菌は他の抗生物質に付随してアンピシリンを追加することにより、PBR-FLPプラスミドを抱いている場合、ダブル選択プレートを使用しています。 16から24時間30℃でプレートをインキュベートするか、コロニーが見えるようになるまで。
5. 選択プレートから単一の形質転換体を単離する。このような形質転換体は、ダブルクロスオーバーイベントによるPCR断片によってオリジナルの染色体座を交換しました。抗生物質カセットを取り外す必要はありません場合にはこれらの株は直接さらなる実験のために使用することができます。

5。 FLPによる選択カセットの除去（複数可）組換え

1. 自然形質転換試験の前に行われていない場合、ポイント2で説明したように人為的にPBR-FLPプラスミドを使って形質転換体を変換する。
2. 16から24時間37℃でアンピシリンを含むLB寒天プレート上で細菌を培養。オプション：40に2〜3時間の間に温度を変更℃のプラスミドpBR-FLPからFLPの表現として、より高い温度での^5,10 -デ抑制され、約後に新鮮なプレートへの転送細菌。インキュベーションの8時間。
3. 抗生物質含有および抗生物質を含まない寒天プレート上で並行してクローンをrestreakingによって、抗生物質感受性（ 図1カナマイシンにはここを実証）のテスト。シングル感受性コロニーを分離します。あなたはさらにTransFLPを使用して他の削除/挿入した株を変更する場合はグリセロールストックとしてアンピシリン耐性クローンをフリーズします。

6。プラスミドキュア

1. 好気的条件下で一晩培養すると30℃どんな抗生物質を添加することなくリッチな培地を使用しています。
2. オプション：新鮮な抗生物質を含まない培地で一晩培養した培養液の1:100希釈することにより、3から6時間、新鮮な培養する。
3. 板やスジ平野LB寒天プレート（S）で文化の希釈（s）および30℃にて8月16日時間のためのC（コロニーが見えるようになるまで）。
4. 抗生物質含有および抗生物質を含まない寒天プレート（ 図1）上で並行してクローンをrestreakingによるクローンのアンピシリン感受性をテストします。グリセロールストックとしてアンピシリン感受性株をフリーズします。

結果

3例の代表的な結果を6〜図4に示されている。隣接する遺伝子ctxAとctxBを削除することを目的と最初のアプローチ。彼らは一緒にVの主要な病原因子をエンコードするコレラ菌 、コレラ毒素。我々は、上記のようにTransFLPメソッドのオリゴヌクレオチドを設計し、 図3を参照に記載の方法。親株は、ctxABの元のDNA遺伝子座のFRT-挟ま...

ディスカッション

TransFLP方法は、上述の他の場所と^5は広く、我々の研究室で使われてきました。実現可能である遺伝子操作の種類は、とりわけ以下のとおり、単一の遺伝子や遺伝子群の欠失、ゲノムの島々の欠失（ 例えば 、VPI-1）は、目的の遺伝子の上流配列の挿入（ 例えば 、プロモーター配列）と挿入を特定の遺伝子（ 例えば 、符号化アフィニティータグ）の末尾のシーケ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号	注釈
キチンフレーク	シグマ	C9213	必要なオートクレーブ
オプション：Micropulser場合（抗生物質カセットはPBR-FLP上にエンコードFlpリコンビナーゼによって切除されるべきである）	バイオラッド	165-2100	または同等のエレクトロポ