Parâmetro Multi-Medição da abertura dos poros transição de permeabilidade em mitocôndrias isoladas de coração Rato

Resumo

Um protocolo espectrofluorométrico para a medição da abertura do poro de permeabilidade mitocondrial transição de coração de rato isolado mitocôndrias é aqui apresentada. O teste envolve a medição simultânea de Ca mitocôndrias ^{2 +} Manuseamento, volume potencial de membrana mitocondrial e mitocondrial. O procedimento para a obtenção de coração e de alta qualidade funcional a mitocôndria é também descrito.

Resumo

A poro de transição da permeabilidade mitocondrial (mtPTP) é um canal não específico em que se forma a membrana mitocondrial interna para transportar solutos com uma massa molecular inferior a 1,5 kDa. Embora a identidade molecular definitivo do poro está ainda sob debate, proteínas tais como a ciclofilina D, e VDAC ANT contribuir para mtPTP formação. Embora a participação de abertura mtPTP na morte celular está bem estabelecido ^1, acumulação de provas indica que o mtPTP serve uma função fisiológica durante mitocondrial homeostase Ca ^{2 + 2,} bioenergética e redox sinalização ^3.

mtPTP abertura é desencadeada pela matriz de Ca ^{2 +,} mas a sua actividade podem ser moduladas por vários outros factores, tais como o stress oxidativo, o esgotamento de nucleótidos de adenina, altas concentrações de Pi, a despolarização da membrana mitocondrial ou desacoplamento, e os ácidos gordos de cadeia longa ^4. In vitro, mtPTP de abertura pode ser achieved por aumento da concentração de Ca ^{+ 2} no interior da matriz mitocondrial através da adição exógena de Ca ^{2 +} (capacidade de retenção de cálcio). Quando os níveis de Ca ^{2 +} no interior mitocôndrias atingir um determinado limite, o mtPTP abre e facilita a libertação ^de Ca2 ^+, a dissipação de força motriz de protões, colapso potencial de membrana e um aumento de volume da matriz mitocondrial (inchaço) que em última análise conduz à ruptura da membrana mitocondrial externa e perda irreversível da função organela.

Descrevemos aqui um ensaio fluorométrico, que permite para uma caracterização completa de mtPTP abertura de coração de rato isolado mitocôndrias. O teste envolve a medição simultânea de 3 parâmetros mitocondriais que são alteradas quando a abertura mtPTP ocorre: mitochondrial Ca ^{2 +} manuseamento (absorção e libertação, conforme medido por Ca ^{2 +} a concentração no meio de ensaio), o potencial de membrana mitocondrial, e mitochovolume de ndrial. Os corantes utilizados para o Ca ^{2 +} medida no meio de ensaio e o potencial de membrana mitocondrial são Fura FF, um impermeante de membrana, o indicador de medida proporcional que sofre uma mudança no comprimento de onda de excitação na presença de ^+, e JC-1, uma catiónica Ca ^2, indicador de medida proporcional que forma monómeros verdes ou agregados vermelhas no potencial de membrana de baixa e alta, respectivamente. As variações de volume mitocondrial são medidos através da gravação de dispersão da luz pela suspensão mitocondrial. Desde de alta qualidade, as mitocôndrias funcionais são necessárias para o ensaio de abertura mtPTP, também descrever os passos necessários para obter intacta, coração altamente acopladas e funcional mitocôndrias isoladas.

Protocolo

1. Isolamento de mitocôndrias de coração rato

1. Para isolar mitocôndria cardíaca, anestesiar e sacrificar animais de acordo com os procedimentos aprovados pelo seu Animal Care Institucional e Comitê local de uso.

Nota: Todos os passos do protocolo de isolamento de mitocôndrias deve ser executada em gelo. Use tampões de gelo frios e pratos pré-refrigerados de Petri, Falcon tubos e tubos Eppendorf. Os volumes indicados no protocolo são para uma amostra contendo 2 corações de rato.

2. Remover os corações, colocá-los em tampão de isolamento frio Mitocôndria (300 mM de sacarose, 10 mM de Na-HEPES, 200 mM EDTA, pH 7,4) e enxaguar sangue.

Nota: Para melhores resultados, o pH dos tampões mitocondrial deve ser ajustado com KOH e ácido acético.

3. Corações lugar em uma placa de Petri frio, retire a gordura e átrios, e pique finamente com uma lâmina até obterrelativa a um produto homogéneo.
4. Transferir corações picados para um 50 tubo Falcon ml, adicionar 10 ml de tampão de isolamento mitocôndrias com 0,1 mg / ml de tripsina e permitir que a amostra de digerir em gelo durante 10 min.

Nota: A tripsina durante o procedimento de isolamento aumenta o rendimento de mitocôndrias isoladas e deve ser mantido constante entre preparações mitocondriais. Recomendamos testar as funções mitocondriais em preparações isoladas é a ausência de tripsina para garantir que a enzima não interfira com a funcionalidade.

5. Adicionar 10 ml de tampão de isolamento mitocôndrias com 0,1% de BSA livre de ácidos gordos e 5 mg de inibidor de tripsina (soja) e misturar por vezes invertendo o tubo várias para neutralizar a tripsina.

Nota: tampão de isolamento Mitocôndrias podem ser preparadas com antecedência e pode ser armazenado a -20 ° C. Verificar o pH após a descongelação. Tripsina, inibidor de tripsina ou BSA deve ser umdded para o tampão de isolamento mitocôndrias no dia da experiência.

6. Recuperar o tecido digerido por baixo e médio da velocidade de centrifugação durante 1 min a 4 ° C.
7. Ressuspender o tecido em tampão de isolamento 8 ml mitocôndrias com 0,1% de BSA livre de ácido gordo e homogeneizar utilizando um homogeneizador Dounce motorizado com um pilão de Teflon (4-6 passagens em 1,200-14,00 rpm). Manter a amostra em gelo enquanto se homogeneíza.
8. Transferir homogeneizado num tubo Falcon de 15 ml e centrifugar a 800xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar os núcleos e os restos dos tecidos.
9. Recuperar o sobrenadante que contém as mitocôndrias em tubos de Eppendorf e centrifugar a 8000 xg durante 15 min, a 4 ° C.
10. Remova cuidadosamente a camada de top branco e lavar o restante mais escuro pellet contendo mitocôndrias em um tampão de isolamento ml mitocôndrias.
11. Centrifugar a 8000xg durante 15 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 150 ul mitocôndrias mitocondrial IsolaTampão ção. Manter em gelo mitocôndrias para ensaios posteriores.

Nota: Para obter melhores resultados durante os ensaios funcionais, use mitocôndrias dentro de 4 horas de isolamento.

12. Quantificar proteína mitocondrial utilizando o ensaio de Bradford.

2. Controle de Qualidade das mitocôndrias isoladas

2.1. Medição de índice de controle respiratório (RCR)

1. Calibra-se o eléctrodo de oxigénio Oxytherm com água saturada de ar para estabelecer a linha máxima de oxigénio. Quando um nível estável de oxigénio é obtida adicionando 100 ul de uma solução a 10 mM preparada de fresco de hidrossulfito de sódio, para estabelecer a linha de oxigénio zero. Realizar medições a 30 ° C.
2. Adicionar 2 ml de Tampão de respiração Mitocôndria (125 mM KCl, 20 mM de HEPES, 3 mM _de MgCl2, 400 mM de EGTA, 300 mM DTT, 5 mM de KH ₂ PO _4, pH 7,2) com 1 uM rotenona à câmara Oxytherm, vedar a câmara e recor inícioding.
3. Quando o sinal de oxigênio é estável, adicionar 250 mg mitocôndrias e respiração basal recorde de 1 min. A respiração, neste ponto deve ser muito baixo, como as mitocôndrias são respirando sobre substratos endógenos (respiração estado 1).
4. Adicionar 5 mM succinato e sinal recorde de 1 min. O consumo de oxigênio deve aumentar durante a respiração Estado 2.
5. Induzir a respiração Estado 3, incluindo 150 ADP fiM. Neste ponto o consumo de oxigénio deve aumentar devido à síntese do ATP através da fosforilação oxidativa. Sinal de gravação até que a respiração fica mais lento, indicando ADP consumo e transição para o estado 4 da respiração. Gravar estado 4 da respiração durante pelo menos 1 min.
6. Adicione 1 CCCP mM e sinal recorde de 1 min. Respiração desacoplada deve ser máxima.

Nota: O efeito da CCCP na respiração mitocondrial é dependente da dose: altas concentrações de CCCP pode inibir o consumo de oxigênio e, portanto, deve ser cuidadosamente titrated.

7. Calcule a razão do controle respiratório (RCR), dividindo a taxa de consumo de oxigênio durante o Estado respiração 3 pela taxa de consumo de oxigênio durante a respiração Estado 4. A RCR alvo deve ser ≥ 4.

2.2. Avaliação da integridade da membrana mitocondrial (ensaio do citocromo c)

1. Lave a câmara Oxytherm com etanol a 70% e água, e repetir as etapas 2.1.2 -2.1.4.
2. Adicione 1 mM ADP e consumo recorde de oxigênio para 1 min.
3. Adicionam-se 10 ^ M do citocromo c. Uma vez que o citocromo c é impermeável à intactas membranas mitocondriais, um aumento na respiração indica quebrados ou danificados membranas mitocondriais.

3. Medição da permeabilidade mitocondrial de abertura de poros de transição

1. Configure o espectrofluorímetro para a medição de parâmetros múltiplos de abertura mtPTP. Usando o programa FelixGx, criar uma nova configuração de hardware (Quanta sta mestre constantete) que compreende a fonte de luz, um monocromador de excitação, o compartimento da amostra e dois detectores posicionados a 90 ° e 270 ° em relação ao monocromador de excitação (Figura 4). Para atingir resolução de tempo máximo, dois monocromadores de emissão (90 ° e 270 °) deve ser desativado e os filtros de emissão em 90 ° e 270 ° no compartimento de amostra habilitado no menu de configuração de hardware. Esta etapa irá remover o controle motor dos comprimentos de onda de emissão e corrigir cada monocromador em um determinado comprimento de onda. Se os monocromadores de emissão não são deficientes, cada detector ciclo entre os dois comprimentos de onda e medições duplicadas será gravado.
2. Criar um protocolo de aquisição novo usando o tipo multi Dye e digite os seguintes corantes:
   • Fura (alto Ca + +): 340 nm de excitação, 525 nm de emissão (detector 1)
   • Fura (Ca + +) baixo: excitação 380 nm, 525 nm de emissão (detector 1)
   • JC1 (agregado): excitação 543 nm, Emissão 595 nm (detector 2)
   • JC1 (monómero): excitação 498 nm, emissão a 525 nm (detector 1)
   • Inchaço: excitação 525 nm, emissão a 525 nm (detector 1)
3. Definir as fendas de excitação e de emissão a 1 nm e a temperatura de 37 ° C.
4. Para se obter o sinal de medida proporcional para Fura e JC-1, geram dois traços derivados: Fura (alto Ca + +) / Fura (baixo Ca + +) e JC1 (agregado) / JC1 (monómero).
5. Ajustar manualmente o comprimento de onda de emissão de detectores 1 e 2 a 525 nm e 595 nm, respectivamente.
6. Mistura-se 1 ml de Tampão de Ensaio As mitocôndrias (120 mM KCl, 10 mM NaCl, 1 mM de KH ₂ PO _4, 20 mM de HEPES-Tris, pH 7,2) com 1 uM rotenona, 5 mM de succinato e 800 nM Fura FF num descartável de 4 faces cuvette metacrilato. Adicionar 250 mg de amostra mitocôndrias e colocar no compartimento de amostra. Certifique-se de que o agitador magnético está ligado.
7. Iniciar a gravação. Após 1 min, pausar a aquisição, adicionar 500 nM JC-1 e, em seguida, reiniciar o umQUISIÇÃO. O sinal de JC-1 proporção deve aumentar, indicando absorção do corante pela mitocôndria ativa. Continuar a gravar até que o sinal de JC-1 ter atingido um patamar (em geral, dentro de 5 min).
8. Adicionam-se 20 ^ M _de CaCl2. Um aumento instantâneo na proporção FF Fura sinal devem ser observados pelo aumento da presença de Ca ^{2 +} na solução tampão de ensaio, seguido de uma diminuição gradual devido a mitochondrial Ca ^{2 +} absorção. O sinal de JC-1 deve apresentar uma taxa de diminuição transitória breve indicativo de despolarização da membrana mitocondrial leve.
9. Espere até que Fura FF retornos de sinal relação ao nível basal, antes da adição de um outro pulso _de CaCl ₂ (1-1,5 min). Continue pulsando em intervalos fixos até que as mitocôndrias não pode acumular-se Ca ^{2 +} e começar a libertar ^{Ca2 +} para o tampão de ensaio. abertura mtPTP é visualizado por um aumento concomitante no sinal de relação de Fura FF devido à libertação ^de Ca2 ^+, uma redução na relação sinal JC-1, devido ao pote membranantial colapso, e uma diminuição da dispersão de luz devido a inchaço mitocondrial (Figura 5).
10. Após a activação mtPTP, verificar a especificidade de Fura FF, JC-1 e sinais de inchaço, respectivamente, com 1 mM de EGTA, 1 mM de CCCP e 5 ug / ml de alameticina.
11. Para verificar a especificidade da abertura mtPTP, repetir os passos 3,6-3,9, na presença de 1 uM do inibidor da ciclofilina D ciclosporina A (ciclofilina D é um componente do mtPTP). Na presença de ciclosporina A, a abertura da mtPTP requer significativamente mais CaCl ₂ pulsos do que as amostras de controlo (Figura 6).

4. Resultados representativos

A Figura 2 mostra um típico controle respiratório de coração de rato isolado mitocôndrias. Estado 3 da respiração é conseguido através da adição de ADP para respiradoras mitocôndrias em succinato, e é caracterizado por um consumo de oxigénio significativamente aumentada em relação ao substrate sozinho. Depleção de ADP adicionado Estado iniciados 4 respiração, durante o qual o consumo de oxigénio diminui e é comparável às taxas obtidas antes da adição de ADP. RCR é obtida dividindo-se a taxa de consumo de oxigénio para a respiração estado 3 da respiração por esse Estado 4. O citocromo c de teste é utilizado para ensaiar a integridade da membrana mitocondrial externa: quando o citocromo c é adicionado ao respiradoras mitocôndrias em succinato e ADP, qualquer aumento adicional na respiração é observada, indicando uma intactas exteriores das membranas mitocondriais (Figura 3).

Uma imagem representativa para a abertura mtPTP no coração mitocôndrias isoladas é mostrado na Figura 4. Neste caso, a abertura mtPTP foi desencadeada por adição de CaCl ₂ 4 pulsos (20 uM de cada) em intervalos de 1,5 min. abertura mtPTP é aparente pelo lançamento quase simultâneo de mitocondrial Ca ^{2 +} (aumento da taxa de Fura sinal FF), colapso do mitochondpotencial de membrana rial (diminuição do sinal de JC-1 ratio) e aumento do volume mitocondrial (diminuição do sinal de inchaço). Quando a ciclosporina A é adicionado, o qual se liga ao componente de ciclofilina D mtPTP, abertura mtPTP requer 7 pulsos de CaCl ₂ em vez de 4 (Figura 5).

Figura 1. Fluxograma da permeabilidade mitocondrial de parâmetros múltiplos transição de protocolo de abertura de poros para o coração mitocôndrias isoladas. Coração é colhida a partir de ratinhos e mitocôndrias são isoladas através de centrifugação diferencial. A preparação mitocondrial é então avaliado qualitativamente por medição polarográfico do índice de controlo respiratório e intacto membrana mitocondrial na presença de citocromo c. Permeabilidade mitocondrial de abertura de poros de transição em mitocôndrias isoladas é desencadeada por CaC sequenciall ₂ adições e é medida com um espectrofluorímetro monitorando Ca ^{2 +} lançamento do colapso da membrana da mitocôndria, potencial e inchaço da matriz mitocondrial.

Figura 2. Medição de razão do controle respiratório (RCR) de coração mitocôndrias isoladas. O consumo de oxigénio pelas mitocôndrias de coração isolado é medida durante a respiração Estado 3 na presença de succinato e ADP, e durante a respiração Estado 4, após o consumo de ADP. A resposta das mitocôndrias isoladas de desacopladores é medido pela adição de CCCP. Números no gráfico são as taxas de consumo de oxigénio por mitocôndrias isoladas em nmol / min / mg de proteína.

Figura 3. Medida mento da integridade da membrana do coração de mitocôndrias isoladas. A integridade da membrana mitocondrial é determinada por medição do consumo de oxigénio em mitocôndrias isoladas na presença de succinato e ADP e após a adição de citocromo c. Números no gráfico são as taxas de consumo de oxigénio por mitocôndrias isoladas em nmol / min / mg de proteína.

Figura 4. Espectrofluorómetro configuração de hardware para a medição de parâmetros múltiplos de abertura mtPTP. A configuração de hardware do espectrofluorómetro inclui uma fonte de luz, um monocromador de excitação, de um compartimento de amostra e dois detectores, com comprimentos de onda de emissão de 525 nm fixos e 595 nm. Detector 1 é usado para a detecção de sinais de Fura FF alto e baixo de Ca ^{2 +,} o monómero de JC-1, e o sinal de inchamento. Detector 2 mede o sinal de JC-1 agregado.

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Figura 5. Múltiplos parâmetros de medição da abertura mtPTP no coração mitocôndrias isoladas. abertura mtPTP foi desencadeada por adições sequenciais de 20 uM _de CaCl2 e foi caracterizado por Ca ^{2 +} a partir de mitocôndrias libertação potencial colapso, membrana mitocondrial e aumento de volume da matriz mitocondrial (inchaço). Extramitochondrial Ca ^{2 +} e o potencial de membrana foi medida com os indicadores de medida proporcional Fura FF (verde traço) e JC-1 (vermelho traço). Inchaço das mitocôndrias foi medido por espalhamento de luz a gravar a 525 nm (linha preta). Especificidade de JC-1 e sinais de inchaço foi testado com um CCCP uM e 5 ug / ml de alameticina (uma toxina microbiana).

Figura 6. Multi-Parâmetro de medição da abertura mtPTP no coração mitocôndrias isoladas na presença de ciclosporina A. A ciclosporina (1 uM), aumenta o número de CaCl ₂ impulsos necessários para abrir mtPTP no coração mitocôndrias isoladas.

Discussão

O protocolo aqui apresentado descreve os passos necessários experimentais para avaliar a permeabilidade da abertura do poro de transição no coração mitocôndrias isoladas (Figura 1 e Figura 4): o procedimento para o isolamento de coração de rato mitocôndrias, os controles respiratórias que assegurem a sua integridade e funcionalidade, os parâmetros monitorizados durante mitocondriais mtPTP abertura e os corantes utilizados para a sua medição, a criação da instrumentação ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Tripsina	Sigma-Aldrich	T3030
Inibidor de tripsina (soja)	Sigma-Aldrich	T9128
Hidrossulfito de sódio	Sigma-Aldrich	71699
Rotenona	Sigma-Aldrich	R8875
Citocromo c	Sigma-Aldrich	C7752
Alameticina	Sigma-Aldrich	A4665
CCCP	Sigma-Aldrich	C2759
A ciclosporina A	Calbiochem	239835
Fura FF	Invitrogen	F14180
JC-1	Invitrogen	T3168
Moinho de tecidos Potter-Elvehjem com um pilão de teflon de 15 ml	Wheaton Industries
Agitador suspenso	Wheaton Industries	903475
Oxytherm (temperatura do eléctrodo de oxigénio controlado)	Hansatech Instruments
QuantaMaster 80 espectrofluorímetro emissão dupla	Photon Technology International, Inc.