Toprak Mikrobiyal Kalıntı Tayini için Aldononitrile Asetat türevlendirilmiş Glukozamin ve Muramic Asit GC tabanlı Algılama

Özet

Biz, glukozamin ve toprak ekstrakte muramic asit aldonitrile asetat türevlerinin GC-bazlı analizi için bir yöntem tarif protokolü. Kimyasal mekanizmasının aydınlatılması için, biz de türev ve elektron iyonizasyon halinde oluşan iyon parçalarının yapısını onaylamak için bir strateji sunmak.

Özet

Karakterize eden mikroorganizmalar nicel yaklaşımlar ekosistemler içindeki mikrobik durumu ve işlevini daha geniş bir anlayış için çok önemlidir. Mikrobiyal analiz için güncel yaklaşımlar, geleneksel laboratuvar kültür-bağımlı teknikleri ve doğrudan çıkarma ve bazı biyo ^{1, 2} belirlenmesi esasına dayanan bu iki içerir. Toprak yaşayan mikrobiyal türlerin çeşitliliği arasında çok az kültüre, dolayısıyla kültür-bağımlı yöntemleri önemli önyargıları, biyomarker analizinde eksik bir sınırlama tanıtmak edilebilir.

Glukozamin, mannosamine, galaktosamin ve muramic asit de toprak sistemleri ³ en önemli unsurlar olan bu glukozamin (en bol) ve muramic asit (benzersiz bakteri hücre dan), canlı ve ölü mikrobiyal kütle hem tedbirler olarak hizmet edilmiştir ^{, 4.} Ancak, analiz konusunda bilgi eksikliği bilimsel emsalleri arasında geniş yaygınlaşması kısıtlar. Tüm exi arasındaaldononitrile için, türevlendirme analitik yöntemler sting GC tabanlı analizi takip asetatlar optimum hassas dengeleme açısından iyi bir seçenek olarak ortaya çıkmıştır, hassasiyet, basitlik, numune saklama ⁵ üzerinde iyi kromatografik ayırma ve kararlılık.

Burada, aldononitrile asetatlar onların dönüşüm sonra topraktan glukozamin ve muramic asit güvenilir ve nispeten basit bir analizi için detaylı bir protokolü sunarız. Protokolü, dört adımdan oluşmaktadır: asit sindirim, örnek arıtma, türevlendirme ve GC belirlenmesi. Adım adım prosedürü eski yayınları ^{6, 7} göre ayarlanır. Buna ek olarak, yapısal olarak elektron iyonizasyon üzerinde oluşmuş türevi ve iyonu parçacıkları moleküler iyon doğrulamak için bir strateji sunulmaktadır. Biz aldononitrile asetat türevlendirilmiş glukozamin ve mur moleküler ağırlıkların belirlenmesi için GC-MS-EI-SİM, LC-ESI-TOF-MS ve izotopik olarak etiketlenmiş bir reaktif uygulananAmic asit; her türevleri ⁸ iyonu parçacıkları araştırmak için iyon spektrumunda izotop etiketli türevlerinin kütle kayma kullanılır. Teorik aydınlatılması ek olarak, türev ve iyonu parçacıkları moleküler iyon doğrulama δ ¹³ C ya da biyokimyasal çalışmalarda ^{9, 10,} bu biyolojik iyon parçaları araştırmacılar kullanılarak yararlı olacaktır.

Protokol

1. Numune Hazırlama ve Asit Ekstraksiyon

1. Freeze-kuru toprak örnekleri alan koleksiyon sonra.
2. Bir bilyalı değirmen, toprak değirmeni veya bir havanda kullanarak toprak örnekleri eziyet ve homojenize.
3. 25 ml'lik hidroliz balona toprak örnekleri (> 0.3 mg N içeren) tartılır.
4. Her hidroliz balona 10 ml 6M HCl ekleyin, sıkı N ₂ şişe gaz ve kap doldurun.
5. Otomatik zamanlayıcı anahtarı kullanarak 8 saat boyunca 105 ° küvözde C'de hidroliz.

2. Örnek Arıtma

1. Inkübatör gelen şişeler çıkarın; oda sıcaklığına kadar soğutulur.
2. Dönen karıştırın, her balona 100 mcL iç standart myo-inositol (suda 1 mg ml ^-1) ekleyin.
3. ST / NS 24 / istikrar için plastik bardaklar ayarlanan 40 eklem, 200 ml armut şeklinde matara drene plastik huni ayarlayın.
4. Katlama Whatman # 2 Kalitatif Circles (11 cm çapında) mahalle ve huni içine setine.
5. Swirl her hidroliz şişesi, ve (daha fazla su ~ 3 mL Her balona durulayın olabilir) filtre hunisi içine şerbeti dökün.
6. ~ 45 ° C'de, vakum uygulanarak bir döner buharlaştırıcı kullanılarak Filtrat kuruyana.
7. 3 ~ 5 mL su (ve istenirse ultrasonik banyoda kullanan) ile her bir armut şişesi kurutulmuş tortu tekrar süspansiyon, ve bir 40 mL Teflon tüpüne dökülür; suyun ikinci bir kısım ile birlikte şişeye durulanır.
8. 6.8 çökelti metal iyonları ve diğer organik molekülleri 1M KOH çözeltisi kullanılarak - 6.6 pH ayarlayın.
9. 10 dakika boyunca 2000 rcf santrifüj ile tortulaşır çıkarın.
10. Bir 40 mL cam tüp içine dökülür süpernatan, -20 azından tüp parafilm olan açıklığı, dondurularak ° C kapsayan, daha sonra parafilm delikler karıştırmak.
11. Tüm sıvı kaldırmak için dondurulmuş süpernatant dondurun-kurulayın.
12. , 3 ml kuru metanol ile Kalıntı çözünmesi (ve istenirse ultrasonik banyoda kullanmak) iyice vorteks; kap tüpü ve sonra getirilmesi için 10 dakika süreyle 2000 rcf santrifüjlenirtuzları dışarı.
13. Bir 3 mL konik bir reaksiyon şişesi için süpernatan aktarılması; 45 ° C (veya arzu edildiği takdirde, kuru azot gazı akımı altında yumuşak) azından RapidVap makine tarafından kuruyana kadar buharlaştınlmıştır.
14. Her flakon için, 100 uL kurtarma standart N-metil-(suda 1 mg ml ^-1) ve 1 mL H ₂ O eklemek -20 flakon parafilm ağızlara, donma ° C kapsayacak, parafilm delebilir ve sonra kuru dondurma .
15. Standartları hale: 100 uL muramic asit (metanol içerisinde 0.5 mg mL ^-1), 100 uL glukozamin (su içinde 1 mg mL ^-1), 100 uL myo-inositol (su içinde 1 mg mL ^-1), 100 uL N-ekleme metilglukamin (su içinde 1 mg mL ^-1), ve 1 ml _H2O, parafilm herbir şişe, -20 ° C'de dondurulmuş, daha sonra dondurularak kuru, parafilm perfore.

3. Türevlendirme

1. 32 mg mL ^-1 hidroksilamin hidroklorür ve 40 mg mL ^-1 4-dimetilamino-py içeren türevlendirme reaktifi hazırlamakin ridine piridin-metanol (4:1 v / v).
2. Kapağı sıkıca ve iyice girdap, reactivials her birine türevlendirme reaktifi 300 uL ekleyin.
3. 35 dakika boyunca 75-80 ° C su banyosunda (de herhangi bir su şişeleri girmesine izin vermemek için flakon mühürlü) içinde şişeleri koyun.
4. Su banyosu, ve oda sıcaklığında serin şişeleri çıkarın.
5. 3 mL reactivials, sıkı bir şekilde kap, ve iyice vorteks her birine 1 mL asetik anhidrit ekleme, daha sonra 75-80 dakika boyunca 25 ° C'de su banyosu içinde yeniden ısıtma.
6. Su banyosu, ve oda sıcaklığında serin şişeleri çıkarın.

4. Ayırma ve Ölçüm

1. Her flakon, kapağı sıkıca ve iyice girdabına 1.5 mL diklorometan ekleyin.
2. Çözümler iki sözcük ayrı kadar rahatsız oturup bekleyin Her flakon için, kapağı sıkıca ve iyice girdabına 1 ml 1M HCl ekleyin, aspire ve 1000 uL pipet kullanarak üst (sulu) faz atın.
3. Aynı fashion, organik faz 3 kez ayıklamak 1 ml H ₂ O ile (son yıkama adımla, sulu üst aşaması tüm kaldırıldı sağlamak için özel dikkat).
4. 45 de RapidVap kullanarak nihai çözelti kurumaya ° C (ya da kuru istenirse azot gazı kullanarak).
5. 300 uL, etil asetat-hekzan (1:1 v / v) ve küçük hacimli ve sıkı bir şekilde uç kapaklı 2 mL amber vida kapaklı küçük şişelerden transfer çözünmüştür.
6. ; Sabit faz% 5-fenil,% 95 metil-polisiloksan (DB-5 veya eşdeğeri) hidrojen ile 30 m uzunluğunda, 0.25 mm 0.25 um film kalınlığı: ölçümü için, erimiş silika apolar kapiler kolon kullanılarak GC-FID tarafından analiz veya helyum taşıyıcı gaz olarak, 0.5 mL min ^-1 sabit debide. Kromatografisi prim "etkisiz" fazları ve hidrojen taşıyıcı gaz daha iyi, ama daha yaygın çeşitleri ve helyum ile kabul edilebilir. Dedektör 300 ayarlar ve bunlar ° C; 400 mL dak ^-1 hava ve 30 mL dak ^-1 nitrojen ve hem dehidrojen makyaj gazlar. Enjeksiyon ve fırın parametreler şunlardır: ° C, 250 GC girişi ile 1 uL bölünmüş enjeksiyon (30:1); ilk fırın sıcaklığı 120 ° C; 1 dakika tutun; 10 fırın sıcaklığı artırmak ° C min. ^-1 ila 250 ° C; 2.5 dk tutun;. 270 rampa ° C ile 20 ° C min ^-1; 2 dakika tutun; 290 rampa ° C ile 20 ° C min ^-1, 5 dakika tutun. Taşıyıcı gaz akış hızını ayarlama böylece 250 ° C'de inositol, glukozamin ve muramic asit türevleri elüt edilmesi, ve 270 de N-metilglukamin elutes ° C.

5.. Türev Doğrulama

1. Moleküler iyon tanımlamak ve türevinin moleküler ağırlıkların belirlenmesi için yumuşak bir iyonizasyon LC-ESI-TOF-MS kullanabilir.
2. Türevin hedeflenen iyonları araştırmak için duyarlılık geliştirme için GC-EI-MS-SIM veya GC-EI-MSMS kullanın.
3. Türevlerinin hazırlanması için birden çok izotopik olarak etiketlenmiş bir reaktif kullanmak ve sonra kütle kayma kullanımıMS olanlar izotopik olarak etiketlenmiş türevlerinin molekül iyonu ve iyonu parçacıkları incelemek.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Yöntemin protokolü esas olarak dört adımları ihtiva etmektedir: sindirimi asit, Örnek saflaştırma, türevlendirme ve GC tayini (Şekil 1). Glukozamin ve standart stoktan ve bir toprak örneğinden muramic asit analizi için bir örnek, Şekil 2'de gösterilmiştir. Glukozamin ve muramic asit, mannosamine ve galaktosamin (glukozamin iki izomerler) yanı sıra, aynı zamanda yöntemi kullanılarak eş zamanlı olarak tespit edilebilir. İç standart myo-inositol ile ilgili standartların yanıt faktörlere dayanarak, toprak örneklerinde bu biyobelirteçleri ölçmek olabilir. Kurtarma standart nitelik türevlendirme sürecini izlemek üzere kullanılmıştır. Aldononitrile asetat türevlendirilmiş glukozamin ve muramic asit oluşumu için şemalar Şekil 3 'de gösterilmiştir .

Türevlerinin önerilen yapılar duyarlılığı geliştirme, ya da yumuşak iyonizasyon LC-ESI-TOF-MS ⁸ için GC-EIMS-SIM ile belirlenmiştir; elektron iyonizasyon üzerinde oluşmuş iyon parçalarının önerilen yapıları arasında iyon spektrumu karşılaştırarak incelenmiştir örnekleri, çeşitli izotop birleşmeleri ¹¹ ile hazırlanır. Şekil 4, baskın iyon kütle kayması göstermektedir non-etiketli ajanlar, D-asetik anhidrit ve U ^-13 C-glukosamin ile hazırlanan üç senaryo, in aldononitrile asetat türevlendirilmiş glukozamin m / z 187. Diğer bilgi ve açıklamalar bizim son yayınları ^{8, 11} sevk edilebilir. Bu strateji, türev kimya okumak için bir model olarak hizmet verebilir.

Glukozamin analizi ve toprak muramic asit protokolü Şekil 1. Ölçüm akış şemasıörnekleri. Asit sindirim, Arıtma, türetme ve GC belirlenmesi: protokolü, 4 adımları içerir.

Şekil 2. Standartlara ve toprak için inositol, glukozamin, muramic asit, mannosamine, galaktosamin ve metilglucamin ve aldononitrile asetatlar GC-FID kromatogramları.

Şekil 3. Aldononitrile asetat türevlendirilmiş glukozamin ve muramic asit oluşumu için Şema. 1 numara nitril reaksiyonu temsil eder. 2 numaralı asetilasyonu temsil eder.

Şekil 4. Baskın iyon structur ile ilişkili aldononitrile asetat türevlendirilmiş glukozamin Kütle spektrumlarıEI modu altında es (A) non-etiketli maddeleri ile hazırlanmıştır, (B), D-asetik anhidrit, (C) U ^-13 C-glukosamin. Yıldız ağır izotop atomu veya izotop grubu temsil eder.

Tartışmalar

Aldononitrile asetat türevlendirilmiş glukozamin ve muramic asit analizi için sunulmuş GC-bazlı yöntem toprak ekstrakte bu amino şekerler, ölçmek için göreceli olarak hızlı bir yöntem sağlar. Türevleri kimyasal açıdan kararlı olan ve bir analize tespit edilebilir. Yöntemi toprak örnekleri ile sınırlı değildir, ve non-toprak matris örnekler için basitleştirilmiş olabilir.

Bu yöntemde kullanılan vakum pompası aside dirençli olması için yapılmıştır. Biz da...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası
Muramic asit	Sigma-Aldrich	M2503-25mg
D-(+)-glukosamin hidroklorür	Sigma-Aldrich	G1514-100G
N-metil-D-glukamin	Sigma-Aldrich	M2004-500G
Myo-inositol	Fisher Scientific	A307003G025
Metanol (kuru)	Acros organik	AC326950010
4-dimetilamino-piridin	Acros organik	AC148270050
Etil asetat	VWR International	BJGC100-4
Hydroxlamine hidroklorür	Fisher Scientific	H330-100
Piridin	Fisher Scientific	P368-500
Asetik anhidrit	Fisher Scientific	A10-100
Diklorometan (Metilen klorür)	Fisher Scientific	D37'ye-500
Hekzan	Fisher Scientific	H303-4
Hidroklorik asit (6M)	Fisher Scientific	S456-4
Hidroksilamin hidroklorür -15 N	Simge hizmetleri	IN5280
Asetik anhidrid -2 H (D 6 C 4 O 3)	Acros organik	AC174670050
D-glukoz-U -13 C	Cambridge izotop laboratuvarı	CLM-1396-1
Amonyum sufate -15 N	Cambridge izotop laboratuvarı	NLM-713-1
Ekipman Adı	Şirket	Tip
Rapid-Vap	Labconco	790002
Vakum pompası	KNF Neuberger	D-79112
Hidroliz şişesi	Fisher Scientific	06 423A
Türevlendirme microvial	Fisher Scientific	06-100E
GC	Hewlett-Packard	6890
MS	Hewlett-Packard	5972
LC-ESI-TOF-MS	Agilent	Agilent 1200 serisi HPLC sistemi Agilent LC / MSD-TOF birleştiğinde