متعدد المعلمة قياس نفاذية المسام افتتاح المرحلة الانتقالية في القلب ماوس متفرقة الميتوكوندريا

Summary

ويرد بروتوكول spectrofluorometric لقياس نفاذية افتتاح الميتوكوندريا المسام الانتقال في قلب الفأر المعزول الميتوكوندريا هنا. الفحص ينطوي على قياس وقت واحد من الكالسيوم الميتوكوندريا ^{2 +} المناولة وحجم الميتوكوندريا الغشاء المحتملة والميتوكوندريا. وكما وصفت إجراءات الحصول على قلب عالية الجودة والوظيفية الميتوكوندريا.

Abstract

الانتقال نفاذية المسام الميتوكوندريا (mtPTP) هي قناة غير محددة التي تشكل غشاء الميتوكوندريا في الداخلية لنقل المواد المذابة مع الكتلة الجزيئية أصغر من 1.5 كيلو دالتون. على الرغم من أن هوية نهائية الجزيئي للمسام لا تزال قيد المناقشة، والبروتينات مثل D cyclophilin، وVDAC ANT تسهم في تشكيل mtPTP. بينما راسخة إشراك افتتاح mtPTP في موت الخلايا ^1، تتراكم الأدلة تشير إلى أن mtPTP يخدم دورا الفسيولوجية خلال كا ^{2 +} التوازن الميتوكوندريا ^2، والطاقة الحيوية الأكسدة يشير ^3.

يتم تشغيل mtPTP الافتتاح كا ^{2 +} مصفوفة ولكن يمكن أن يكون نشاطها عن طريق التضمين عدة عوامل أخرى مثل الإجهاد التأكسدي، ونضوب النوكليوتيدات الأدينين، تركيزات عالية من بي، الميتوكوندريا أو إزالة الاستقطاب الغشاء uncoupling، والأحماض الدهنية طويلة السلسلة ^4. في المختبر، mtPTP يمكن أن يكون افتتاح منظمة العمل ضد الجوعieved عن طريق زيادة تركيز الكالسيوم ^{+ 2} داخل المصفوفة الميتوكوندريا من خلال إضافات خارجية من الكالسيوم ^{2 +} (القدرة على الاحتفاظ الكالسيوم). عندما كا ^{2 +} المستويات داخل الميتوكوندريا التوصل إلى عتبة معينة، ويفتح mtPTP ويسهل كا ^{2 +} الإصدار، تبديد للبروتون القوة الدافعة، وانهيار غشاء المحتملة وزيادة في حجم مصفوفة الميتوكوندريا (تورم) الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى تمزق الميتوكوندريا الغشاء الخارجي وفقدان لا رجعة فيها وظيفة العضيم.

نحن هنا وصف فحص فلوروميتريك التي تسمح لتوصيف شامل لافتتاح mtPTP في قلب الفأر المعزول الميتوكوندريا. الفحص ينطوي على قياس وقت واحد من 3 معلمات الميتوكوندريا التي يتم تعديلها عند افتتاح mtPTP يحدث: الميتوكوندريا كا التعامل مع ^{+ 2} (امتصاص وإطلاق، مقاسا كا ^{2 +} تركيز على المدى المتوسط ​​الفحص)، وإمكانات غشاء الميتوكوندريا، وmitochondrial الحجم. الأصباغ المستخدمة لقياس الكالسيوم ^{2 +} على المدى المتوسط ​​وفحص غشاء الميتوكوندريا المحتملة هي FURA FF، وهي impermeant الغشاء، الذي يخضع لمؤشر ratiometric تحولا في الطول الموجي الإثارة في حضور كا ^{2 +،} وJC-1، وهي الموجبة، ratiometric المؤشر الذي يشكل مونومرات الأخضر أو ​​الأحمر في المجاميع المحتملة غشاء المنخفضة والعالية، على التوالي. يتم قياس التغيرات في حجم الميتوكوندريا عن طريق تسجيل تشتت الضوء من التعليق الميتوكوندريا. منذ مطلوبة عالية الجودة، الميتوكوندريا وظيفية للمقايسة افتتاح mtPTP، وصفنا أيضا الخطوات اللازمة للحصول على حالها، إلى جانب القلب معزولة للغاية وظيفية الميتوكوندريا.

Protocol

1. عزل الميتوكوندريا من القلب ماوس

1. لعزل الميتوكوندريا القلب، تخدير الفئران والتضحية وفقا للإجراءات التي وافقت عليها في منطقتك رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام.

ملاحظة: يجب إجراء جميع الخطوات للبروتوكول العزلة الميتوكوندريا على الجليد. استخدام مخازن الجليد الباردة والمثلجة قبل أطباق بتري، أنابيب ومواسير الصقر إيبندورف. وحدات التخزين الواردة في البروتوكول هي لعينة تحتوي على قلوب الماوس 2.

2. إزالة قلوب، ووضعها في مخزن بارد عزل الميتوكوندريا (300 السكروز مم، 10 مم نا HEPES، 200 ميكرومتر EDTA، ودرجة الحموضة 7.4) وشطف الدم.

ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، ينبغي تعديل الأس الهيدروجيني من مخازن الميتوكوندريا مع KOH وحامض الخليك.

3. قلوب مكان على طبق بيتري الباردة، وإزالة الدهون الأذينين، واللحم المفروم فرما ناعما باستخدام شفرة حتى الحصول علىجي منتج متجانسة.
4. نقل القلوب المفروم إلى أنبوب 50 مل الصقر، إضافة 10 مل من العازلة عزل الميتوكوندريا بنسبة 0.1 ملغ / مل التربسين والسماح للعينة لهضم على الجليد لمدة 10 دقيقة.

ملاحظة: أثناء إجراء التربسين العزلة يزيد من العائد من الميتوكوندريا المعزولة ويجب أن تبقى ثابتة بين الاستعدادات الميتوكوندريا. نوصي باختبار وظائف الميتوكوندريا على الاستعدادات عزل هو عدم وجود التربسين للتأكد من أن إنزيم لا تتداخل مع الوظيفة.

5. إضافة 10 مل من العازلة عزل الميتوكوندريا بنسبة 0.1٪ الدهنية حمض مجانا BSA و 5 ملغ مثبط التربسين (فول الصويا) وتخلط بواسطة الأنبوب مرات عدة قلب لتحييد التربسين.

ملاحظة: يمكن إعداد الميتوكوندريا العازلة عزل مقدما ويمكن تخزينها في -20 درجة مئوية. تحقق درجة الحموضة على الذوبان. يجب التربسين، التربسين المانع أو يكون BSAdded إلى المخزن المؤقت عزل الميتوكوندريا في يوم التجربة.

6. استرداد الأنسجة هضمها بواسطة الطرد المركزي بسرعة منخفضة إلى متوسطة لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية.
7. إعادة تعليق الأنسجة العازلة في 8 مل عزل الميتوكوندريا مع الأحماض الدهنية 0.1٪ BSA حرة والتجانس باستخدام الخالط Dounce الآلية مع مدقة تفلون (4-6 يمر في 1،200-14،00 دورة في الدقيقة). الحفاظ على عينة على الجليد بينما المجانسة.
8. نقل جناسة في أنبوب فالكون 15 مل والطرد المركزي في 800xg لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لكريات النوى والحطام الأنسجة.
9. استرداد طاف يحتوي على الميتوكوندريا في أنابيب الطرد المركزي إيبندورف وعند 8،000 x ج لمدة 15 دقيقة، في 4 درجات مئوية.
10. إزالة بعناية الطبقة العليا الأبيض وغسل ما تبقى من بيليه الميتوكوندريا تحتوي على أكثر قتامة في 1 مل العازلة عزل الميتوكوندريا.
11. أجهزة الطرد المركزي في 8000xg لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف بيليه الميتوكوندريا و resuspend في 150 ميكرولتر إيسولا الميتوكوندريانشوئها الاحتياطي. الحفاظ على الميتوكوندريا على الجليد لفحوصات أخرى.

ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج خلال المقايسات الفنية، استخدم الميتوكوندريا في غضون 4 ساعة من العزلة.

12. تحديد بروتين الميتوكوندريا باستخدام مقايسة برادفورد.

2. مراقبة جودة الميتوكوندريا المعزولة

2.1. قياس نسبة التحكم في الجهاز التنفسي (RCR)

1. معايرة الأكسجين الكهربائي مع Oxytherm الهواء المشبعة بالمياه لإنشاء خط الأكسجين الأقصى. عندما يتم الحصول على مستوى مستقر من الأكسجين إضافة 100 ميكرولتر من حل الطازجة 10 مللى hydrosulfite الصوديوم لإنشاء خط الأكسجين صفر. في أداء قياسات C. ° 30
2. إضافة 2 مل العازلة التنفس الميتوكوندريا (125 ملي بوكل، 20 HEPES ملي و 3 ملم MgCl _2، 400 ميكرومتر EGTA، 300 ميكرومتر DTT، 5 ملي KH ₂ PO _4، درجة الحموضة 7.2) ميكرومتر مع روتينون 1 إلى الدائرة Oxytherm، ختم الغرفة وبداية RECORقرع.
3. عندما إشارة الأكسجين مستقرة، إضافة 250 ميكروغرام الميتوكوندريا والتنفس القاعدية الرقم القياسي ل1 دقيقة. ينبغي للتنفس في هذه المرحلة تكون منخفضة جدا كما الميتوكوندريا هي تتنفس على ركائز الذاتية (حالة 1 التنفس).
4. إضافة 5 ملم وسكسينات إشارة الرقم القياسي ل1 دقيقة. يجب زيادة استهلاك الأوكسجين خلال التنفس 2 دولة.
5. حمل الدولة 3 التنفس عن طريق إضافة ADP ميكرومتر 150. وينبغي في هذه المرحلة زيادة استهلاك الأكسجين بسبب توليف ATP من خلال الفسفرة المؤكسدة. إشارة سجل حتى تبطئ التنفس، مشيرا إلى ADP الاستهلاك والتحول إلى الدولة 4 التنفس. سجل الدولة 4 التنفس لمدة لا تقل 1 دقيقة.
6. إضافة 1 ميكرومتر وCCCP إشارة الرقم القياسي ل1 دقيقة. يجب أن يكون التنفس فكت القصوى.

ملاحظة: تأثير على التنفس CCCP الميتوكوندريا هي الجرعة التي تعتمد: تركيزات عالية من CCCP يمكن أن تمنع استهلاك الأوكسجين وبالتالي يجب أن يكون بعناية رitrated.

7. حساب نسبة التحكم في الجهاز التنفسي (RCR) عن طريق قسمة معدل استهلاك الأكسجين أثناء التنفس الدولة 3 من الأكسجين أثناء التنفس معدل استهلاك 4 دولة. وينبغي أن يكون الهدف RCR يكون ≥ 4.

2.2. تقييم سلامة غشاء الميتوكوندريا (السيتوكروم ج اختبار)

1. اغسل غرفة Oxytherm مع الايثانول 70٪ والمياه وكرر الخطوات 2.1.2 -2.1.4.
2. إضافة 1 مم وADP سجل استهلاك الأكسجين لمدة 1 دقيقة.
3. إضافة 10 ميكرومتر ج السيتوكروم. منذ السيتوكروم ج غير منفذ للأغشية الميتوكوندريا سليمة، وزيادة في التنفس يشير الأغشية كسر أو تلف الميتوكوندريا.

3. قياس نفاذية افتتاح الميتوكوندريا مسام الانتقالية

1. الإعداد لمقياس التألق الطيفي لقياس متعددة المعلمة من فتح mtPTP. باستخدام برنامج FelixGx، إنشاء تكوين الأجهزة الجديدة (كوانتا ماجستير ستا ثابتالشركة المصرية للاتصالات) التي تتألف منها مصدر الضوء، مستوحد اللون الإثارة، حجرة العينة واثنين من أجهزة إنذار للالمتمركزة على 90 درجة و° 270 فيما يتعلق مستوحد اللون الإثارة (الشكل 4). لتحقيق أقصى القرار الوقت، يجب تعطيل كلا monochromators الانبعاثات (90 ° ° و270) والفلاتر الانبعاثات بنسبة 90 ° ° و270 في مقصورة عينة تمكين الأجهزة القائمة في التكوين. وهذه الخطوة إزالة التحكم في المحركات من موجات الانبعاثات وتحديد كل مستوحد اللون في طول موجة معين. إذا لم يتم تعطيل monochromators الانبعاثات سوف، ودورة بين كل من الأطوال الموجية وقياسات مكررة كل كاشف سيتم تسجيل.
2. إنشاء بروتوكول استحواذ جديدة باستخدام نوع موضوع صبغ وأدخل الأصباغ التالية:
   • FURA (الأعلى كا + +): 340 نانومتر الإثارة، 525 نانومتر الانبعاثات (كاشف 1)
   • FURA (الأقل كا + +): 380 نانومتر الإثارة، 525 نانومتر الانبعاثات (كاشف 1)
   • JC1 (الكلي): 543 نانومتر الإثارة، والانبعاثات 595 نيوتن متر (كاشف 2)
   • JC1 (مونومر): 498 نانومتر الإثارة، 525 نانومتر الانبعاثات (كاشف 1)
   • تورم: 525 نانومتر الإثارة، 525 نانومتر الانبعاثات (كاشف 1)
3. تعيين الشقوق الإثارة وانبعاث إلى 1 نانومتر ودرجة الحرارة إلى 37 ° C.
4. للحصول على إشارة لratiometric FURA وJC-1، توليد اثنين آثار المشتقة: FURA (الأعلى كا + +) / FURA (الأقل كا + +) وJC1 (إجمالي) / JC1 (مونومر).
5. ضبط الانبعاثات الطول الموجي يدويا للكشف عن 1 و 2 حتي 525 نانومتر ونانومتر 595، على التوالي.
6. مزيج 1 مل العازلة الفحص الميتوكوندريا (120 ملي بوكل، 10 ملي كلوريد الصوديوم، 1 ملم KH ₂ PO _{4 و} 20 ملي تريس، HEPES، ودرجة الحموضة 7.2) ميكرومتر مع روتينون 1 و 5 ملم وسكسينات 800 نانومتر FURA FF في جانب القابل للتصرف-4 ميتاكريليت كوفيت. إضافة 250 ميكروغرام الميتوكوندريا ومكان العينة في حجرة العينة. تأكد من تشغيل النمام المغناطيسي على.
7. بدء التسجيل. بعد 1 دقيقة، وقفة عملية الاستحواذ، إضافة 500 نيوتن متر JC-1 ثم قم بإعادة تشغيل علىcquisition. وينبغي الإشارة JC-1 نسبة زيادة، مشيرا إلى امتصاص الصبغة بواسطة الميتوكوندريا نشطة. مواصلة تسجيل حتى JC-1 إشارة قد وصلت إلى الهضبة (عادة في غضون 5 دقائق).
8. إضافة 20 ميكرومتر CaCl _2. ينبغي مراعاة زيادة فورية في إشارة FURA نسبة FF من وجود الكالسيوم ^{+ 2} زيادة في المخزن المؤقت فحص، تليها انخفاض تدريجي بسبب كا ^{2 +} الميتوكوندريا امتصاص. وينبغي الإشارة JC-1 نسبة انخفاض يحمل قصيرة عابرة طفيفة يدل على إزالة الاستقطاب غشاء الميتوكوندريا.
9. الانتظار حتى عودة FF FURA إشارة إلى نسبة مستوى القاعدية قبل إضافة آخر نبض CaCl ₂ (1-1.5 دقيقة). تواصل ينبض في فترات زمنية محددة حتى لا تتراكم الميتوكوندريا كا ^{2 +} والبدء في الافراج كا ^{2 +} الفحص في المخزن المؤقت. mtPTP الافتتاح تصور بزيادة في نسبة المتزامنة FURA إشارة FF بسبب كا ^{2 +} الإصدار، انخفاضا في نسبة الإشارة JC-1 بسبب غشاء بوتيهntial الانهيار، وانخفاض في تشتت الضوء بسبب تورم الميتوكوندريا (الشكل 5).
10. بعد تفعيل mtPTP، تحقق من خصوصية FF FURA، JC 1-تورم وإشارات على التوالي مع EGTA مم 1، CCCP 1 ميكرومتر و 5 ميكروغرام / مل alamethicin.
11. للتحقق من خصوصية افتتاح mtPTP، كرر الخطوات 3،6 حتي 3،9 في وجود من 1 ميكرومتر المانع من السيكلوسبورين cyclophilin D A (D cyclophilin هو مكون من mtPTP). في وجود السيكلوسبورين A، افتتاح mtPTP يتطلب أكثر بكثير من البقول CaCl ₂ عينات التحكم (الشكل 6).

4. ممثل النتائج

ويبين الشكل 2 عنصر تحكم نموذجي الجهاز التنفسي من القلب الماوس معزولة الميتوكوندريا. ويتحقق من قبل الدولة 3 التنفس إضافة إلى ADP تتنفس الميتوكوندريا على سكسينات، ويتميز استهلاك الأكسجين بشكل ملحوظ فيما يتعلق substraالشركة المصرية للاتصالات وحدها. وأضاف استنزاف ADP يبادر الدولة 4 التنفس خلالها استهلاك الأوكسجين يؤدي إلى إبطاء ويماثل معدلات يتحقق قبل إضافة ADP. يتم الحصول على RCR عن طريق قسمة معدل استهلاك الأكسجين للتنفس من قبل الدولة 3 أن للتنفس 4 دولة. ويستخدم الاختبار لفحص ج السيتوكروم على سلامة غشاء الميتوكوندريا الخارجي: عند إضافة السيتوكروم ج لتتنفس الميتوكوندريا على سكسينات وADP، أي زيادة أخرى في التنفس ويلاحظ، مما يدل على أن الأغشية سليمة الميتوكوندريا الخارجي (الشكل 3).

يظهر صورة ممثل لافتتاح mtPTP في القلب الميتوكوندريا المعزولة في الشكل 4. في هذه الحالة تم تشغيلها mtPTP الافتتاح إضافة البقول ₂ من 4 CaCl (20 ميكرومتر لكل منهما) على فترات دقيقة 1.5. افتتاح mtPTP هو واضح من قبل الافراج عن قرب في وقت واحد من الكالسيوم الميتوكوندريا ^{2 +} (الزيادة في نسبة إشارة FURA FF)، وانهيار mitochondالريال المحتملة غشاء (النقص في JC-1 إشارة نسبة) وحجم الميتوكوندريا زيادة (نقصان في إشارة تورم). عندما تتم إضافة السيكلوسبورين A، الذي يربط إلى المكون D cyclophilin من mtPTP، mtPTP افتتاح يتطلب 7 نبضات من CaCl ₂ بدلا من 4 (الشكل 5).

الشكل 1. الرسم البياني تدفق متعدد المعلمة الانتقال النفاذية الميتوكوندريا بروتوكول افتتاح المسام للقلب معزولة الميتوكوندريا. القلب هو المقطوع من الفئران ويتم عزل الميتوكوندريا من خلال الطرد المركزي المغاير. ثم يتم إعداد تقييم الميتوكوندريا نوعيا عن طريق قياس نسبة البولاروجرافي للتحكم في الجهاز التنفسي والأغشية الميتوكوندريا intactness في حضور ج السيتوكروم. يتم تشغيل الميتوكوندريا المسام الانتقال النفاذية في افتتاح الميتوكوندريا المعزولة بواسطة انا متتابعةيتم قياس L ₂ الإضافات ومع مقياس التألق الطيفي من خلال مراقبة كاليفورنيا الإفراج ^{+ 2} من الميتوكوندريا انهيار غشاء، وإمكانات وتورم في مصفوفة الميتوكوندريا.

الشكل 2. قياس الجهاز التنفسي نسبة التحكم (RCR) من القلب معزولة الميتوكوندريا. يتم قياس استهلاك الأوكسجين الميتوكوندريا المعزولة عن ظهر قلب خلال التنفس الدولة 3 في وجود سكسينات وADP، وأثناء التنفس 4 دولة بعد استهلاك ADP يتم قياس استجابة لعزل الميتوكوندريا uncouplers بإضافة CCCP. الأرقام على الرسم البياني هي نسب استهلاك الأوكسجين من قبل الميتوكوندريا المعزولة في نانومول / دقيقة / ملغم بروتين.

الشكل 3. قياس منة من سلامة غشاء القلب معزولة الميتوكوندريا. يتم تحديد سلامة غشاء الميتوكوندريا من خلال قياس استهلاك الأوكسجين في الميتوكوندريا المعزولة في وجود سكسينات وADP وبعد إضافة السيتوكروم ج. الأرقام على الرسم البياني هي نسب استهلاك الأوكسجين من قبل الميتوكوندريا المعزولة في نانومول / دقيقة / ملغم بروتين.

الرقم الأجهزة مقياس التألق الطيفي 4. تكوين لقياس متعددة المعلمة من فتح mtPTP. تكوين الأجهزة ليشمل مقياس التألق الطيفي مصدر الضوء، وهو مستوحد اللون الإثارة، حجرة العينة واثنين من أجهزة إنذار للموجات مع الانبعاثات عند 525 نانومتر الثابتة ونانومتر 595. ويستخدم كاشف 1 لكشف إشارة FURA FF ارتفاع وانخفاض الكالسيوم ^{2 +،} مونومر JC-1، وإشارة التورم. 2 التدابير للكشف عن إشارة JC-1 مجموع المباراتين.

jove_content "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما ">
الشكل 5. موضوع متعدد المعلمة قياس افتتاح mtPTP في قلب معزولة الميتوكوندريا. واندلعت mtPTP الافتتاح إضافات متتابعة من 20 ميكرومتر CaCl ₂ و تميزت كا ^{2 +} بيان من، الميتوكوندريا الميتوكوندريا الغشاء انهيار محتمل وزيادة حجم المصفوفة الميتوكوندريا (تورم). Extramitochondrial كا ^{2 +} وتم قياس غشاء المحتملة مع مؤشرات ratiometric FURA FF (الخضراء تتبع) وJC 1-(الأحمر التتبع). وقد تم قياس تورم الميتوكوندريا عن طريق تسجيل تشتت الضوء عند 525 نانومتر (التتبع السوداء). تم اختبار خصوصية JC-1 وإشارات تورم مع CCCP 1 و 5 ميكرومتر ميكروغرام / مل alamethicin (مادة سامة الميكروبية).

الشكل 6. موضوعالمعلمة قياس افتتاح mtPTP في قلب معزولة الميتوكوندريا في وجود السيكلوسبورين A. السيكلوسبورين A (1 ميكرومتر) يزيد من عدد النبضات ₂ CaCl المطلوبة لفتح mtPTP في قلب معزولة الميتوكوندريا.

Discussion

بروتوكول المعروضة هنا يصف الخطوات اللازمة لتقييم التجريبية افتتاح نفاذية المسام الانتقال في قلب معزولة الميتوكوندريا (الشكل 1 والشكل 4): إجراءات عزل الميتوكوندريا قلب الفأر، والضوابط التي تضمن سلامة الجهاز التنفسي وظيفة، المعلمات الميتوكوندريا خلال رصد mtP...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم
التربسين	سيغما الدريخ	T3030
التربسين المانع (فول الصويا)	سيغما الدريخ	T9128
الصوديوم hydrosulfite	سيغما الدريخ	71699
روتينون	سيغما الدريخ	R8875
ج السيتوكروم	سيغما الدريخ	C7752
Alamethicin	سيغما الدريخ	A4665
CCCP	سيغما الدريخ	C2759
السيكلوسبورين A	Calbiochem	239835
FURA FF	إينفيتروجن	F14180
JC-1	إينفيتروجن	T3168
طاحونة الأنسجة بوتر-Elvehjem مع تفلون 15 مل مدقة	ويتون للصناعات
النفقات العامة النمام	ويتون للصناعات	903475
Oxytherm (القطب درجة الحرارة الأكسجين للرقابة)	Hansatech الصكوك
QuantaMaster 80 مقياس التألق الطيفي الانبعاثات المزدوجة	الفوتون التكنولوجيا الدولية، وشركة