Multi-paramètres de mesure de l'ouverture des pores de transition de perméabilité dans le Cœur de souris mitochondries isolées

Résumé

Un protocole spectrofluorimétrique pour la mesure de l'ouverture de pore de transition de perméabilité mitochondriale dans les mitochondries isolées de souris coeur est présenté ici. Le test consiste à mesurer simultanément les mitochondries Ca ^{2 +} Manipulation, le volume potentiel de la membrane mitochondriale et mitochondrial. La procédure pour l'obtention de coeur et de grande qualité fonctionnelle des mitochondries est également décrit.

Résumé

Le pore de transition de perméabilité mitochondriale (mtPTP) est un canal non spécifique qui se forme dans la membrane mitochondriale interne pour transporter les solutés de masse moléculaire inférieure à 1,5 kDa. Bien que l'identité définitive moléculaire du pore est encore en débat, des protéines telles que la cyclophiline D, VDAC et ANT contribuer à mtPTP formation. Alors que la participation de l'ouverture mtPTP dans la mort cellulaire est bien établi ^1, l'accumulation de preuves indique que le mtPTP joue un rôle physiologique pendant mitochondrial homéostasie du Ca ^{2 + 2,} la bioénergétique et de signalisation redox ^3.

mtPTP ouverture est déclenchée par la matrice Ca ^{2 +,} mais son activité peut être modulée par de nombreux autres facteurs tels que le stress oxydatif, l'adénine nucléotide épuisement, de fortes concentrations de Pi, dépolarisation de la membrane mitochondriale ou de désaccouplement, et les acides gras à longue chaîne ^4. In vitro, mtPTP l'ouverture peut être achieved en augmentant la concentration de Ca ^{+ 2} à l'intérieur de la matrice mitochondriale par des ajouts exogènes de Ca ^{2 +} (capacité de rétention de calcium). Lorsque les niveaux de Ca ^{2 +} à l'intérieur des mitochondries atteindre un certain seuil, la mtPTP ouvre et facilite libération de Ca ^{2 +,} la dissipation de la force proton motrice, l'effondrement du potentiel de membrane et une augmentation de volume de la matrice mitochondriale (gonflement) qui conduit finalement à la rupture de la la membrane externe mitochondriale et la perte irréversible de la fonction des organites.

Nous décrivons ici un essai fluorimétrique qui permet une caractérisation complète de l'ouverture mtPTP dans le cœur de souris mitochondries isolées. Le test consiste à mesurer simultanément les 3 paramètres mitochondriaux qui sont modifiés lors de l'ouverture se produit mtPTP: mitochondrial Ca ^{2 +} (absorption et de libération, telle que mesurée par la concentration de Ca ^{2 +} dans le milieu d'essai), le potentiel de membrane mitochondriale, et mitochole volume ndrial. Les colorants utilisés pour la mesure de Ca ^{2 +} dans le milieu d'essai et le potentiel de membrane mitochondrial sont Fura FF, une membrane imperméant, indicateur logométrique qui subit un changement de la longueur d'onde d'excitation en présence de Ca ^{2 +,} et JC-1, cationique, Indicateur ratiométrique qui forme monomères verts ou rouges agrégats au potentiel de membrane haute et basse, respectivement. Les variations de volume mitochondrial sont mesurées par diffusion de la lumière par l'enregistrement de la suspension mitochondriale. Depuis de haute qualité, les mitochondries fonctionnelles sont nécessaires pour l'essai d'ouverture mtPTP, nous décrivons également les mesures nécessaires pour obtenir intacte, le cœur fortement couplé et fonctionnelles des mitochondries isolées.

Protocole

1. Isolement des mitochondries de cœur de souris

1. Pour isoler les mitochondries cardiaques, anesthésier et le sacrifice des souris, selon les procédures en vigueur de protection des animaux et du Comité institutionnel locale utilisation.

Remarque: Toutes les étapes du protocole d'isolement des mitochondries doivent être effectuées sur la glace. Utiliser des tampons glacées et pré-réfrigérés boîtes de Pétri, tubes et tubes Falcon Eppendorf. Les volumes indiqués dans le protocole sont pour un échantillon contenant 2 coeurs de souris.

2. Retirez les cœurs, les placer dans le tampon d'isolation froid mitochondries (300 mM de saccharose, 10 mM de Na-HEPES, 200 pM d'EDTA, pH 7,4) et rincer le sang.

Note: Pour des résultats optimaux, le pH des tampons mitochondriales doit être ajusté avec KOH et l'acide acétique.

3. Placer les coeurs sur un plat froid Petri, enlever la graisse et les oreillettes, et émincer finement à l'aide d'une lame jusqu'à obtenirtion d'un produit homogène.
4. Transfert cœur hachées dans un tube Falcon de 50 ml, ajouter 10 ml de tampon d'isolement mitochondries avec 0,1 mg / ml de trypsine et de permettre à l'échantillon à digérer sur la glace pendant 10 min.

Remarque: La trypsine pendant la procédure d'isolement augmente le rendement des mitochondries isolées et doit être maintenue constante entre les préparations mitochondriales. Nous recommandons de tester les fonctions mitochondriales sur les préparations isolées, c'est l'absence de trypsine afin de s'assurer que l'enzyme ne pas interférer avec la fonctionnalité.

5. Ajouter 10 ml de tampon d'isolement mitochondries avec 0,1% d'acides gras libres BSA et 5 mg d'inhibiteur de trypsine (soja) et mélanger par inversion fois le tube plusieurs pour neutraliser la trypsine.

Remarque: tampon d'isolement mitochondries peuvent être préparés à l'avance et peuvent être conservés à -20 ° C. Vérifier le pH lors de la décongélation. Trypsine, inhibiteur de la trypsine ou de BSA doit être undded dans le tampon d'isolement Mitochondries le jour de l'expérience.

6. Récupérez le tissu digéré par centrifugation à faible vitesse et à moyen pendant 1 min à 4 ° C.
7. Tissus Resuspendre dans 8 ml de tampon d'isolement mitochondries avec des acides gras libres 0,1% de BSA et homogénéiser à l'aide d'un homogénéisateur Dounce motorisé avec un pilon en téflon (4-6 passes à 1,200-14,00 rpm). Conserver l'échantillon sur la glace tout en homogénéisant.
8. Transfert homogénat dans un tube Falcon de 15 ml et centrifuger à 800xg pendant 10 min à 4 ° C à noyaux granulés et les débris de tissu.
9. Récupérer le surnageant contenant les mitochondries dans des tubes Eppendorf et centrifuger à 8000 xg pendant 15 min, à 4 ° C.
10. Retirez soigneusement la couche supérieure blanche et laver le culot contenant plus sombre restant de la mitochondrie dans 1 ml de tampon d'isolement mitochondries.
11. Centrifuger à 8000xg pendant 15 min à 4 ° C. Rejeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans la mitochondrie 150 pi Isola mitochondrialtion tampon. Gardez mitochondries sur la glace pour d'autres essais.

Remarque: Pour obtenir de meilleurs résultats lors des tests fonctionnels, utiliser des mitochondries dans les 4 heures de l'isolement.

12. Quantifier les protéines mitochondriales en utilisant le dosage de Bradford.

2. Contrôle de la qualité des mitochondries isolées

2,1. Mesure du rapport de contrôle respiratoire (RCR)

1. Étalonner l'électrode à oxygène avec Oxytherm eau saturée d'air pour établir la conduite d'oxygène maximale. Quand un niveau stable d'oxygène est obtenue, ajouter 100 ul d'une solution fraîchement préparée une solution à 10 mM de sodium hydrosulfite de mettre en place la ligne zéro oxygène. Effectuer des mesures à 30 ° C.
2. Ajouter 2 ml de tampon de respiration mitochondries (125 mM de KCl, 20 mM d'HEPES, MgCl2 3 _mM, EGTA 400 uM, 300 uM DTT 5 mM KH ₂ PO _4, pH 7,2) avec 1 uM roténone à la chambre Oxytherm, sceller la chambre et enre débutding.
3. Lorsque le signal d'oxygène est stable, ajouter 250 mg mitochondries et enregistrer la respiration basale pendant 1 min. La respiration à ce point devrait être très faible, comme les mitochondries sont respirants sur des substrats endogènes (respiration Etat 1).
4. Ajouter 5 mM de succinate et de signal d'enregistrement pendant 1 min. La consommation d'oxygène devrait augmenter au cours de la respiration Etat 2.
5. Induire la respiration État 3 par addition de 150 uM d'ADP. A ce point de la consommation d'oxygène devraient augmenter en raison de la synthèse d'ATP par phosphorylation oxydative. Signal d'enregistrement jusqu'à ce que la respiration ralentit, ce qui indique la consommation d'ADP et la transition vers l'état 4 respiration. Etat disque 4 respiration pendant au moins 1 min.
6. Ajouter 1 CCCP uM et signal d'enregistrement pendant 1 min. Respiration découplée doit être maximale.

Remarque: L'effet de CCCP sur la respiration mitochondriale est dose-dépendante: des concentrations élevées de CCCP peut inhiber la consommation d'oxygène et doivent donc être soigneusement titrated.

7. Calculer le rapport de contrôle respiratoire (RCR) en divisant le taux de consommation d'oxygène lors de la respiration État 3 par le taux de consommation d'oxygène pendant la respiration État 4. Un RCR cible doit être ≥ 4.

2,2. Évaluation de l'intégrité membranaire mitochondrial (cytochrome c test)

1. Laver soigneusement la chambre Oxytherm avec de l'éthanol à 70% et à l'eau et répétez les étapes 2.1.2 -2.1.4.
2. Ajouter 1 mM d'ADP et de la consommation d'oxygène record de 1 min.
3. Ajouter 10 uM cytochrome c. Depuis le cytochrome c est imperméable à l'intactes les membranes mitochondriales, une augmentation de la respiration indique cassés ou endommagés membranes mitochondriales.

3. La mesure de l'ouverture des pores de transition de perméabilité mitochondriale

1. Configurez le spectrofluorimètre pour la mesure multi-paramètres de l'ouverture mtPTP. Utilisation du programme FelixGx, créer une nouvelle configuration matérielle (Quanta maître sta stablete) comprenant la source de lumière, monochromateur d'excitation, un compartiment d'échantillon et deux détecteurs positionnés à 90 ° et 270 ° par rapport à la monochromateur d'excitation (Figure 4). Pour obtenir une résolution maximale de temps, les deux monochromateurs d'émission (90 ° et 270 °) doit être désactivé et les filtres d'émission à 90 ° et 270 ° dans le compartiment échantillon activé dans le menu de configuration matérielle. Cette étape permet de supprimer le contrôle moteur des longueurs d'onde d'émission et de fixer chaque monochromateur à une longueur d'onde particulière. Si les monochromateurs d'émission ne sont pas désactivés, chaque détecteur de cycle entre deux longueurs d'onde et des mesures en double seront enregistrées.
2. Créer un protocole d'acquisition à l'aide du type Multi Dye et entrez les colorants suivants:
   • Fura (haute Ca + +): excitation 340 nm, émission 525 nm (détecteur 1)
   • Fura (faible teneur en Ca + +): excitation 380 nm, émission 525 nm (détecteur 1)
   • JC1 (total): excitation 543 nm, Émission 595 nm (détecteur 2)
   • JC1 (monomère): excitation 498 nm, émission 525 nm (détecteur 1)
   • Gonflement: excitation 525 nm, émission 525 nm (détecteur 1)
3. Définissez les fentes d'excitation et d'émission à 1 nm et la température à 37 ° C.
4. Pour obtenir le signal ratiométrique pour Fura et JC-1, de générer deux traces dérivés: Fura (haute Ca + +) / Fura (faible teneur en Ca + +) et JC1 (total) / JC1 (monomère).
5. Ajuster manuellement la longueur d'onde d'émission de détecteurs 1 et 2 à 525 nm et 595 nm, respectivement.
6. Mélanger 1 ml du tampon de dosage mitochondries (120 mM de KCl, 10 mM NaCl, 1 mM KH ₂ PO _4, 20 mM HEPES-Tris, pH 7,2) avec 1 uM roténone, 5 mM de succinate et 800 nM Fura FF dans un jetable 4-faces le méthacrylate de cuvette. Ajouter un échantillon de 250 mg mitochondries et les placer dans le compartiment échantillon. Assurez-vous que l'agitateur magnétique est activé.
7. Démarrez l'enregistrement. Après 1 min, mettre en pause l'acquisition, ajouter 500 nM JC-1, puis redémarrez l'unecquisition. Le signal de JC-1 ratio devrait augmenter, indiquant absorption du colorant par les mitochondries actif. L'enregistrement jusqu'à JC-1 signal a atteint un plateau (généralement moins de 5 minutes).
8. Ajouter 20 uM CaCl _2. Une augmentation instantanée du signal Fura rapport FF doit être observé par l'augmentation de Ca ^{2 +} dans la présence du tampon de dosage, suivie d'une diminution progressive due à mitochondriale de Ca ^{2 +} absorption. Le signal de JC-1 ratio devrait présenter une diminution transitoire brève indicatif de dépolarisation de la membrane mitochondriale légère.
9. Attendre le retour de signal FF Fura rapport au niveau de base avant l'addition d'une autre impulsion CaCl ₂ (1-1.5 min). Continuer impulsions à intervalles fixes jusqu'à ce que les mitochondries ne peuvent pas s'accumuler Ca ^{2 +} et commencent à libérer le Ca ^{2 +} dans le tampon de dosage. ouverture mtPTP est visualisée par une augmentation simultanée du signal Fura rapport FF en raison de la libération de Ca ^{2 +,} une diminution du rapport signal JC-1 en raison de pote membranential effondrement, et une diminution de la diffusion de la lumière due à un gonflement des mitochondries (figure 5).
10. Après activation mtPTP, vérifier la spécificité de Fura FF, JC-1 et les signaux de gonflement respectivement avec 1 mM d'EGTA, 1 uM CCCP et 5 ug / ml alaméthicine.
11. Pour vérifier la spécificité de l'ouverture mtPTP, répéter les étapes de 3,6 à 3,9 en présence de 1 pM de la cyclosporine A cyclophiline D inhibiteur (cyclophiline D est un composant de la mtPTP). En présence de cyclosporine A, l'ouverture de la mtPTP nécessite beaucoup plus de CaCl ₂ impulsions que les échantillons de contrôle (figure 6).

4. Les résultats représentatifs

La figure 2 montre un contrôle typique respiratoire des mitochondries isolées cœur de souris. 3 état respiration est réalisé par addition d'ADP à respirant mitochondries de succinate, et se caractérise par une consommation d'oxygène sensiblement augmentée par rapport à la SUBSTRAte seul. L'appauvrissement de l'ADP ajouté État initiés 4 respiration, au cours de laquelle la consommation d'oxygène ralentit et est comparable aux taux obtenus avant l'addition d'ADP. RCR est obtenu en divisant le taux de consommation d'oxygène pour la respiration Etat 3 par celui de la respiration Etat 4. Le test de cytochrome c est utilisé pour doser l'intégrité de la membrane mitochondriale externe: lorsque le cytochrome c est ajouté à la mitochondrie qui respire le succinate et de l'ADP, aucune augmentation de la respiration est observée, indiquant une intactes extérieures membranes mitochondriales (figure 3).

Une image représentative de l'ouverture mtPTP dans les mitochondries isolées coeur est représenté sur la figure 4. Dans ce cas, l'ouverture mtPTP a été déclenchée par l'addition de 4 CaCl ₂ impulsions (20 uM de chacun) à intervalles de 1,5 min. ouverture mtPTP est évident par la libération simultanée de près mitochondrial Ca ^{2 +} (augmentation du signal Fura rapport FF), l'effondrement de mitochondpotentiel de membrane de rials (diminution de JC-1 rapport signal) et une augmentation du volume mitochondrial (diminution du signal de gonflement). Lorsque la cyclosporine A est ajouté, qui se lie à la composante cyclophiline D de mtPTP, ouverture mtPTP nécessite 7 impulsions de CaCl _{2 au} lieu de 4 (figure 5).

Figure 1. Schéma du multi-paramètre protocole de transition de perméabilité mitochondriale des pores d'ouverture de cœur mitochondries isolées. Cœur est récoltée à partir des souris et les mitochondries sont isolées par centrifugation différentielle. La préparation mitochondriale est ensuite évaluée par la mesure qualitative polarographique de la commande de rapport et respiratoire intact membrane mitochondriale en présence de cytochrome c. Mitochondrial ouverture de pore de transition de perméabilité dans les mitochondries isolées est déclenchée par séquentiel CaCl ₂ ajouts et est mesurée avec un spectrofluorimètre en surveillant libération de Ca ^{2 +} de l'effondrement membrane des mitochondries, le potentiel et le gonflement de la matrice mitochondriale.

Figure 2. Mesure d' rapport de contrôle respiratoire (RCR) de coeur mitochondries isolées. La consommation d'oxygène par les mitochondries isolées coeur est mesurée au cours de la respiration Etat 3 en présence de succinate et de l'ADP, et pendant 4 Etat respiration après consommation ADP. La réponse de mitochondries isolées de découpleurs est mesuré par l'addition de CCCP. Les chiffres sur le graphique sont les taux de consommation d'oxygène par les mitochondries isolées en nmol / min / mg de protéine.

Figure 3. Mesure tion de l'intégrité membranaire des mitochondries isolées de cœur. Intégrité de la membrane mitochondriale est déterminée en mesurant la consommation d'oxygène dans les mitochondries isolées en présence de succinate et de l'ADP et après l'addition de cytochrome c. Les chiffres sur le graphique sont les taux de consommation d'oxygène par les mitochondries isolées en nmol / min / mg de protéine.

Figure 4. Configuration matérielle Spectrofluorimètre pour la mesure multi-paramètres de l'ouverture mtPTP. La configuration matérielle du spectrofluorimètre comprend une source lumineuse, un monochromateur d'excitation, un compartiment pour un échantillon et deux détecteurs de longueurs d'onde d'émission fixe à 525 nm et 595 nm. Détecteur 1 est utilisé pour la détection du signal de Fura FF haute et faible teneur en Ca ^{2 +,} JC-1 monomère, et le signal de gonflement. Détecteur 2 mesure le signal JC-1 global.

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Figure 5. Multi-paramètre de mesure de l'ouverture mtPTP dans le cœur des mitochondries isolées. mtPTP ouverture a été déclenchée par additions successives de 20 M CaCl ₂ et a été caractérisé par la libération de Ca ^{2 +} par les mitochondries, l'effondrement du potentiel de membrane mitochondriale et une augmentation du volume de la matrice mitochondriale (gonflement). Extramitochondriale Ca ^{2 +} et le potentiel de membrane ont été mesurées avec des indicateurs ratiométriques Fura FF (vert trace) et JC-1 (rouge trace). Gonflement des mitochondries a été mesurée en enregistrant la diffusion de la lumière à 525 nm (trace noire). Spécificité de JC-1 et les signaux de gonflement a été testé avec 1 uM CCCP et 5 ug / ml alaméthicine (une toxine microbienne).

Figure 6. Multi-Paramètre de mesure de l'ouverture mtPTP dans le cœur des mitochondries isolées en présence de cyclosporine A. cyclosporine A (1 uM) augmente le nombre de CaCl ₂ impulsions nécessaires à l'ouverture mtPTP dans le cœur des mitochondries isolées.

Discussion

Le protocole présenté ici décrit les étapes nécessaires expérimentales pour évaluer ouverture de pore de transition de perméabilité dans le cœur des mitochondries isolées (Figure 1 et Figure 4): la procédure d'isolement de cœur de souris mitochondries, les contrôles des voies respiratoires en assurer l'intégrité et la fonctionnalité, les paramètres mitochondriaux surveillés pendant ouverture mtPTP et les colorants utilisés pour leur évaluation, la mise en pl...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
Trypsine	Sigma-Aldrich	T3030
Inhibiteur de la trypsine (soja)	Sigma-Aldrich	T9128
Hydrosulfite de sodium	Sigma-Aldrich	71699
La roténone	Sigma-Aldrich	R8875
Cytochrome c	Sigma-Aldrich	C7752
Alaméthicine	Sigma-Aldrich	A4665
CCCP	Sigma-Aldrich	C2759
Cyclosporine A	Calbiochem	239835
Fura FF	Invitrogen	F14180
JC-1	Invitrogen	T3168
Broyeur de tissu Potter-Elvehjem de Téflon pilon 15 ml	Industries Wheaton
Agitateur à hélice	Industries Wheaton	903475
Oxytherm (électrode à oxygène à température contrôlée)	Hansatech Instruments
QuantaMaster 80 spectrofluorimètre double émission	Photon Technology International, Inc