GC מבוסס זיהוי של אצטט חומצה Aldononitrile גלוקוזאמין Muramic Derivatized לקביעת שאריות מיקרוביאלית בקרקע

Summary

אנו מתארים את שיטת פרוטוקול ניתוח GC מבוסס על אצטט נגזרים aldonitrile של גלוקוזאמין וחומצה muramic שחולצו מן הקרקע. עבור הבהרה של מנגנון כימי, יש לנו גם להציג את האסטרטגיה כדי לאשר את המבנה של נגזרת ואת שברי יון שנוצרו על יינון אלקטרונים.

Abstract

גישות כמותית מיקרואורגניזמים המאפיינים הם בעלי חשיבות קריטית להבנה רחבה יותר של מצב תפקוד מיקרוביאלי ובתוך מערכות אקולוגיות. האסטרטגיות הקיימות כיום עבור ניתוח חיידקים כוללים הן מסורתיות תרבות תלויי מעבדה טכניקות אלה המבוססים על מיצוי ישיר וקביעת סמנים מסוימים ^{1, 2.} מעטים בקרב מגוון של מינים של חיידקים המאכלסים אדמה יכול להיות מתורבת, כך תלויי תרבות שיטות להציג הטיות משמעותיות, מגבלה נעדר בניתוח סמן ביולוגי.

חומצה גלוקוזאמין, mannosamine, galactosamine ו muramic כבר שימש גם אמצעי של החיים וגם המוני חיידקים מתים, חומצה גלוקוזאמין (הנפוץ ביותר) ו muramic אלה (ייחודי של תא החיידק) הם המרכיבים החשובים ביותר במערכות אדמה ^{3 , 4.} עם זאת, חוסר ידע על ניתוח מגביל פופולריזציה רחב בקרב בני גילם מדעיים. בין כל exiהעוקץ שיטות אנליטיות, derivatization כדי aldononitrile acetates ואחריו ניתוח GC מבוסס התפתחה אפשרות טובה מבחינת איזון אופטימלי דיוק, רגישות, פשטות, ההפרדה chromatographic טובה, יציבות על אחסון מדגם ^5.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לניתוח אמין ופשוט יחסית של גלוקוזאמין וחומצה muramic מהקרקע לאחר ההמרה שלהם acetates aldononitrile. פרוטוקול בעיקר כוללת ארבעה שלבים: חומצה העיכול, טיהור המדגם, derivatization ונחישות GC. הליך צעד אחר צעד הוא שונה על פי פרסומים בעבר ^{6, 7.} בנוסף, אנו מציגים אסטרטגיה מבנית לאמת את יון המולקולרי של נגזרת ושברים יון שלה נוצר על יינון אלקטרונים. אנחנו מוחלים GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS ו ריאגנטים שכותרתו isotopically כדי לקבוע את המשקל המולקולרי של אצטט aldononitrile גלוקוזאמין derivatized ו מורחומצה amic, היינו שינוי המסה של איזוטופ, שכותרתו נגזרים בספקטרום יון לחקור שברי יון של כל אחד נגזרים ^8. בנוסף להבהרה תיאורטית, אימות של יון המולקולרי של נגזרת ושברים יון שלה יהיה שימושי לחוקרים באמצעות δ ¹³ C או שברי יון של סמנים אלה במחקרים biogeochemical ^{9, 10.}

Protocol

1. לדוגמא הכנת והפקת חומצה

1. קפוא או יבש לאחר איסוף דגימות קרקע בשטח.
2. לטחון homogenize דגימות קרקע באמצעות טחנת הכדור, מטחנת אדמה, או מכתש ועלי.
3. לשקול דגימות קרקע (המכיל> 0.3 מ"ג N) לתוך הבקבוק 25 מ"ל הידרוליזה.
4. הוסף 10 מ"ל 6M HCl לתוך הבקבוק כל הידרוליזה, למלא N ₂ גז צלוחיות, ואת המכסה בחוזקה.
5. Hydrolyze ב 105 ° C באינקובטור במשך 8 שעות באמצעות מתג טיימר אוטומטי.

2. לדוגמא טיהור

1. הסר את צלוחיות של חממה, מצננים לטמפרטורת החדר.
2. הוספת 100 μL פנימי רגילה מיו, אינוסיטול (1 מ"ג למ"ל ^-1 במים) אל בקבוק אחד, שילוב של מתערבל.
3. הגדרת משפכי פלסטיק מרוקנים לתוך צלוחיות 200 מ"ל בצורת אגס עם ST / NS 24/40 פרקים, שנקבעו על כוסות פלסטיק של יציבות.
4. פולד Whatman # 2 עיגולים בקוטר איכותי (11 ס"מ) לארבעה להגדיר את הנתיבים.
5. מערבולת כל בקבוק הידרוליזה, ויוצקים לתוך משפך slurry לסנן (ייתכן עוד יותר לשטוף כל בקבוק עם 3 ~ מ"ל מים).
6. לייבש את תסנין באמצעות המאייד רוטרי ב ~ 45 ° C, ואקום יישום.
7. Resuspend שאריות יבשות מהבקבוק כל אגס עם 3 ~ 5 מ"ל מים (אמבטיה קולי להשתמש במקרה הצורך), ושופכים לתוך צינורית טפלון 40 מ"ל, לשטוף את הבקבוק עם aliquot 2 מים.
8. להתאים את ה-pH ל 6.6-6.8 באמצעות פתרון 1M KOH למתכת המשתמעת יונים ומולקולות אורגניות אחרות.
9. להסיר משקעים על ידי צנטריפוגה ב RCF 2000 במשך 10 דקות.
10. יוצקים את supernatant לתוך צינור 40 מ"ל זכוכית, מכסים את פתיחת צינור עם parafilm, הקפאה ב -20 מעלות צלזיוס, אז חורים parafilm.
11. ייבוש על ידי קור supernatant קפוא כדי להסיר את כל נוזלי.
12. ממיסים את שאריות עם מתנול יבש 3 מ"ל, vortexing ביסודיות (להשתמש אמבטיה קולי אם רוצים), מכסה את הצינור, ואז סרכזת ב RCF 2000 במשך 10 דקות להתיישבאת מלחי.
13. העברת supernatant כדי בקבוקון 3 תגובה חרוטי מ"ל; להתאדות כדי יובש על ידי מכונת RapidVap ב 45 ° C (או תחת זרם עדין של גז חנקן יבש אם רוצים).
14. כדי בקבוקון אחד, להוסיף 100 μL התאוששות תקן N-methylglucamine (1 מ"ג למ"ל ^-1 במים) ו - 1 מ"ל H ₂ O, לכסות את הפה הבקבוקון עם parafilm, ההקפאה ב -20 מעלות צלזיוס, לנקב parafilm ולאחר מכן להקפיא יבש .
15. הפוך את הסטנדרטים: להוסיף 100 חומצה muramic μL (0.5 מ"ג למ"ל ב ^-1 מתנול), 100 גלוקוזאמין μL (1 מ"ג למ"ל ^-1 במים), 100 μL מיו, אינוסיטול (1 מ"ג למ"ל ^-1 במים), 100 N-μL methylglucamine (1 מ"ג למ"ל ^-1 במים), ו - 1 מ"ל H ₂ O, parafilm כל בקבוקון, הקפאה ב -20 מעלות צלזיוס, לנקב parafilm, ואז להקפיא יבש.

3. Derivatization

1. הכן מגיב derivatization המכיל 32 מ"ג למ"ל ^-1 hydrochloride hydroxylamine ו 40 מ"ג למ"ל ^-1 4 dimethylamino-pyridine ב-פירידין מתנול (04:01 v / v).
2. הוספת 300 μL של מגיב derivatization לכל אחד reactivials את יתר בחוזקה, מערבולת ביסודיות.
3. שימו את צלוחיות באמבטיה 75-80 ° C מים במשך 35 דקות (חתם גם את צלוחיות כדי למנוע מתן מים כלשהו להיכנס צלוחיות).
4. הסר צלוחיות מן האמבטיה במים, ומצננים לטמפרטורת החדר.
5. הוסף 1 מ"ל אנהידריד אצטית לכל אחד כובע 3 מ"ל, reactivials בחוזקה, מערבולת באופן יסודי, ולאחר מכן לחמם של 75-80 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 25 דקות.
6. הסר צלוחיות מן האמבטיה במים, ומצננים לטמפרטורת החדר.

4. ההפרדה ומדידה

1. הוסף 1.5 מ"ל dichloromethane כדי שווי כל בקבוקון, בחוזקה, מערבולת ביסודיות.
2. הוסף 1 מ"ל 1M HCl כדי שווי כל בקבוקון, בחוזקה מערבולת באופן יסודי על מנת לאפשר פתרונות לשבת באין מפריע עד שני משפטים נפרדים, לשאוב ולזרוק את השלב העליון (מימית) באמצעות 1000 pipettor μL.
3. בפה אותהashion, לחלץ את השלב האורגני 3 פעמים אבל עם 1 מ"ל H ₂ O (לשלב האחרון כביסה, לנקוט משנה זהירות על מנת להבטיח כי כל שלב למעלה מימית הוסר).
4. לייבש את הפתרון הסופי באמצעות RapidVap ב 45 ° C (או יבש באמצעות גז חנקן אם רוצים).
5. להמיס 300 אתיל אצטט μL-הקסאן (1:1 v / v) והעברה 2 מ"ל ענבר בורג יתר צלוחיות עם הוספת נפח קטן וכובע בחוזקה.
6. על כימות, לנתח ידי GC-FID באמצעות סיליקה מותכת פולרי טור נימי: 30 מ 'אורך, 0.25 id מ"מ, 0.25 עובי הסרט אממ, בשלב נייח 5% פניל-, 95% מתיל-polysiloxane (DB-5 או שווה ערך) עם מימן או כמו גז ההליום הספק, על 0.5 זרימת מ"ל ^-1 דקות קבוע. כרומטוגרפיה עדיף על פרימיום שלבים "חסר תנועה" ו המוביל גז מימן, אך מקובל על הזנים הנפוצים יותר עם הליום. ההגדרות הן גלאי 300 מעלות צלזיוס, 400 מ"ל דקות ^-1 האוויר 30 מ"ל דקות ^-1 של חנקן והןאיפור מימן גזי. הזרקת ופרמטרים תנור הן כדלקמן: 1 הזרקת פיצול μL (30:1) עם כניסת GC נקבע על 250 ° C, טמפרטורת התנור הראשונית, 120 ° C; להחזיק 1 דקות, להגביר את טמפרטורת התנור ב -10 מעלות צלזיוס דקות. ^-1 עד 250 מעלות צלזיוס; להחזיק 2.5 דק ',. הרמפה עד 270 מעלות צלזיוס ב 20 ° C ^-1 דקות, להחזיק 2 דקות, כבש את 290 ° C על 20 ° C ^-1 דקות, להחזיק 5 דקות. התאם את הגז המוביל קצב הזרימה כך אינוסיטול, גלוקוזאמין נגזרים muramic חומצה elute ב 250 מעלות צלזיוס, ואת N-methylglucamine elutes ב 270 מעלות ג

5. נגזרת אימות

1. השתמש יינון רך LC-ESI-TOF-MS לזהות את יון מולקולרית לקבוע את המשקל המולקולרי של נגזרת.
2. השתמש GC-EI-MS-SIM או GC-EI-MSMS להגברת הרגישות לחקור יונים ממוקד של נגזרת.
3. השתמש ריאגנטים שכותרתו isotopically מרובות להכנת נגזרות את ולאחר מכן השתמש שינוי מסתמאותם נגזרים שכותרתו isotopically ב MS לחקור יון מולקולרית שברי יון.

6. נציג תוצאות

פרוטוקול של השיטה בעיקר כוללת ארבעה שלבים: חומצה העיכול, טיהור המדגם, derivatization ונחישות GC (איור 1). למשל ניתוח של גלוקוזאמין וחומצה muramic ממניות סטנדרטיים מדגם הקרקע מוצגת באיור 2. חוץ מזה גלוקוזאמין muramic חומצה, mannosamine ו galactosamine (שני איזומרים של גלוקוזאמין) ניתן גם לקבוע בו זמנית באמצעות השיטה. בהתבסס על גורמים תגובה של סטנדרטים לגבי פנימי רגילה מיו, אינוסיטול, אנו יכולים לכמת את סמנים ביולוגיים בדגימות קרקע. תקן התאוששות נעשה שימוש כדי לפקח על התהליך באופן איכותי derivatization. התבניות של היווצרות החומצה אצטט aldononitrile גלוקוזאמין muramic derivatized מוצגות באיור 3 .

המבנים המוצעים של נגזרים נקבעו על ידי GC-EIMS-SIM להגברת הרגישות, או יינון רך LC-ESI-TOF ^MS-8, המבנים המוצעים של שברי יון שנוצרו על יינון אלקטרונים נחקרו על ידי השוואת ספקטרום של יון דגימות מוכן עם incorporations איזוטופ שונים ^11. איור 4 מראה את המעבר ההמוני של יון הדומיננטי M / Z 187 של אצטט aldononitrile גלוקוזאמין derivatized בשלושה תרחישים, שהוכנו עם סוכנים שאינם שכותרתו, D-גפרית אלמימית אצטית, ו ^-13 U-C-גלוקוזאמין. מידע מפורט אחר הסברים ניתן התייחס לפרסומים האחרונים שלנו ^{8, 11.} אסטרטגיה זו יכולה לשמש מודל ללמוד כימיה נגזרת.

1. איור מדידה תרשים זרימה של פרוטוקול לניתוח של גלוקוזאמין וחומצה muramic באדמהדוגמאות. פרוטוקול בעיקר מכילה 4 שלבים: עיכול חומצה, טיהור, Derivatization ונחישות GC.

איור 2. GC-FID chromatograms של acetates aldononitrile של אינוסיטול, גלוקוזאמין, muramic חומצה, mannosamine, galactosamine ו methylglucamine עבור סטנדרטים ואדמה.

איור 3. ערכות עבור היווצרות של חומצה אצטט aldononitrile גלוקוזאמין muramic derivatized. המספר 1 מייצג תגובה nitrile. המספר 2 מייצג acetylation.

איור 4. ספקטרום המוני של אצטט aldononitrile גלוקוזאמין derivatized קשור structur יון הדומיננטיתes תחת מצב EI מוכן עם (א) גורמים שאינם שכותרתו, (ב) D-אצטית גפרית אלמימית, (ג) U ^-13 C-גלוקוזאמין. כוכב מייצג כבד איזוטופ אטום או קבוצה איזוטופ.

Discussion

הציג GC מבוססת השיטה לניתוח אצטט חומצה aldononitrile גלוקוזאמין muramic derivatized מספק שיטה מהירה יחסית לכמת אלה אמינו, סוכרים המופקים אדמה. הנגזרים הם יציבים מבחינה כימית, וכן ניתן לקבוע בניתוח אחד. השיטה אינה מצטמצמת אך דגימות קרקע, והוא יכול להיות פשוט יותר עבור דגימות של מטריקס...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
Muramic חומצה	Sigma-Aldrich	M2503-25mg
D-(+), גלוקוזאמין הידרוכלוריד	Sigma-Aldrich	G1514-100 גרם
N-methyl-D-glucamine	Sigma-Aldrich	M2004-500 גרם
מיו, אינוסיטול	פישר סיינטיפיק	A307003G025
מתנול (יבש)	Acros אורגניים	AC326950010
4-dimethylamino-פירידין	Acros אורגניים	AC148270050
אתיל אצטט	VWR הבינלאומי	BJGC100-4
Hydroxlamine hydrochloride	פישר סיינטיפיק	H330-100
פירידין	פישר סיינטיפיק	P368-500
אצטית אנהידריד	פישר סיינטיפיק	A10-100
Dichloromethane (מתילן כלוריד)	פישר סיינטיפיק	D37-500
הקסאן	פישר סיינטיפיק	H303-4
חומצה הידרוכלורית (6M)	פישר סיינטיפיק	S456-4
Hydroxylamine hydrochloride -15 N	הסמל שירותי	IN5280
אצטית -2 אנהידריד H (D 6 C 4 O 3)	Acros אורגניים	AC174670050
D-glucose-U -13 C	קיימברידג' איזוטופ במעבדה	CLM-1396-1
אמוניום sufate -15 N	קיימברידג' איזוטופ במעבדה	NLM-713-1
שם הציוד	חברה	סוג
Rapid-VAP	LabConco	790002
Vacum משאבת	KNF נויברגר	D-79112
הידרוליזה הבקבוק	פישר סיינטיפיק	06 423A
Derivatization microvial	פישר סיינטיפיק	06-100E
GC	Hewlett-Packard	6890
טרשת נפוצה	Hewlett-Packard	5972
LC-ESI-TOF-MS	Agilent	1200 Agilent מערכת סדרת HPLC מצמידים את LC Agilent / MSD-TOF