TransFLP - A基因修改方法<em&gt;霍乱弧菌</em基于自然转化和FLP重组

摘要

一个快速的方法来修改的基因组 V.霍乱进行说明。这些修改包括删除单个基因，基因簇和基因组岛屿以及集成的短序列（如启动子元件或亲和标签序列）。该方法是基于对自然的改造和FLP重组。

摘要

有几种方法可用来操纵细菌染色体^1-3。这些协议大多依靠的条件复制型质粒插入（ 例如 PIR依赖或对温度敏感的复制窝藏^1,2）。这些质粒基于同源性的介导的重组整合到细菌染色体中。这样的插入突变体往往直接用于实验的设置。可替换地，可以进行选择质粒切除后跟其损失为革兰氏阴性菌，往往依赖于计数器可选择的果聚糖蔗糖酶的酶编码的sacB基因的 ^4。的切除可以恢复的插入前的基因型或在经修饰的基因的染色体和质粒编码的副本之间的交换的结果。这种技术的一个缺点是，它是耗时的。首先被克隆的质粒，它需要五的水平转移到霍乱 （最多n个 otably通过交配与E.大肠杆菌供体菌株）或人工转变后者;和切除该质粒是随机的，可以恢复初始的基因型或创建所需的修改，如果没有施加正选择的。在这里，我们提出了一个方法，为快速操作的五霍乱弧菌染色体^（）5（ 图1）。此TransFLP方法是基于最近发现的几丁质的自然能力介导的诱导在此有机体⁶和其他五，如弧菌属代表鲵 ^7。自然能力允许的游离DNA的摄取，包括PCR产生的DNA片段。一旦占用，存在一个最小的250-500的bp的侧翼同源区域⁸给出的染色体DNA的重组。包括选择标记这些侧翼区之间可以方便地检测经常发生转化的。 T">这种方法可以用于不同的遗传操作的霍乱弧菌 ，可能还有其他的自然胜任的细菌。我们提供了三个新的例子可以用这种方法来完成的，除了我们之前发表的研究单基因缺失和另外的亲和标签序列。优化步骤，初始协议的几丁质引起的自然转换⁶注册成立在此TransFLP的协议，包括（其中包括）更换螃蟹壳碎片市售甲壳素片，捐赠PCR衍生的DNA为转化材料^9，和另外的FLP重组目标网站^{（FRT）5。FRT}收网站允许位点定向切除¹⁰ Flp重组酶介导的的选择标记。

研究方案

的TransFLP方法（ 图1）通过三种不同的方法可以举出:Ⅰ）的两个相邻的基因，编码毒力决定因素五删除霍乱 （ 例如 ，ΔctxAB）;Ⅱ）去除的致病岛（ 例如 ，ΔVPI-1）和III）的T7 RNA聚合酶-依赖型启动子序列的融合利益一个基因的上游，这随后允许其人工表达的各菌株背景（ 例如，T7-tfoX）（ 图2）。

1。制备甲壳素片

1. 体重50-80毫克的甲壳素片在一个标准的1.5毫升的塑料管。这可以批量制备。几丁质片市售自Sigma公司（目录编号C9213）。
2. 保持管的盖，打开高压釜的薄片。
3. 高压釜冷却下来后，立即关闭盖子。
4. 商店蒸压甲壳素片在室温下。

2。可选:人工改造五霍乱 FLP重组酶编码质粒

1. 准备电穿孔V。霍乱细胞使用标准的方法^11。的感受态细胞的等分试样储存于-80℃。
2. 将1-2μl的一个普通的小编制质粒pBR-FLP ^5添加到电穿孔五霍乱细胞和将混合物转移到电穿孔比色皿（0.2厘米的间隙宽度）。
3. 应用脉冲电压为1.6 kV。
4. 添加SOC培养基，0.9毫升，轻轻细胞转移到一个标准的14毫升管。孵育非移动的为2.5至3小时，在30℃下
5. 板加入100μl和300μl的LB平板上含有100μg/ ml氨苄青霉素和孵育在30℃下保温过夜。
6. 净化单一的克隆和存储甘油为未来TransFLP实验。

3。寡核苷酸的设计和聚合酶链反应

1. 需要至少六个寡核苷酸扩增的DNA区域（s）的利益，以及FRT-侧翼的抗生素盒通过PCR（ 图3）。建议还包括一个外插入的PCR片段的寡核苷酸对吸。这允许检查FRT-侧翼的抗生素抗性盒（ 例如，'CHK-'和'CHK-向下'引物，在图3至图5所示）的集成和正确的切除。
2. ＃2，＃3，＃4，＃5小心设计的寡核苷酸。他们应该能够充分退火（ 例如 〜28 bp）的模板DNA。模板DNA为基因组DNA（基因组DNA）为引物，＃2和＃5和pROD17 ¹²和PBR-FRT-KAN-FRT（本研究）为引物，＃3和＃4（FRT-阚-FRT-含有质粒DNA，如图3A）。
3. 设计的引物，＃2至＃5允许广泛的碱基配对分别在其5'-末端＃2 /＃3和＃4 /＃5之间的，（ 图3A 的插图）。两轮PCR遵循。
4. 执行3个独立的PCR反应作为^第一轮PCR。第一个，将扩增的基因/ DNA区域的感兴趣的援助的寡核苷酸＃1和＃2的上游区域。 PCR应导致在一个片段中的至少500 bp的长度，以允许在细胞内的同源重组。较短的片段（约250 bp）的就足够了^8，但不建议使用。
5. 与此同时，进行第二次PCR，放大首次登记税两侧的抗生素磁带。对于所提供的实例，我们在这里主要用于APH（根 ^）。使用的寡核苷酸＃3和＃4用于该反应（ 图3A）。
6. 随之而来，扩增PCR（第三次采样）的下游DNA区域。 PCR片段的长度也应该至少500个基点。执行PCR基因组DNA为模板，寡核苷酸＃5和＃6（ 图3A）。
7. 所有三种PCR纯化后片段，进行^第二轮的PCR。使用等量混合物为模板，在第一轮中获得的所有三个片段。扩增催化寡核苷酸＃1和＃6。将所得的PCR片段（ 图3B）在自然的转染实验中（ 图1）作为转化DNA。

4。甲壳素引起的自然转化

1. 成长五需氧霍乱细胞在加富培养基中在30℃，直到它们到达的光密度约为0.5，在600 nm。
2. 通过离心收获细菌。洗沉淀一次，在规定的人工介质（DASW ^6）在2倍体积的DASW前重悬细胞。加入1毫升的文化50-80毫克的无菌甲壳素片（解释第1点）。如果细菌港口质粒pBR-FLP（可选第2点），添加氨苄青霉素（50微克/毫升）的文化。在30°C孵育16-24小时不动。
3. 添加＆GE，200 ng的^第二轮PCR衍生片段（下解释第3点）。广泛分离的几丁质表面的细菌混合，小心不要。不移动的情况下在30℃孵育24小时。
4. 涡广泛的文化≥30秒。 100-300微升传播选择性LB ​​培养基平板上（ 如卡那霉素或庆大霉素的LB板这里提供的例子）。使用双选择性平板怀有质粒pBR-FLP加入氨苄青霉素二者对其他抗生素的细菌。在30℃温育平板16-24小时，或直至菌落是可见的。
5. 从选择性平板分离单转化。这种转化已经取代了原来的染色体位点的PCR片段，由于双交叉事件。这些菌株可直接用于进一步的实验中，是没有必要的情况下，去除抗生素盒。

5。去除选择性盒式（s）的FLP- 重组

1. 人为地改变你的转化与质粒pBR-FLP前，先自然转化试验点2下，如果不这样做。
2. 长出的细菌在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板在37℃下16-24小时。选项:改变中的温度在2-3小时之间，以40°C作为flp的表达质粒pBR-flp的压制在较高温度下^5,10;转印后细菌到新鲜板约。 8小时的潜伏期。
3. 抗生素敏感性（这里用于显示卡那霉素， 图1），通过在含抗生素和抗菌素的琼脂平板上平行restreaking克隆试验。隔离单敏感的殖民地。如果你打算进一步修改的应变与其他缺失/插入使用TransFLP，冻结氨苄青霉素抗性克隆甘油。

6。质粒消除

1. 成长在有氧条件下培养过夜在30℃下使用加富培养基中不添加任何抗生素。
2. 可选:稀释过夜培养1:100，在新的抗生素的培养基，生长的新鲜文化为3-6小时。
3. 板或条纹稀释在普通LB琼脂平板（S）（S）的文化和孵化在30°C为8-16小时（至菌落可见）。
4. 试验抗生素含和不含抗生素的琼脂平板上（ 图1）上并行restreaking克隆的氨苄青霉素敏感性克隆。冻结氨苄青霉素敏感的菌株甘油。

结果

代表性的结果在图4至图6中所示的三个例子的。第一种方法的目的是在删除邻近的基因CTXA的和 ctxB。他们一起进行编码的主要致病因子V。霍乱弧菌 ，霍乱毒素。我们设计寡核苷酸为TransFLP方法，如上述那样，按照图3。中间窝藏FRT-侧翼于原始的DNA位点的ctxAB和最终删除ctxAB和释放的抗性盒的菌株的抗生素抗性盒的菌株的亲本菌株，均测试其基因型...

讨论

的TransFLP上述方法和其他地方已被广泛使用在我们的实验室。种遗传操作是可行的，包括其中包括:删除单个基因和基因簇的基因岛（ 例如 ，VPI-1），缺失，插入感兴趣的基因的上游侧（ 例如 ，启动子序列）的序列，并插入序列结束时的一个特定的基因（ 例如 ，编码的亲和标签）。

一个导入的先决条件TransFLP是，各自的五霍乱菌株是自然变形。有?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录编号	评论
甲壳素片	西格玛	C9213	高压灭菌要求
可选:Micropulser（Flp重组PBR-FLP编码的情况下，抗生素盒应该被切除）	Biorad公司	165-2100	或类似的electroporators