TransFLP - Un método para modificar genéticamente<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Sobre la base de la transformación natural y la recombinación FLP

Resumen

Un método rápido para modificar el genoma de V. cholerae Se describe. Estas modificaciones incluyen la supresión de los genes individuales, grupos de genes y las islas genómicas, así como la integración de secuencias cortas (por ejemplo, elementos promotores o secuencias de etiqueta de afinidad-). El método se basa en la transformación natural y recombinación FLP-.

Resumen

Hay varios métodos disponibles para manipular los cromosomas bacterianos ^1-3. La mayoría de estos protocolos se basan en la inserción de plásmidos replicativos condicionalmente (por ejemplo, albergar replicones pir-dependientes o sensibles a la temperatura ^1,2). Estos plásmidos se integran en los cromosomas bacterianos basado en la recombinación mediada por homología. Tales mutantes de inserción son a menudo utilizados directamente en la configuración experimental. Alternativamente, la selección para la escisión del plásmido seguido por su pérdida puede ser realizado, para que las bacterias Gram negativas a menudo se basa en la enzima sacarasa contraseleccionable levano codificada por el gen sacB ^4. La escisión puede restaurar el genotipo pre-inserción o resultado en un intercambio entre el cromosoma y la copia codificada por plásmidos del gen modificado. Una desventaja de esta técnica es que requiere mucho tiempo. El plásmido tiene que ser clonado primero, que requiere la transferencia horizontal en V. cholerae más (n otably en el apareamiento con una E. coli cepa donante) o transformación artificial de este último, y la escisión del plásmido es aleatoria y puede restaurar el genotipo inicial o crear la modificación deseada si no hay selección positiva se ejerce. Aquí, se presenta un método para la manipulación rápida de la V. cholerae cromosoma (s) ⁵ (Figura 1). Este método se basa en TransFLP el recientemente descubierto quitina mediada por la inducción de competencia natural en este organismo representante ⁶ y otro del género Vibrio, como V. fischeri ^7. Competencia natural permite la captación de ADN libre incluyendo fragmentos de ADN generados por PCR. Una vez absorbido, el ADN se recombina con el cromosoma dada la presencia de un mínimo de 250-500 pb de la región homóloga flanqueante ^8. Incluyendo un marcador de selección en-entre estas regiones flanqueantes permite la fácil detección de los transformantes que ocurren con frecuencia. t "> Este método se puede utilizar para diferentes manipulaciones genéticas de V. cholerae y bacterias naturalmente competentes también potencialmente otros. Proporcionamos tres ejemplos novedosos en lo que puede lograrse por este método, además de nuestro estudio publicado anteriormente sobre las supresiones de genes individuales y el Además de las secuencias de etiqueta de ^afinidad-5. Varios pasos de optimización sobre el protocolo inicial de quitina inducida por transformación natural ⁶ se incorporan en este protocolo TransFLP. Estos incluyen entre otros la sustitución de fragmentos de conchas de cangrejo por comercialmente disponible quitina copos ^8, la donación de PCR derivado de ADN como la transformación de material ^9, y la adición de sitios diana de recombinación FLP-(FRT) ^5. sitios FRT permitir la escisión dirigida a sitio del marcador de selección mediada por la recombinasa Flp ^10.

Protocolo

El método TransFLP (Figura 1) se ejemplifica mediante tres enfoques diferentes: i) la deleción de dos genes adyacentes que codifican los determinantes de virulencia de V. cholerae (por ejemplo, ΔctxAB), II) la extracción de una isla de patogenicidad (por ejemplo, ΔVPI-1), y III) la integración de una secuencia de T7 RNA polimerasa dependiente de promotor aguas arriba de un gen de interés, lo que permite posteriormente su artificial expresión en la cepa de fondo respectivo (por ejemplo, T7-tfox) (Figura 2).

1. Preparación de Copos de quitina

1. Peso 50-80 mg de copos de quitina en un tubo de plástico estándar de 1,5 ml. Este puede ser preparado en grandes cantidades. Copos de quitina están disponibles comercialmente de Sigma (número cat. C9213).
2. Autoclave los copos de mantenimiento de las tapas de los tubos abiertos.
3. Inmediatamente después de cerrar las tapas de la autoclave se ha enfriado.
4. Tienda autoclave quitina escamasa temperatura ambiente.

2. Opcional: Transformación artificial de V. cholerae con Flp recombinasa plásmido que codifica

1. Preparar electrocompetentes V. cholerae células utilizando métodos estándar ^11. La tienda de alícuotas de células competentes a -80 ° C.
2. Añadir 1-2 l de una normal de mini-preparación de plásmido pBR-flp ⁵ a la electrocompetentes V. células cholerae y transferir la mezcla en una cubeta de electroporación (0,2 cm ancho hueco).
3. Aplicar un pulso a 1,6 kV.
4. Añadir 0,9 ml de medio SOC, suavemente la transferencia de células a un tubo estándar de 14 ml. Incubar que no se mueve durante 2,5 a 3 horas a 30 ° C.
5. Placa de 100 l y 300 l en placas de LB que contenían 100 ug / ml de ampicilina y se incuba a 30 ° C durante la noche.
6. Purificar solo clon y almacena como reserva de glicerol para experimentos TransFLP futuras.

3. Diseño de oligonucleótidos y reacción en cadena de la polimerasa

1. Al menos seis oligonucleótidos se requieren para amplificar la región de ADN (s) de interés, así como el casete FRT-flanqueado antibiótico por PCR (Figura 3). Se recomienda incluir también un par de oligonucleótidos de cebado fuera del fragmento de PCR insertado. Esto permite la comprobación de la integración y la escisión correcta de la casete de resistencia a FRT-flanqueado antibiótico (por ejemplo, representado como 'chk-up' y cebadores 'chk hacia abajo "en las figuras 3 a 5).
2. Diseñar los oligonucleótidos # 2, # 3, # 4, # 5 y con cuidado. Ellos deben ser capaces de hibridarse suficientemente (por ejemplo, ~ 28 pb) a la plantilla de ADN. La plantilla de ADN es ADN genómico (gDNA) para los cebadores # 2 y # 5 y FRT-Kan-FRT-que contiene ADN plásmido tal como pROD17 ¹² y pBR-FRT-KAN FRT-(este estudio) para los cebadores # 3 y # 4 ( Figura 3A).
3. Diseño de los cebadores # 2 al # 5 que permite una amplia base-apareamiento en su extremo 5 'entre el # 2 / # 3 y # 4 / # 5, respectivamente (Figura 3A recuadro). Dos rondas de PCR seguir.
4. Realizar tres reacciones de PCR independientes como 1 ^ª ronda de PCR. El primero será amplificar la región corriente arriba del gen / ADN de la región de interés con la ayuda de oligonucleótidos # 1 y # 2. La PCR debería resultar en un fragmento de al menos 500 pb de longitud para permitir la recombinación homóloga dentro de las células. Fragmentos más cortos (~ 250 pb) puede ser suficiente ⁸ pero no se recomiendan.
5. En paralelo realizar la segunda PCR, que amplifica el casete FRT-flanqueado antibiótico. Para los ejemplos que aquí se utiliza principalmente aph (kan ^R). Uso oligonucleótidos # 3 y # 4 para esta reacción (Figura 3A).
6. Al mismo tiempo, amplificar la región de ADN corriente abajo por PCR (tercera muestra). El fragmento de PCR también debe ser de al menos 500 pb de longitud. Realizar la PCR con gDNA como molde y los oligonucleótidos # 5 y # 6 (Figura 3A).
7. Después de la purificación de todos PCR tresfragmentos, lleve a cabo la 2 ^ª ronda de PCR. Usar una mezcla igual de los tres fragmentos obtenidos en la primera ronda como molde. La amplificación es catalizada por los oligonucleótidos # 1 y # 6. El fragmento resultante de PCR (Figura 3B) sirve como la transformación de ADN en el experimento de transformación natural (Figura 1).

4. La quitina inducida por transformación natural

1. Crecer V. células cholerae aeróbicamente en medio rico a 30 º C hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nm de aproximadamente 0,5.
2. Cosechar las bacterias por centrifugación. Lavar la pella una vez en medio artificial definido (DASW ⁶⁾ antes de resuspender las células en 2 volúmenes de DASW. Añadir 1 ml de cultivo a 50-80 mg de escamas estéril quitina (como se explica en el punto 1). Si las bacterias puerto plásmido pBR-flp (opcional punto 2), añadir ampicilina (50 mg / ml) a la cultura. Incubar a 30 ° C durante 16-24 h sin movimiento.
3. Añadir & ge; 200 ng de la 2 ^ª ronda de PCR fragmento derivado (que se explica en el punto 3). Mezclar cuidadosamente sin ampliamente separar las bacterias de las superficies de quitina. Incubar a 30 ° C durante 24 horas sin movimiento.
4. Vortex la cultura extensamente durante ≥ 30 segundos. Corre 100-300 l selectivos en placas de LB medio (por ejemplo, kanamicina o gentamicina que contienen placas de LB ejemplos proporcionados aquí). El uso de dos placas selectivas si las bacterias albergar el plásmido pBR-flp añadiendo ampicilina concomitantemente a los otros antibióticos. Incubar las placas a 30 ° C durante 16-24 horas o hasta que las colonias son visibles.
5. Aislar transformantes individuales de placas selectivas. Tales transformantes han sustituido el locus cromosómico original por el fragmento de PCR debido a un evento de doble entrecruzamiento. Estas cepas se pueden usar directamente para experimentos adicionales en caso de que la eliminación de la casete de antibiótico no es necesario.

5. La eliminación selectiva de casete (s) por Flp-Recombinación

1. Artificialmente transformar sus transformantes con el plásmido pBR-flp como se describe en el punto 2 si no se hace antes de que el ensayo de transformación natural.
2. Cultivar las bacterias en placas de agar LB que contenían ampicilina a 37 ° C durante 16-24 h. Opciones: cambiar la temperatura entre el 2-3 hr a 40 ° C, según la expresión de FLP del plásmido pBR-flp se de-reprimidos a altas temperaturas; ^5,10 bacterias de transferencia a placas frescas después de aprox. 8 horas de incubación.
3. Prueba de sensibilidad a los antibióticos (demostrada aquí para kanamicina; Figura 1) por restreaking los clones en paralelo sobre placas de agar que contienen antibiótico ni antibióticos. Aislar colonias individuales sensibles. Congelar clon resistente a la ampicilina como la acción del glicerol si tiene intención de modificar aún más la tensión con supresión otro / inserción con TransFLP.

6. Curado del plásmido

1. Cultive hasta el día bajo condiciones aeróbicas ya 30 º C. Usar medio rico sin la adición de ningún antibiótico.
2. Opcional: Crecer cultivo fresco por 3-6 horas por dilución de 1:100 del cultivo de una noche fresca en medio libre de antibióticos.
3. Placa o estría de dilución (s) de cultivo en placa de agar LB sin formato (s) e incubar a 30 ° C durante 8-16 h (hasta que las colonias son visibles).
4. Prueba de sensibilidad a la ampicilina de los clones por restreaking los clones en paralelo sobre placas de agar que contienen antibióticos y libre de antibióticos-(Figura 1). Congelar ampicilina cepa sensible como la acción del glicerol.

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Resultados

Los resultados representativos de los tres ejemplos que se muestran en las Figuras 4 a 6. El primer enfoque dirigido a eliminar los genes vecinos ctxA y ctxB. Juntos codifican el factor de virulencia de V. cholerae, la toxina del cólera. Hemos diseñado oligonucleótidos para el método TransFLP como se ha descrito anteriormente y según la figura 3. La cepa parental, la cepa intermedia albergar el casete FRT-flanqueado resistencia a los antibióticos en el l...

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Discusión

El método TransFLP descrito anteriormente y en otros lugares ⁵ ha sido ampliamente utilizado en nuestro laboratorio. El tipo de manipulaciones genéticas que son factibles incluyen, entre otros: la supresión de los genes individuales y grupos de genes, la supresión de las islas genómicas (por ejemplo, VPI-1), la inserción de secuencias de aguas arriba de un gen de interés (por ejemplo, secuencias de promotor) y la inserción de secuencias en el extremo de un gen específico (por ej...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
La quitina escamas	Sigma	C9213	Autoclave necesario
OPCIONAL: Micropulser (en caso de casete antibiótico debe ser extirpado por recombinasa Flp codificada en pBR-flp)	Biorad	165-2100	O electroporators comparables