GC-based Detection di acetato derivatizzata Glucosamina e muramico Acid Aldononitrile per la determinazione dei residui microbica nel terreno

Riepilogo

Noi descriviamo un protocollo di metodo per la GC-analisi, basata su strumenti derivati ​​di acetato di aldonitrile di glucosamina e acido muramico estratti dal suolo. Per chiarire il meccanismo chimico, si presentano anche una strategia per confermare la struttura del derivato ed i frammenti di ioni formate sulla ionizzazione elettronica.

Abstract

Quantitavo dei microrganismi che caratterizzano sono essenziali per una comprensione più ampia dello stato microbica e la funzione all'interno degli ecosistemi. Attuali strategie per l'analisi microbiologica di laboratorio tradizionali comprendono sia la cultura-dipendenti tecniche e quelle basate su estrazione diretta e la determinazione di alcuni biomarcatori ^{1, 2.} Pochi tra la diversità delle specie microbiche abitano suolo possono essere coltivate, in modo da cultura-dipendenti metodi introdurre distorsioni significative, una limitazione assente nelle analisi di biomarker.

L'acido glucosamina, mannosammina, galattosamina e muramico sono stati ben servito come misure sia i vivi ei morti di massa microbica, di questi l'acido della glucosamina (più abbondante) e muramico (unicamente dalla cellula batterica) sono costituenti più importanti nei sistemi suolo ^{3 , 4.} Tuttavia, la mancanza di conoscenza sulle analisi limita la divulgazione a livello scientifico tra pari. Tra tutti existing metodi analitici, derivatizzazione di aldononitrile acetati seguita da GC-based analisi è emerso come una buona opzione rispetto a bilanciare in modo ottimale precisione, sensibilità, semplicità, buona separazione cromatografica, e la stabilità durante lo stoccaggio del campione ^5.

Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per un'analisi affidabile e relativamente semplice di glucosamina e acido muramico dal terreno dopo la loro conversione al acetati aldononitrile. Il protocollo comprende principalmente quattro fasi: digestione acida, purificazione del campione, derivatizzazione e determinazione GC. Il passo-passo procedura viene modificato secondo ex pubblicazioni ^{6, 7.} Inoltre, presentiamo una strategia per convalidare strutturalmente lo ione molecolare del derivato e suoi frammenti ionici formato sulla ionizzazione elettronica. Abbiamo applicato GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS e reagenti marcati con isotopi per determinare il peso molecolare di acetato glucosamina aldononitrile derivatizzata e murL'acido Amic, abbiamo usato lo spostamento di massa di isotopi marcati derivati ​​nello spettro di ioni di indagare frammenti di ioni di ogni derivati ^​​8. Oltre alla spiegazione teorica, la convalida di ione molecolare del derivato e suoi frammenti ionici sarà utile per ricercatori utilizzando δ ¹³ C o frammenti ionici di questi marcatori in studi biogeochimici ^{9, 10.}

Protocollo

1. Preparazione del campione e l'estrazione degli acidi

1. Liofilizzare campioni di terreno dopo la raccolta campo.
2. Macinare e omogeneizzare campioni di suolo mediante un mulino a sfere, smerigliatrice suolo, o un mortaio e pestello.
3. Pesare campioni di suolo (contenente> 0,3 mg N) in un pallone da 25 mL idrolisi.
4. Aggiungere 10 ml di HCl 6M in ogni pallone idrolisi, compilare N ₂ gas nei fiaschi, e tappo.
5. Idrolizzano a 105 ° C in un incubatore per 8 ore utilizzando un timer automatico.

2. Purificazione del campione

1. Rimuovere i palloni dall 'incubatrice; raffreddare a temperatura ambiente.
2. Aggiungere 100 ul di standard interno myo-inositolo (1 mg mL ^-1 in acqua) in ciascuno dei palloni, mescolare agitando.
3. Impostare imbuti di plastica drenanti in 200 ml flaconi a forma di pera con ST / NS 24/40 articolazioni, situato in bicchieri di plastica per la stabilità.
4. Fold Whatman # 2 Circles qualitativi (11 cm di diametro) in quarti e set in imbuti.
5. Swirl ogni pallone idrolisi, e versare il liquame nel imbuto per filtrare (si può ulteriormente lavare ogni pallone con ~ 3 ml di acqua).
6. Asciugare il filtrato con un evaporatore a ~ 45 ° C, sotto vuoto applicando.
7. Risospendere il residuo secco da ciascuna beuta pera con 3 ~ 5 ml di acqua (usare bagno a ultrasuoni se lo si desidera), e versare in una provetta da 40 ml in teflon, lavare il pallone con una seconda aliquota di acqua.
8. Regolare il pH a 6,6-6,8 usando 1M soluzione di KOH a ioni metallici precipitare e altre molecole organiche.
9. Rimuovere il precipitati tramite centrifugazione a 2000 rcf per 10 minuti.
10. Versare il surnatante in un tubo di 40 ml di vetro, coprire l'apertura del tubo con parafilm, congelare a -20 ° C, poi colpire buchi nel parafilm.
11. Liofilizzare il surnatante congelata per rimuovere tutto il liquido.
12. Sciogliere il residuo con 3 ml di metanolo a secco, vortex accuratamente (usare bagno a ultrasuoni se lo si desidera), tappare la provetta, quindi si centrifuga a 2000 rcf per 10 minuti per risolverei sali.
13. Trasferire il surnatante in una fiala da 3 ml di reazione, porta a secco con macchine RapidVap a 45 ° C (o sotto un leggero flusso di gas di azoto secco se lo si desidera).
14. Per ogni flacone, aggiungere 100 microlitri di recupero standard N-metilglucammina (1 mg mL ^-1 in acqua) e 1 mL H ₂ O, coprire le bocche flacone con parafilm, congelare a -20 ° C, perforare la parafilm, e poi congelare a secco .
15. Fare standard: aggiungere 100 microlitri di acido muramico (0,5 mg mL ^-1 in metanolo), 100 pl glucosamina (1 mg mL ^-1 in acqua), 100 pl myo-inositolo (1 mg mL ^-1 in acqua), 100 N-pl metilglucamina (1 mg mL ^-1 in acqua), e 1 ml di H ₂ O, parafilm ogni flaconcino, congelare a -20 ° C, perforare la parafilm, poi congelare-dry.

3. Derivatizzazione

1. Preparare derivatizzazione reagente contenente 32 mg mL ^-1 idrossilammina cloridrato e 40 mg mL ^-1 4-dimetilammino-PYridine in piridina-metanolo (4:1 v / v).
2. Aggiungere 300 pl di reagente derivatizzazione a ciascuno dei reactivials, tappo a, e miscelare accuratamente.
3. Mettere le provette in bagnomaria 75-80 ° C per 35 minuti (ben sigillate le fiale per evitare che l'acqua per inserire i flaconi).
4. Rimuovere le fiale dal bagnomaria, e lasciare raffreddare a temperatura ambiente.
5. Aggiungere 1 ml di anidride acetica a ciascuno dei tre reactivials mL, tappo ben, e vortex accuratamente, poi riscaldare 75-80 ° C in bagnomaria per 25 minuti.
6. Rimuovere le fiale dal bagnomaria, e lasciare raffreddare a temperatura ambiente.

4. Separazione e Misura

1. Aggiungere 1,5 mL di diclorometano ad ogni tappo del flaconcino, strettamente, e miscelare accuratamente.
2. Aggiungere 1 ml di HCl 1M per ogni tappo del flaconcino, con forza e vortice a fondo per permettere alle soluzioni per riposare fino a quando le due frasi separate, aspirare ed eliminare la parte superiore (acquosa) fase con 1000 pipettatore ul.
3. Nella stessa fashion, estrarre la fase organica 3 volte, ma con 1 mL H ₂ O (con l'ultimo stadio di lavaggio, prestare particolare attenzione per garantire che tutta la fase acquosa superiore è stato rimosso).
4. Essiccare la soluzione finale utilizzando RapidVap a 45 ° C (o secco utilizzando gas azoto se desiderato).
5. Sciogliere in 300 ul di acetato di etile-esano (1:1 v / v) e trasferimento a 2 ml ambra con tappo a vite fiale con inserto in un piccolo volume e tappo.
6. Per la quantificazione, analizzare mediante GC-FID utilizzando un fuso colonna capillare di silice polare: 30 m di lunghezza, 0,25 mm, spessore 0,25 um; fase stazionaria fenil-5%, 95% di metil-polisilossano (DB-5 o equivalente) con idrogeno o elio come gas di trasporto, a 0,5 mL min ^-1 flusso costante. La cromatografia è migliore su premium "inerti" fasi e carrier gas idrogeno, ma è accettabile sulle varietà più comuni e con elio. Le impostazioni del rivelatore sono 300 ° C, 400 mL min ^-1 aria e 30 mL min ^-1 sia per l'azoto etrucco gas idrogeno. L'iniezione e parametri forno sono i seguenti: 1 pl iniezione a separazione (30:1) con l'entrata GC impostata a 250 ° C, temperatura del forno iniziale, 120 ° C; premuto 1 min; aumentare la temperatura del forno a 10 ° C min. ^-1 a 250 ° C; tenere 2,5 min;. rampa a 270 ° C a 20 ° C min ^-1; tenere 2 minuti; rampa a 290 ° C a 20 ° C min ^-1, tenere premuto 5 min. Regolare il flusso del gas vettore in modo che la eluiscono inositolo, glucosammina e derivati ​​dell'acido muramico a 250 ° C, e le N-metilglucamina eluisce a 270 ° C.

5. Derivata di convalida

1. Utilizzare ionizzazione morbida LC-ESI-TOF-MS per identificare lo ione molecolare e determinare il peso molecolare del derivato.
2. Utilizzare GC-EI-MS-SIM o GC-EI-MSMS per il miglioramento della sensibilità per indagare ioni mirati del derivato.
3. Utilizzare più reagenti marcati con isotopi per la preparazione dei derivati, e quindi utilizzare lo spostamento di massadi questi derivati ​​marcati con isotopi a MS per indagare ione molecolare e frammenti di ioni.

6. Risultati rappresentativi

Il protocollo del metodo comprende essenzialmente quattro fasi: digestione acido, purificazione del campione, derivatizzazione e determinazione GC (Figura 1). Un esempio di analisi per glucosammina e acido muramico dalle scorte standard e da un campione di terreno viene mostrato nella Figura 2. Oltre glucosammina e acido muramico, mannosammina e galattosamina (due isomeri di glucosammina) possono anche essere determinati simultaneamente utilizzando il metodo. Sulla base di fattori di risposta standard rispetto alla standard interno myo-inositolo, si può quantificare questi marcatori in campioni di terreno. Lo standard di recupero è stato usato per monitorare qualitativamente il processo di derivatizzazione. I regimi per la formazione del aldononitrile derivatizzata glucosammina e acido muramico acetato sono mostrati in figura 3 .

Le strutture proposte dei derivati ​​sono stati determinati mediante GC-EIMS-SIM per miglioramento della sensibilità, o ionizzazione morbida LC-ESI-TOF-MS ^8; le strutture proposte dei frammenti ionici formate sulla ionizzazione elettronica stati studiati confrontando gli spettri ione del I campioni preparati con isotopi vari incorporazioni ^11. La figura 4 mostra lo spostamento della massa dominante di ioni m / z 187 di acetato glucosamina aldononitrile derivatizzato in tre scenari, preparati con agenti non etichettati, D-acetico anidrite, e U ^-13 C-glucosamina. Altre informazioni dettagliate e chiarimenti è possibile fare riferimento alla nostra recente pubblicazioni ^{8, 11.} Questa strategia potrebbe servire da modello per studiare la chimica derivata.

Figura 1. Flusso tabella di misura del protocollo per l'analisi di glucosammina e acido muramico nel suolocampioni. Il protocollo contiene principalmente 4 fasi: digestione acida, purificazione, derivatizzazione e determinazione GC.

Figura 2. GC-FID cromatogrammi di acetati aldononitrile di inositolo, glucosamina, muramico acido, mannosammina, galattosamina e metilglucamina per le norme e del suolo.

Figura 3. Schemi per la formazione del aldononitrile derivatizzata muramico glucosamina e acido acetico. Il numero 1 rappresenta la reazione nitrile. Il numero 2 rappresenta l'acetilazione.

Figura 4. Spettri di massa di acetato di glucosamina aldononitrile derivatizzata associato vede una struttura ionica dominantees in modalità EI preparato con (A) Agenti non-etichettati, (B), D-acetico anidrite, (C) U ^-13 C-glucosamina. Stella rappresenta isotopo pesante atomo o gruppo di isotopo.

Discussione

Il presentato GC-based metodo per l'analisi di acetato derivatizzata glucosammina e acido muramico aldononitrile fornisce un metodo relativamente rapido per quantificare questi amminoacidi, zuccheri estratti dal suolo. I derivati ​​sono chimicamente stabili, e può essere determinata in analisi. Il metodo non è limitato a campioni di terreno, e può essere semplificata per campioni di suolo non-matrice.

La pompa a vuoto utilizzata in questo metodo è costruito per essere resistenti ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo
L'acido muramico	Sigma-Aldrich	M2503-25mg
D-(+)-glucosammina cloridrato	Sigma-Aldrich	G1514-100G
N-metil-D-glucammina	Sigma-Aldrich	M2004-500G
Myo-inositolo	Fisher Scientific	A307003G025
Metanolo (secco)	Acros organici	AC326950010
4-dimetilammino-piridina	Acros organici	AC148270050
Acetato di etile	VWR International	BJGC100-4
Hydroxlamine cloridrato	Fisher Scientific	H330-100
Pyridine	Fisher Scientific	P368-500
Anidride acetica	Fisher Scientific	A10-100
Diclorometano (cloruro di metilene)	Fisher Scientific	D37-500
Esano	Fisher Scientific	H303-4
Acido cloridrico (6M)	Fisher Scientific	S456-4
Idrossilammina cloridrato -15 N	Icona servizi	IN5280
Anidride acetica -2 H (D 6 C 4 O 3)	Acros organici	AC174670050
D-glucosio-U -13 C	Cambridge isotopo lab	CLM-1396-1
Ammonio sufate -15 N	Cambridge isotopo lab	NLM-713-1
Nome dell'apparecchiatura	Azienda	Tipo
Rapid-Vap	Labconco	790002
Vacum pompa	KNF Neuberger	D-79.112
Idrolisi pallone	Fisher Scientific	06 423A
Derivatizzazione microprovetta	Fisher Scientific	06-100E
GC	Hewlett-Packard	6890
MS	Hewlett-Packard	5972
LC-ESI-TOF-MS	Agilent	Un Agilent 1200 Series HPLC accoppiato ad un LC Agilent / MSD-TOF