土壌中の微生物の残留決定のためのAldononitrile酢酸誘導体化グルコサミンとムラミン酸のGCベースの検出

要約

我々は、グルコサミンや土壌から抽出されたムラミン酸のaldonitrile酢酸誘導体のGC-ベースの分析のためのメソッドがプロトコルを記述します。化学的機構の解明のために、我々はまた、デリバティブおよび電子イオン化により形成されるイオンフラグメントの構造を確認するための戦略を提示します。

要約

微生物を特徴付けるに定量的なアプローチは、生態系内の微生物の状態や機能の広範な理解のために重要である。微生物の分析のための現在の戦略は、従来の研究室文化に依存する技術と直接抽出し、特定のバイオマーカー^1、2の決定に基づいて、それらの両方が含まれます。土壌に生息する微生物種の多様性の間でいくつかを培養し、その文化に依存する方法は重要なバイアス、バイオマーカー分析ではない制限を導入することができます。

これらのグルコサミン（最も豊富に存在する）と、ムラミン酸のグルコサミン、マンノサミン、ガラクトサミンとムラミン酸だけでなく生者と死者の微生物の質量の両方の対策として供されているが、（一意細菌細胞から^）3土壌システムで最も重要な成分である^、4。しかし、分析に関する知識の欠如は、科学的なピア間の幅広い普及を制限します。すべてのEXIの間で分析方法刺す、GCベースの分析に続いてaldononitrileに誘導体化アセテートは良い最適のバランス精度に関してオプション性、感度、シンプルさ、優れたクロマトグラフ分離、およびサンプル·ストレージ^·5時の安定性として浮上している。

ここでは、aldononitrile酢酸への変換後の土壌からのグルコサミンとムラミン酸の信頼性が高く、比較的単純な分析のための詳細なプロトコルを提示します。酸分解、サンプル精製、誘導体化とGC決定：プロトコルは、主に4つのステップで構成されています。ステップバイステップの手順は、前者の刊行物^6,7に応じて変更されています。加えて、我々は電子イオン化により形成される構造誘導体の分子イオンを検証するための戦略とそのイオンの断片を提示します。我々はaldononitrile酢酸誘導体、グルコサミンとMURの分子量を決定するためにGC-EI-MS-SIM、LC-ESI-TOF-MSおよび同位体標識試薬を適用しアミック酸、我々は、各デリバティブ⁸のイオンフラグメントを調べるためのイオンスペクトルの同位体で標識した誘導体の質量シフトを使用していました。理論的な解明に加えて、分子の誘導体のイオンとそのイオンフラグメントの検証では、生物地球化学的研究^9、10に、これらのバイオマーカーの^δ13 Cまたはイオンフラグメントを使用して研究者に有用であろう。

プロトコル

1。サンプルの調製と酸抽出

1. 凍結乾燥した土壌サンプルのフィールドコレクションの後に。
2. ボールミル、土壌グラインダー、または乳鉢と乳棒を用いて土壌試料を粉砕して均質化する。
3. 25mLの加水分解フラスコに土壌サンプルを（> 0.3 mgのNを含む）を量る。
4. しっかりと、それぞれの加水分解フラスコに10mLの6M HClをフラスコにN ₂ガ ​​スを充填し、キャップ。
5. 自動タイマースイッチを使用して8時間105℃インキュベーター内℃で加水分解する。

2。サンプルの精製

1. インキュベーターからフラスコを取り外し、室温まで冷却する。
2. 各フラスコに100μLの内部標準myo-イノシトール（水1mgを加え^-1）を追加します。渦巻いて混和する。
3. ST / NS 24 /安定性のためのプラスチック製コップに設定された40関節、200 mLの梨形フラスコに排出するプラスチック製の漏斗を設定します。
4. 倍ワットマン＃2定性的円（11センチ径）四半期及び漏斗にセットに。
5. スワール各加水分解フラスコを、フィルタする漏斗にスラリーを注ぎます（さらに水〜3 mLで各フラスコをすすぎがあります）。
6. 〜45°C、適用する真空でロータリーエバポレーターを用いて濾液を乾燥させます。
7. 3〜5 mLの水（必要に応じて超音波洗浄機を使用）で各梨フラスコから乾燥した残留物を再懸濁し、40 mLのテフロンチューブに注ぎ、水の第二のアリコートフラスコをすすいでください。
8. 6.8沈殿金属イオンと他の有機分子に1M KOH溶液を使用して - 6.6にpHを調整します。
9. 10分2000 RCFの遠心分離により沈殿物を除去。
10. 40 mLのガラスチューブに上清を注ぐパラフィルムで真空管の開口部をカバーし、-20℃で凍結し、パラフィルムの穴を突く。
11. すべての液体を除去するために凍結上清を凍結乾燥させます。
12. 、3 mLの乾燥したメタノールで残渣を溶解する（必要に応じて超音波浴を使用して）徹底的にボルテックスし、キャップ、チューブ、そして解決するための10分間2000 rcfで遠心塩出。
13. 3 mLの円錐形の反応バイアルに上澄みを移し、45°C（または必要に応じて乾燥した窒素ガスの穏やかな流れの下）で​​RapidVapマシンによって蒸発乾固する。
14. ドライフリーズ100μL回復標準のN-メチルグルカミン（水1mgを加え^-1）と1 mLのH ₂ Oを追加し、各バイアルに、パラフィルムでバイアルの口をカバーし、-20℃で凍結、パラフィルムを穿孔し、 。
15. 100μLムラミン酸（メタノールでは0.5 mg mL ^-1）を、100μLグルコサミン（水に1 mgのmL ^-1）を、100μLミオイノシトール（水1mgを加え^-1）を追加、100μLN-：基準を作るメチル（水に1 mgのmL ^-1）を、1 mLのH ₂ O、パラフィルム各バイアルは、-20℃で凍結し、凍結乾燥し、パラフィルムを穿孔。

3。誘導体化

1. は32 mg mL ^-1のヒドロキシルアミン塩酸塩および40 mg mL ^-1の 4 -ジメチルアミノピリジンを含む誘導体化試薬を準備します。ピリジン - メタノール（4:1 v / v）のピペリジンで。
2. しっかりとキャップ、そして徹底的にボルテックス、reactivialsのそれぞれに誘導体化試薬を300μLを追加します。
3. 35分75から80℃の水浴（よく、任意の水がバイアルを入力することができます避けるために、バイアルを密封）でバイアルを置きます。
4. 水浴から瓶を取り出し、室温まで冷却する。
5. 3 mLのreactivials、しっかりとキャップ、徹底的に渦のそれぞれに1 mLの無水酢酸を追加し、75から80まで25分°Cの水浴で加熱。
6. 水浴から瓶を取り出し、室温まで冷却する。

4。分離と測定

1. 各バイアル、しっかりとキャップ、徹底的にボルテックスに1.5 mLのジクロロメタンを追加します。
2. ソリューションは、独立した二つのフレーズまで邪魔されずに座ってできるようにするために徹底的に各バイアル、しっかりとキャップと渦に1mLの1M HClを追加し、1000μLピペッターを使用して、上部（水性）相を吸引して捨てます。
3. 同じfのashionますが、1 mLのH ₂ O（最後の洗浄工程と、水性トップフェーズのすべてが削除されていることを確認するために特別な世話をする）と、有機相を3回抽出する。
4. （必要に応じて窒素ガスを使用するか、または乾燥）45 RapidVapを使用して、最終的な解決℃で乾燥させます。
5. 300μL酢酸エチル - ヘキサン（1:1 v / v）でしっかりと少量の挿入とキャップ付き2 mLの琥珀色のスクリューキャップ付きバイアルへの転送に溶解する。
6. 、定常フェーズ5％フェニル - 、95％メチルポリシロキサン（DB-5、または同等品）水素と長さ30 m、内径0.25 mm、0.25 umの膜厚：定量化のために、溶融シリカ極性キャピラリカラムを用いたGC-FIDで分析するまたは0.5 mLの分^-1一定流量でキャリアガスとしてヘリウム、。クロマトグラフィーは、プレミアム "不活性"のフェーズと水素キャリアガスで良いですが、より一般的な品種で、ヘリウムと許容されます。検出器の設定は、300°Cであり、400 mLの分^-1の空気と30 mLのmin ^-1の窒素の両方にと水素メークアップガス。注入し、オーブンのパラメータは次のとおりです。250℃に設定GCインレットと1μLスプリット注入（30:1）、初期オーブン温度、120℃、1分間保持、10℃オーブン温度を上げる℃以上。 ^{-1〜250℃、2.5}分間保持; 270ランプ°C 20°C min ^-1の 、2分を保持し、290ランプ°C 20°C min ^-1の 5分を保持します。キャリアガス流量を調整するので、250°Cにおけるイノシトール、グルコサミンとムラミン酸誘導体溶出、および270におけるN-メチルグルカミン溶出℃に

5。デリバティブ検証

1. 分子イオンを識別し、誘導体の分子量を決定するためにソフトなイオン化LC-ESI-TOF-MSを使用しています。
2. デリバティブの対象となるイオンを調べるために感度のGC-EI-MS-SIMまたはGC-EI-MSMS強化を使用しています。
3. 誘導体の調製のために複数の同位体標識試薬を使用し、質量シフトを使用MSそれらの同位体標識誘導体の分子イオンとイオンの断片を調べた。

6。代表的な結果

酸分解、サンプル精製、誘導体化とGCの決定（ 図1）：メソッドのプロトコルは、主に4つのステップで構成されています。グルコサミンと標準株から土壌サンプルからムラミン酸の分析の例を図2に示されています。グルコサミンとムラミン酸、マンノサミンとガラクトサミン（グルコサミンの2種の異性体）のほかにも方法を用いて同時に決定することができます。内部標準ミオイノシトールに関する規格の応答の要因に基づいて、我々は土壌試料中のこれらのバイオマーカーを定量化することができます。回復基準は定性的に誘導体化のプロセスを監視するために使用されています。 aldononitrile酢酸誘導体、グルコサミンおよびムラミン酸の形成のためのスキームを図3に示されている。

デリバティブの提案された構造は、感度の向上、またはソフトなイオン化LC-ESI-TOF-MS ⁸用GC-EIMS-SIMにより測定した。電子イオン化により形成されるイオンフラグメントの提案された構造は、イオンのスペクトルを比較することによって検討したサンプルは、さまざまな同位体incorporations ¹¹で調製した。 図4は、非標識剤、D-酢酸無水、およびU ^-13 C-グルコサミンで調製した3つのシナリオにおける支配的なイオンaldononitrile酢酸のm / z 187の誘導体化グルコサミンの質量変化を示しています。その他の詳細情報および説明は、我々の最近の出版物^8、11を参照することができます。この戦略は、デリバティブ化学を勉強するためのモデルとして役立つかもしれません。

土壌中のグルコサミンとムラミン酸の分析のためのプロトコルの図1測定のフローチャートサンプル。酸分解、精製、誘導体化とGC決定：プロトコルは、主に4つのステップが含まれています。

図2標準および土壌のイノシトール、グルコサミン、ムラミン酸、マンノサミン、ガラクトサミンとメチルのaldononitrile酢酸のGC-FIDクロマトグラム。

図3。aldononitrile酢酸誘導体、グルコサミンおよびムラミン酸の形成のためのスキーム。番号1は、ニトリルの反応を表しています。番号2は、アセチル化を表しています。

図4。支配的なイオンstructurに関連付けられているaldononitrile酢酸誘導体化グルコサミンのマススペクトル（A）非標識剤、（B）D-酢酸無水、（C）U ^-13 C-グルコサミンで調製したEIモードでのES。星は重い同位体原子または同位体基を表す。

ディスカッション

aldononitrile酢酸誘導体、グルコサミンおよびムラミン酸の分析のための提示GCベースの方法は、土壌から抽出されたこれらのアミノ糖を定量するため、比較的迅速な方法を提供する。誘導体は化学的に安定であり、1回の分析で決定することができます。メソッドは、土壌サンプルに限定されるものではなく、非土壌マトリックスからのサンプルに簡略化することができます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号
ムラミン酸	Sigma-Aldrich社	M2503-25mgを
D-（+） - グルコサミン塩酸塩	Sigma-Aldrich社	G1514-100G
N-メチル-D-グルカミン	Sigma-Aldrich社	M2004-500G
ミオイノシトール	フィッシャー·サイエンティフィック	A307003G025
メタノール（ドライ）	アクロスの有機物	AC3269500​​10
4 - ジメチルアミノピリジン	アクロスの有機物	AC148270050
酢酸エチル	VWRインターナショナル	BJGC100-4
Hydroxlamine塩酸塩	フィッシャー·サイエンティフィック	H330-100
ピリジン	フィッシャー·サイエンティフィック	P368-500
無水酢酸	フィッシャー·サイエンティフィック	A10-100
ジクロロメタン（塩化メチレン）	フィッシャー·サイエンティフィック	D37-500
ヘキサン	フィッシャー·サイエンティフィック	H303-4
塩酸（6M）	フィッシャー·サイエンティフィック	S456-4
ヒドロキシルアミン塩酸塩-15 N	アイコンサービス	IN5280
無水酢酸-2 H（D 6 C 4 O 3）	アクロスの有機物	AC174670050
D-グルコース-U -13 C	ケンブリッジアイソトープ実験室	CLM-1396から1
アンモニウムsufate -15 N	ケンブリッジアイソトープ実験室	NLM-713から1
機器の名前	会社	タイプ
ラピッドバップ	LabConco	790002
Vacumポンプ	KNF Neuberger	D-79112
加水分解フラスコ	フィッシャー·サイエンティフィック	06 423A
マイクロバイアル誘導体化	フィッシャー·サイエンティフィック	06-100E
GC	ヒューレット·パッカード	6890
MS	ヒューレット·パッカード	5972
LC-ESI-TOF-MS	アジレント	Agilent 1200シリーズHPLCシステムは、Agilent LC / MSD-TOFに結合