GC baseado em detecção de ácido Aldononitrile Glucosamina e Murâmicos Acetato derivatizados à determinação do resíduo microbiana em solo

Resumo

Nós descrevemos um método para o protocolo de análise de GC-Based dos derivados aldonitrile acetato de glucosamina e ácido murâmico extraído do solo. Para elucidação do mecanismo química, também apresentar uma estratégia para confirmar a estrutura do derivado e os fragmentos de iões formados mediante ionização de electrões.

Resumo

Abordagens quantitativas dos microrganismos que caracterizam são cruciais para uma compreensão mais ampla do estado microbiana e função dentro dos ecossistemas. As estratégias actuais para análise microbiana incluem ambos os tradicionais de laboratório de cultura dependentes de técnicas e aqueles com base em extracção directa e determinação de biomarcadores determinados ^{1, 2.} Poucos entre a diversidade de espécies microbianas que habitam o solo podem ser cultivadas, de modo a cultura dependentes de métodos de introduzir enviesamentos significativos, uma limitação ausente na análise de biomarcadores.

O ácido glucosamina, manosamina, galactosamina e murâmico têm sido bem como medidas de vivos e mortos massa microbiana, desses ácidos a glucosamina (mais abundante) e murâmico (exclusivamente a partir de células bacterianas) são componentes mais importantes nos sistemas de solo ^{3 , 4.} No entanto, a falta de conhecimento sobre a análise restringe a ampla divulgação entre os pares científicos. Entre todas as existing métodos analíticos, derivatização para aldononitrile acetatos seguido por GC-análise baseada surgiu como uma boa opção em relação à melhor forma equilibrar precisão, sensibilidade, simplicidade, boa separação cromatográfica, e estabilidade durante o armazenamento da amostra ^5.

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para uma análise confiável e relativamente simples de glucosamina e ácido murâmico do solo após a sua conversão para acetatos aldononitrile. O protocolo é constituída principalmente por quatro etapas: digestão ácida, a purificação da amostra, a derivatização e determinação GC. O procedimento passo-a-passo é modificada de acordo com as publicações ex ^{6, 7.} Além disso, apresentam-se uma estratégia para estruturalmente validar o ião molecular do derivado e fragmentos seus iões formada a partir de ionização de electrões. Foram aplicados GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS e os reagentes isotopicamente rotulados para determinar o peso molecular de aldononitrile acetato de glucosamina derivatizado e murácido âmico; utilizou-se o deslocamento em massa de marcada com isótopos derivados no espectro de iões para investigar fragmentos de iões de cada derivados ^8. Além disso para a elucidação teórica, a validação do ião molecular do derivado e fragmentos seus iões será útil para os investigadores que utilizam δ ¹³ C ou fragmentos de iões destes biomarcadores em estudos biogeoquímicos ^{9, 10.}

Protocolo

1. Preparação de amostras e extração de ácidos

1. Liofilizar amostras de solo após a coleta de campo.
2. Moer e homogeneizar amostras de solo, utilizando um moinho de bolas, moinho de solo, ou um almofariz e um pilão.
3. Pesar amostras de solo (contendo> 0,3 mg de N) para um balão de hidrólise de 25 mL.
4. Adicionar 10 mL de HCl 6M em cada frasco de hidrólise, preencher N gás ₂ nos frascos, e tampa.
5. Hidrolisar a 105 ° C numa incubadora durante 8 horas, utilizando um interruptor temporizador automático.

2. Purificação da amostra

1. Remover os frascos da incubadora; arrefecer à temperatura ambiente.
2. Adicionar 100 uL padrão interno de mio-inositol (1 mg mL ^-1 em água) a cada frasco e misturar por agitação.
3. Configure funis de plástico de drenagem em 200 ml de pêra com balões em forma de ST / NS 24/40 articulações, definidas em copos de plástico para a estabilidade.
4. Fold Whatman # 2 Círculos qualitativos (11 cm de diâmetro) em quartos e em conjunto funis.
5. Redemoinho de cada frasco de hidrólise, e despeje dejetos em funil para filtrar (você pode ainda Lavar com ~ 3 mL de água).
6. Seca-se o filtrado utilizando um evaporador rotativo a ~ 45 ° C sob vácuo, aplicando.
7. Ressuspender o resíduo seco de cada frasco de pêra com 3 ~ 5 mL de água (utilizar banho ultra-sónico, se desejado), e verter em um tubo de Teflon 40 mL; enxaguar o balão com uma segunda alíquota de água.
8. Ajustar o pH a 6,6-6,8 usando solução 1M de KOH a iões de metal precipitado e outras moléculas orgânicas.
9. Remover os precipitados por centrifugação a 2000 rcf durante 10 minutos.
10. Verter o sobrenadante para um tubo de vidro 40 mL, cobrir a abertura do tubo com parafilme, congelamento a -20 ° C, em seguida, criar buracos na parafilme.
11. Liofilizar o sobrenadante congelado para remover todo o líquido.
12. Dissolve-se o resíduo com 3 mL de metanol seco, vortex completamente (utilizar banho ultra-sónico, se desejado); tampa do tubo, e, em seguida, centrifugar a 2000 rcf durante 10 minutos para resolveros sais.
13. Transferir o sobrenadante para um frasco de reacção 3 mL cónico; evaporar até à secura por máquina RapidVap a 45 ° C (ou sob uma corrente suave de azoto gasoso seco, se desejado).
14. Para cada frasco, adicionar 100 uL de recuperação padrão N-metilglucamina (1 mg mL ^-1 em água) e 1 _mL de H2O, cobrir as bocas dos frascos com parafilme, congeladas a -20 ° C, perfurar a parafilme e, em seguida seca congelar .
15. Fazer padrões: adicionar 100 uL de ácido murâmico (0,5 mg mL ^-1 em metanol), 100 uL de glucosamina (1 mg mL ^-1 em água), 100 uL de mio-inositol (1 mg mL ^-1 em água), 100 N-uL metilglucamina (1 mg mL ^-1 em água), e 1 _mL de H2O, parafilme cada frasco, congelamento a -20 ° C, perfurar a parafilme, em seguida, liofilizar.

3. Derivatização

1. Preparar o reagente de derivatização contendo 32 mg mL ^-1 cloridrato de hidroxilamina e 40 mg mL ^-1 4-dimetilamino-pyridine em piridina-metanol (4:1 v / v).
2. Adicionar 300 uL do reagente de derivatização para cada um dos reactivials, tampa firmemente, e vórtice completamente.
3. Coloque os frascos em banho-maria 75-80 ° C por 35 minutos (bem selados os frascos para evitar que a água entrar nos frascos).
4. Remover os frascos a partir do banho de água, e arrefecer à temperatura ambiente.
5. Adicionar 1 ml de anidrido acético a cada um dos reactivials de 3 mL tampão, firmemente, e vórtice completamente, em seguida aquecer em 75-80 ° C banho de água durante 25 minutos.
6. Remover os frascos a partir do banho de água, e arrefecer à temperatura ambiente.

4. Separação e Mensuração

1. Adicione 1,5 mL de diclorometano a cada frasco tampa, com força, e vortex completamente.
2. Adicionar 1 mL de HCl 1M para cada frasco de tampa, com firmeza e vortex cuidadosamente para permitir que as soluções para sentar-se imperturbável até as duas frases em separado, aspirar e descartar a fase (aquosa) superior usando pipetador 1000 uL.
3. Na mesma fashion, extrair a fase orgânica 3 vezes, mas com 1 _mL de H2O (com o passo de lavagem último, tomar cuidado especial para assegurar que toda a fase aquosa superior foi removida).
4. Seca-se a solução final utilizando RapidVap a 45 ° C (ou seca utilizando azoto gasoso, se desejado).
5. Dissolve-se em 300 uL de etilo acetato de etilo-hexano (1:1 v / v) e transferência para 2 mL de âmbar com tampa de rosca frascos com um volume pequeno-inserção e tampa.
6. Para a quantificação, analisar por GC-FID utilizando uma coluna capilar de sílica fundida não polar: 30 m de comprimento, 0,25 mm id, 0,25 espessura de filme UM; fase estacionária 5% fenil-, 95% metil-polissiloxano (DB-5 ou equivalente) com hidrogénio ou hélio como gás transportador, em 0,5 mL de fluxo ^-1 min constante. A cromatografia é melhor no prêmio "inerte" fases e gás transportador de hidrogênio, mas é aceitável para as variedades mais comuns e com hélio. As configurações são detectores 300 ° C, 400 mL min ^-1 de ar e 30 mL min ^-1, tanto para o nitrogênio emaquiagem gases hidrogênio. A injecção e os parâmetros do forno são como se segue: 1 injecção de divisão uL (30:1) com a entrada de GC fixado em 250 ° C; temperatura do forno inicial, de 120 ° C; segurar 1 min; aumentar a temperatura do forno a 10 ° C min. ^-1 a 250 ° C; segurar 2,5 min;. rampa até 270 ° C a 20 ° C ^min @ 1; segurar 2 minutos; rampa para 290 ° C a 20 ° C min ^-1, mantenha 5 min. Ajustar o transportador taxa de fluxo de gás de modo que a eluir inositol, glucosamina e derivados de ácido Murâmicos a 250 ° C, e os elui N-metilglucamina com 270 ° C.

5. Validação Derivada

1. Use ionização mole LC-ESI-TOF-MS para identificar o ião molecular e determinar o peso molecular do derivado.
2. Use GC-EI-MS-SIM ou GC-EI-MSMS para aumento de sensibilidade para investigar os iões específicos do derivado.
3. Use vários reagentes isotopicamente marcados para a preparação dos derivados, e depois usar o deslocamento em massados derivados isotopicamente marcados em MS para investigar ião molecular e fragmentos de iões.

6. Os resultados representativos

O protocolo do método compreende principalmente quatro etapas: digestão ácida, a purificação da amostra, a derivatização e GC determinação (Figura 1). Um exemplo da análise para a glucosamina e ácido murâmico das existências de padrão e de uma amostra de solo é mostrado na Figura 2. Além glucosamina e ácido murâmico, manosamina e galactosamina (dois isómeros de glucosamina) também pode ser determinada utilizando o método simultâneo. Com base em factores de resposta de padrões com relação ao padrão interno de mio-inositol, podemos quantificar estes biomarcadores em amostras de solo. O padrão de recuperação tem sido utilizada para monitorizar o processo qualitativamente derivatização. Os esquemas para a formação do ácido aldononitrile glucosamina e murâmico acetato derivatizado são mostrados na Figura 3 .

As estruturas propostas dos derivados foi determinada por GC-EIMS-SIM para aumento de sensibilidade, ou da ionização mole LC-ESI-TOF-MS ^8; as estruturas propostas dos fragmentos de iões formados mediante ionização de electrões foram estudados por comparação dos espectros de iões do amostras preparadas com incorporações de isótopos diferentes ^11. A Figura 4 mostra a mudança de massa do ião dominante m / z 187, de aldononitrile acetato de glucosamina derivatizado em três cenários, preparados com agentes não-etiquetados, D-acético anidrite, e ^-13 U C-glucosamina. Outras informações detalhadas e explicações podem ser encaminhados para nossas publicações mais recentes ^{8, 11.} Esta estratégia poderia servir de modelo para estudar química derivada.

Figura 1. Fluxograma Medição do protocolo para a análise de glucosamina e ácido murâmico no soloAs amostras. O protocolo contém principalmente 4 etapas: digestão ácida, purificação, derivatização e determinação GC.

Figura 2. GC-FID cromatogramas de acetatos aldononitrile de inositol, glucosamina, ácido murâmico, manosamina, galactosamina e metilglucamina para normas e do solo.

Figura 3. Esquemas para a formação do ácido aldononitrile glucosamina e murâmico acetato derivatizado. O número 1 representa reacção de nitrilo. O número 2 representa acetilação.

Figura 4. Os espectros de massa de acetato de glucosamina aldononitrile derivatizado associado com a estruturação ião dominantees sob modo EI preparado com (A) os agentes não-etiquetados, (B) D-acético anidrita, (C) U ^-13 C-glucosamina. Estrela representa pesado isótopo átomo ou grupo de isótopos.

Discussão

O método GC apresentou baseado para a análise de aldononitrile ácido murâmico glucosamina e acetato de derivatizado proporciona um método relativamente rápido para quantificar estes açúcares aminados, extraídos do solo. Os derivados são quimicamente estáveis, e pode ser determinada em uma análise. O método não é restrito às amostras de solo, e pode ser simplificada para amostras de solo não-matriz.

A bomba de vácuo usado neste método é construído para ser resistente a á...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Murâmico	Sigma-Aldrich	M2503-25mg
D-cloridrato de (+)-glucosamina	Sigma-Aldrich	G1514-100G
N-metil-D-glucamina	Sigma-Aldrich	M2004-500G
Mio-inositol	Fisher Scientific	A307003G025
Metanol (seco)	Acros Organics	AC326950010
4-dimetilamino-piridina	Acros Organics	AC148270050
Acetato de etilo	VWR International	BJGC100-4
Cloridrato Hydroxlamine	Fisher Scientific	H330-100
Piridina	Fisher Scientific	P368-500
Anidrido acético	Fisher Scientific	A10-100
Diclorometano (cloreto de metileno)	Fisher Scientific	D37-500
Hexano	Fisher Scientific	H303-4
Ácido clorídrico (6M)	Fisher Scientific	S456-4
Cloridrato de hidroxilamina -15 N	Ícone serviços	IN5280
Anidrido acético -2 H (D 6 C 4 O 3)	Acros Organics	AC174670050
D-glucose-U -13 C	Cambridge isótopo laboratório	CLM-1396-1
Ammonium sufate -15 N	Cambridge isótopo laboratório	NLM-713-1
Nome do equipamento	Companhia	Tipo
Rapid-Vap	Labconco	790002
Vacum bomba	KNF Neuberger	D-79112
Frasco de hidrólise	Fisher Scientific	06 423A
Microtubo derivatização	Fisher Scientific	06-100E
GC	Hewlett-Packard	6890
MS	Hewlett-Packard	5972
LC-ESI-TOF-MS	Agilent	Um sistema Agilent 1200 series HPLC acoplado a um LC Agilent / MSD-TOF