A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
وصفنا بروتوكول طريقة لتحليل GC القائم على المشتقات خلات aldonitrile من الجلوكوزامين وحامض الموراميك المستخرجة من التربة. لتوضيح الآلية الكيميائية، ونقدم أيضا استراتيجية لتأكيد بنية المشتقة وشظايا ايون شكلت بناء على التأين الإلكترون.
نهج كمي إلى الكائنات الحية الدقيقة التي تميز حاسمة لفهم أوسع لوضع الميكروبية وظيفة في إطار النظم الإيكولوجية. الاستراتيجيات الحالية لتحليل الجراثيم تشمل كلا من مختبر الثقافة التقليدية التي تعتمد على التقنيات وتلك القائمة على استخراج مباشرة وتحديد المؤشرات الحيوية معينة 1 و 2. يمكن زرعها قليل بين تنوع الأنواع الجرثومية التي تعيش في التربة، وبالتالي الثقافة التي تعتمد على أساليب إدخال تحيزات كبيرة، وتحديد غائبة في تحليل العلامات البيولوجية.
وقد الحامض الجلوكوزامين، mannosamine، غالاكتوزامين والموراميك خدم كذلك اتخاذ تدابير لائق على حد سواء والأموات الشامل الجرثومية، من هذه الأحماض في الجلوكوزامين (الأكثر وفرة) والموراميك (فريد من الخلية البكتيرية) هي المكونات الأكثر أهمية في نظم التربة 3 (4). ومع ذلك، فإن الافتقار إلى المعرفة على تحليل يحد من تعميم واسع بين أقرانه العلمية. بين جميع EXIلسعة الطرق التحليلية، إلى اشتقاق aldononitrile الأسيتات تليها GC التحليل القائم على برزت كخيار جيد بالنسبة للتوازن على النحو الأمثل الدقة والحساسية، والبساطة، والفصل الكروماتوغرافي جيد، والاستقرار على تخزين عينة 5.
هنا، نقدم لبروتوكول مفصلة لإجراء تحليل موثوق وبسيطة نسبيا من الجلوكوزامين وحامض الموراميك من التربة بعد تحويلها إلى الأسيتات aldononitrile. ويتضمن البروتوكول أساسا أربع خطوات: حامض الهضم، وتنقية العينة، واشتقاق، وتقرير مجلس الإدارة. يتم تعديل هذا الإجراء خطوة بخطوة وفقا لمنشورات السابق 6، 7. وبالإضافة إلى ذلك، نقدم استراتيجية للتحقق من صحة هيكليا أيون الجزيئية المشتقة وشظايا ايون لها شكلت بناء على التأين الإلكترون. طبقنا GC-EI-MS-SIM، LC-ESI-MS-TOF والكواشف المسمى isotopically لتحديد الوزن الجزيئي للaldononitrile خلات الجلوكوزامين derivatized وMURحامض AMIC؛ استخدمنا تحول كتلة من النظائر المسمى المشتقات في الطيف ايون للتحقيق في شظايا ايون من كل المشتقات 8. بالإضافة إلى توضيح النظرية، فإن التحقق من أيون الجزيئية المشتقة وشظايا ايون لها أن تكون مفيدة للباحثين باستخدام δ 13 جيم أو شظايا أيون من هذه المؤشرات الحيوية في الدراسات البيولوجية الكيميائية 9 و 10.
1. تحضير العينة واستخلاص حمض
2. عينة تنقية
3. اشتقاق
4. فصل والقياس
5. مشتق التحقق من صحة
6. ممثل النتائج
بروتوكول للطريقة تتكون بصورة رئيسية من أربع خطوات: حامض الهضم، وتنقية العينة، واشتقاق، وتحديد GC (الشكل 1). ويرد مثال على تحليل للحمض الجلوكوزامين والموراميك من المخزونات ومعيار من عينة من التربة في الشكل 2. ويمكن بالإضافة إلى الجلوكوزامين وحمض الموراميك، mannosamine وغالاكتوزامين (أيزومرين الجلوكوزامين) أيضا أن تحدد في وقت واحد باستخدام طريقة. استنادا إلى عوامل استجابة للمعايير فيما يتعلق الداخلية معيار ميو، اينوزيتول، ويمكننا تحديد هذه المؤشرات الحيوية في عينات من التربة. وقد استخدم معيار استرداد لمراقبة النوعية في عملية اشتقاق. وتظهر مخططات لتشكيل حامض خلات aldononitrile الجلوكوزامين والموراميك derivatized في الشكل (3) .
وتم تحديد الهياكل المقترحة للمشتقات بواسطة GC-EIMS-SIM لتعزيز حساسية، أو التأين الناعمة LC-ESI-TOF MS-8، وتمت دراسة الهياكل المقترحة من شظايا ايون شكلت بناء على التأين الإلكترون من خلال مقارنة الأطياف ايون لل عينات أعدت مع المدرجه النظائر المختلفة 11. ويبين الشكل 4 التحول الشامل لايون المهيمنة م / ض 187 من aldononitrile خلات الجلوكوزامين derivatized في ثلاثة سيناريوهات، الذي أعد مع وكلاء غير المسمى، الأنهيدريت D-الخل، ويو -13 سي الجلوكوزامين. ويمكن الإشارة إلى معلومات تفصيلية أخرى وتفسيرات لمنشوراتنا الأخيرة 8 و 11. ويمكن هذه الاستراتيجية بمثابة نموذج لدراسة الكيمياء المشتقة.
الرقم تدفق قياس 1. الرسم البياني للبروتوكول لتحليل الجلوكوزامين وحامض الموراميك في التربةعينات. ويتضمن البروتوكول أساسا 4 خطوات: حمض الهضم، تنقية، اشتقاق وتصميم GC.
الشكل 2. GC-FID المخططات الاستشرابية من الأسيتات aldononitrile من اينوزيتول، الجلوكوزامين، وحامض الموراميك، mannosamine، غالاكتوزامين وmethylglucamine لمعايير والتربة.
الشكل 3. خطط لتشكيل حامض خلات aldononitrile الجلوكوزامين والموراميك derivatized. الرقم 1 يمثل رد فعل النتريل. الرقم 2 يمثل أستلة.
الشكل 4. الأطياف كتلة من aldononitrile خلات الجلوكوزامين derivatized المرتبطة متطوره ايون مهيمنوفاق في ظل الوضع EI أعدت مع (A) وكلاء غير المسمى، (B) D-الخليك الأنهيدريت، (C) يو -13 C-الجلوكوزامين. نجم يمثل النظائر الثقيلة ذرة أو مجموعة النظير.
وقدمت القيادة العامة المستندة إلى طريقة لتحليل الحمض aldononitrile خلات الجلوكوزامين والموراميك derivatized يوفر طريقة سريعة نسبيا لتحديد هذه السكريات الأمينية، والمستخرجة من التربة. والمشتقات هي مستقرة كيميائيا، ويمكن تحديدها في واحدة تحليل. لا يقتصر هذا الأسلوب على عينات م...
ليس لدينا ما يكشف.
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من وزارة الطاقة البحيرات العظمى مركز أبحاث الطاقة الحيوية (وزارة الطاقة BER مكتب العلوم DE-FC02-07ER64494). نحن ممتنون للدكتور تشانغ شو دونغ وأعضاء جماعته لإجراء مناقشات تقنية مفيدة والتعليقات لا تقدر بثمن في وضع الصيغة النهائية للبروتوكول.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | |
حمض الموراميك | سيغما الدريخ | M2503-25MG | |
D-(+)-الجلوكوزامين هيدروكلوريد | سيغما الدريخ | G1514-100G | |
ن ميثيل مد glucamine | سيغما الدريخ | M2004-500G | |
ميو، اينوزيتول | فيشر العلمية | A307003G025 | |
الميثانول (الجاف) | العضوية Acros | AC326950010 | |
4-dimethylamino-بيريدين | العضوية Acros | AC148270050 | |
خلات الإيثيل | VWR الدولية | BJGC100-4 | |
Hydroxlamine هيدروكلوريد | فيشر العلمية | H330-100 | |
بيريدين | فيشر العلمية | P368-500 | |
أنهيدريد الأسيتيك | فيشر العلمية | A10-100 | |
ثنائي كلورو ميثان (كلوريد الميثيلين) | فيشر العلمية | D37-500 | |
الهكسين | فيشر العلمية | H303-4 | |
حمض الهيدروكلوريك (6M) | فيشر العلمية | S456-4 | |
هيدروكسيل هيدروكلوريد -15 N | أيقونة الخدمات | IN5280 | |
أنهيدريد الأسيتيك -2 H (C D 6 4 O 3) | العضوية Acros | AC174670050 | |
D-جلوكوز يو -13 سي | كامبردج معمل النظائر المشعة | CLM-1396-1 | |
الأمونيوم sufate -15 N | كامبردج معمل النظائر المشعة | NLM-713-1 | |
اسم المعدات | شركة | نوع | |
سريع برنامج عمل فيينتيان | LabConco | 790002 | |
Vacum مضخة | KNF Neuberger | D-79112 | |
التحلل قارورة | فيشر العلمية | 06 423A | |
اشتقاق microvial | فيشر العلمية | 06-100E | |
GC | هيوليت باكارد | 6890 | |
MS | هيوليت باكارد | 5972 | |
LC-ESI-TOF-MS | اجيلنت | في 1200 اجيلنت نظام HPLC سلسلة بالإضافة إلى LC اجيلنت / MSD-TOF |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved