التحليل الكمي من Proteomes الكروماتين في الأمراض

Summary

وقد سمح التقدم في مطياف الكتلة لتحليل إنتاجية عالية البروتين التعبير والتعديل على مجموعة من الأنسجة. جنبا إلى جنب مع تجزئة التحت خلوية ونماذج المرض والكتلة الطيفي الكمي والمعلوماتية الحيوية يمكن أن تكشف عن خصائص جديدة في النظم البيولوجية. الطريقة الموضحة هنا يحلل لونين البروتينات المرتبطة في تحديد أمراض القلب وينطبق بسهولة إلى أخرى في الجسم الحي نماذج من الأمراض التي تصيب البشر.

Abstract

في النواة الموجودة في proteomes التي هي الأكثر ارتباطا وثيقا وظائف مرتبطة مع تنظيم الجينات. الكبار نوى cardiomyocyte الثدييات هي فريدة من نوعها نظرا لنسبة عالية من الخلايا binucleated، ¹ heterochromatic الدولة في الغالب من الحمض النووي، وطبيعة تقسيم غير من cardiomyocyte مما يجعل نوى الكبار في حالة دائمة من الطور البيني .. ² تنظيم الترانسكربتي خلال تطوير و وقد المرض مدروسة في هذا الجهاز، ^3-5 ولكن ما زال غير مستكشفة نسبيا هو الدور الذي تقوم به البروتينات النووية المسؤولة عن التعبئة والتغليف DNA والتعبير، وكيف يمكن لهذه البروتينات السيطرة تغييرات في برامج النسخ التي تحدث أثناء المرض. ⁶ في تطوير العالم، وأمراض القلب هي السبب الأول للوفيات لكل من الرجال والنساء .. ⁷ انسايت حول كيفية البروتينات النووية لتنظيم التعاون تطور هذا المرض أمر بالغ الأهمية للنهوض الحالية س العلاجيارات.

قياس الطيف الكتلي هو الأداة المثالية لمعالجة هذه الأسئلة لأنها تسمح للتعليق توضيحي متحيز للبروتيوم الكمي النووية والنسبية لكيفية وفرة من هذه البروتينات مع التغيرات المرض. في حين كانت هناك دراسات عدة عن البروتين البروتين الثدييات المجمعات النووية، ^8-13 وحتى وقت قريب كان هناك ¹⁴ دراسة واحدة فقط فحص القلب النووي بروتيوم، وأنها تعتبر نواة بأكملها، بدلا من استكشاف بروتيوم على مستوى حجرات فرعية النووية ¹⁵ في جزء كبير منه، هذا النقص في العمل ويرجع ذلك إلى صعوبة عزل نواة القلب. نوى القلب تحدث داخل جهاز أكتين الميوسين-جامدة وكثيفة لأنها التي ترتبط عبر ملحقات متعددة من الشبكة الإندوبلازمية، إلى الحد الذي يغير شكل خلية عضلية تقلص بشكل عام ¹⁶ بالإضافة إلى ذلك، cardiomyocytes هي 40٪ من حيث الحجم الميتوكوندريا ¹⁷ الذي necessitaقسم التدريب والامتحانات إثراء النواة وبصرف النظر عن العضيات الأخرى. نحن هنا وصف بروتوكول للتخصيب النووي وتجزئة القلب الى مزيد من حجرات بيولوجيا ذات الصلة. وعلاوة على ذلك، فإننا طرق بالتفصيل لتسمية خالية تشريح الشامل الكمي الطيفي لهذه الكسور تقنيات قابلة للتجريب في الجسم الحي في النماذج الحيوانية المختلفة وأجهزة الجسم حيث وضع العلامات الأيضية ليست مجدية.

Protocol

سير العمل التجريبي يحتوي على سبع خطوات رئيسية (الشكل 1). لأي عمل يستدعي العينات التي سيتم تشغيلها على مطياف الكتلة، يجب أن مجرب ارتداء معطف المختبر وقفازات وصافي الشعر والعناية لتجنب التلوث من الغبار وسفك الشخصية من الكيراتين.

1. التجانس القلب والعزلة النووية

والمتجانس قلوب الماوس ومعزولة وسليمة بيليه نوى (الشكل 2).

1. التضحية الماوس الكبار، واستئصال القلب وشطف في الجليد الباردة PBS، والتجانس على الجليد في dounce الزجاج (ونحن نفضل مطحنة الأنسجة ويتون من فيشر، # 08-414-13A، ولكن وسائل أخرى قد تعمل بشكل جيد على قدم المساواة) التي تحتوي على 2 مل من تحلل العازلة (ناقص التوتر الذي حل lyses تفاضلي غشاء الخلية على العضيات بما في ذلك النواة) (10 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، 15 مم كلوريد الصوديوم، و0.15٪ V / V-40 P Nonidet [40-NP] في الماء منزوع الأيونات زائد البروتيني والفوسفاتيز طويمكن تخزين العازلة تحلل لمدة تصل إلى أسبوع واحد في -20 ° C - 10 الزبدات الصوديوم ملم و 0.1 ملم فلوريد phenylmethylsulfonyl [PMSF]، 0.2 مم نا ₃ VO _4، 0.1 مم و 1 ناف روش البروتيني مل pellet/10: خليط nhibitor ). (ملاحظة: نحن لا نجد من الضروري أن يروي قلوب مع PBS، والبيانات المتوفرة لدينا مطياف الكتلة وتحليل GO تحديد البروتينات كما يغلب عليها الطابع cardiomyocyte [ف قيمة 3.8E-22] في الأصل بدلا من تلوث الدم قيمة P [5.0 E-2].)
2. صب حلالة من خلال مصفاة ميكرومتر 100 و جمع من خلال تدفق في 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي. عند هذه النقطة، ما لم ينص على ذلك، ينبغي الاحتفاظ العينة على الجليد.
3. أجهزة الطرد المركزي في 4،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في C. ° 4
4. إزالة طاف. (هذا هو العصارة الخلوية، ويجب أن يتم تخزين في -80 ° C. وهو يحتوي على الميتوكوندريا هي lysed.) إعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولتر العازلة تحلل من قبل الطحن. (هذا هو بيليه الخام النووية.)
5. ملء 1،5 مل أنبوب الطرد المركزي مع 1 مل من السكروز برتقاليإيه (24٪ سكروز الوزن / الحجم، 10 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، وكلوريد الصوديوم 15 مم في الماء منزوع الأيونات مع البروتيني / الفوسفاتيز خليط المانع - ينبغي بذل العازلة السكروز النقي في اليوم للاستخدام). طبقة بلطف بيليه معلق في أعلى لوحة السكروز وأجهزة الطرد المركزي في 5،000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة في C. ° 4
6. إزالة طبقة رقيقة على رأس وكذلك لوحة السكروز (التي تحتوي على الغشاء). شطف بيليه المتبقية مع 200 PBS الجليد الباردة ميكرولتر / EDTA (1X PBS مع EDTA ملي 1). (هذا هو بيليه نوى ويمكن solubilized أو ثابتة لاستخدامها في المجهر الإلكترون أو النشاف الغربية [انظر الخطوات 4.1 و 4.2] لتحديد التخصيب.)

2. جبلة النواة والمنظفات المستخرج تجزئة الكروماتين

يتم فصل كريات النوى الخام في جبلة النواة والمنظفات، استخراج جزء لونين، تتضمن البروتينات المرتبطة بشكل فضفاض مع DNA.

1. يسحن بيليه من الخطوة 1.6 في 200 ميكرولتر العازلة المنظفات استخراج (20 ملي HEPES 7.6 أس هيدروجيني، 7.5 ملم MgCl _2. ويمكن تخزين المنظفات العازلة استخراج لمدة تصل إلى أسبوع واحد في -20 ° C) - 0.2 ملم EDTA، 30 مم كلوريد الصوديوم، 1 M اليوريا، 1٪ NP-40 في الماء منزوع الأيونات مع البروتيني / الفوسفاتيز خليط المانع.
2. دوامة عينة 2 مرات، كل 10 ثانية. مكان على الجليد 10 دقيقة.
3. أجهزة الطرد المركزي في 13000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في C. ° 4
4. إزالة طاف. (هذا هو جبلة النواة ويجب أن يتم تخزين في C ° -80). شطف مع بيليه الجليد الباردة PBS / EDTA. (هذا هو بيليه لونين.)
5. يسحن بيليه في 300 ميكرولتر تريس، SDS، EDTA العازلة (50 ملي تريس درجة الحموضة 7.4، 10 ملم EDTA، 1٪ SDS في الماء منزوع الأيونات مع البروتيني / الفوسفاتيز خليط المانع - تريس، SDS، يمكن أن تظل EDTA العازلة لمدة تصل إلى أسبوع واحد في -20 ° C).
6. يصوتن 3-6 مرات لمدة 10 ثانية كل لتفريق DNA. الحفاظ على عينة الجليد بين sonications.
7. أجهزة الطرد المركزي في 13000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في C. ° 4 إبقاء طاف. (طاف هو المنظفات-المستخرج لونين البروتين fractioيجب أن تبقى في C N ° و-80). ينبغي أن بيليه المتبقية تكون صغيرة ويمكن التخلص منها.
8. إذا باستخدام myocytes معزولة بدلا من قلب كله: عزل الوليد myocytes البطين الفئران الفئران من الجراء يوم واحد بعد الولادة باستخدام الهضم الأنزيمي، تليها الثقافة في النسر Dulbecco المتوسطة المعدلة (DMEM) مع مصل بقري جنيني 10٪ (FBS)، الأنسولين 1٪ ترانسفيرين-الصوديوم سيلينيت (ITS)، و 1٪ البنسلين. بعد 24 ساعة، ونقل إلى المصل خالية من وسائل الإعلام (نفس النحو الوارد أعلاه، ولكنها تفتقر FBS). الحصاد في خلايا العازلة تحلل (المدرجة في 1.1)، والبدء في الخطوة تجزئة النووية 1.3.

3. استخراج حمض تجزئة - DNA البروتين محدد التخصيب

A يثري تجزئة منفصلة عن البروتينات بإحكام إلى DNA، بما في ذلك الهستونات.

1. كرر الخطوات 1،1-2،4.
2. يسحن على بيليه في 400 ميكرولتر لونين قدرها 0.4 حامض الكبريتيك N. دوامة لإزالة كتل.
3. احتضان في C ° 4 لمدة 30 دقيقة أو overnآيت حين تناوب.
4. الطرد المركزي في 16000 XG لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لإزالة الحطام النووية.
5. نقل طاف لأنبوب جديد.
6. إضافة 132 ميكرولتر من حمض الخليك ثلاثي الكلور إلى انخفاض طاف الحكيم. قلب عدة مرات. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
7. الطرد المركزي في 16000 XG لمدة 10 دقيقة في C. ° 4
8. تجاهل طاف. شطف بلطف مع بيليه الجليد الباردة الأسيتون. (هذا هو بيليه هيستون.)
9. الطرد المركزي في 16000 XG لمدة 10 دقيقة في C. ° 4
10. تكرار غسل، الخطوات 3،8-3،9.
11. الهواء الجاف بيليه.
12. إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر من تريس، SDS، EDTA العازلة. تعيين درجة الحموضة إلى 8 بإضافة 1 M تريس. (استخدم الأسهم (أ) 1 M تريس غير المعدلة وفقا للدرجة الحموضة).
13. يصوتن في حمام مائي لمدة 15 دقيقة. منع الانهاك عن طريق إضافة الثلج للحمام الماء. (وهذا هو جزء حمض المستخرجة ويجب أن يتم تخزين في درجة مئوية -80)

4. نقاء تحقق

البقع الغربية والمجهر الإلكترونيتؤكد تخصيب الناجح لنواة واستنزاف العضيات الأخرى. لرؤية نتائج نموذجية لجميع المقايسات مراقبة الجودة التالية، يرجى الاطلاع على نشر رسائلنا السابقة ¹⁸

1. أداء الغربية تحليل لطخة. غشاء التحقيق تحتوي على كل جزء لH2A هيستون أو nucleoporin P62 (كعلامات النووية للتحقق من التخصيب)، ونقل عن النوكليوتيدات الأدينين، BIP وتويولين (كعلامة الميتوكوندريا، هيولي باطني علامة شبكية، وعلامة هيكل الخلية على التوالي للتحقق من نقاء). للتحقق من subfractionation الناجح للمسبار، نواة لH3 هيستون أو fibrillarin (المنظفات والمواد الحمضية المستخرجة نواة لونين وسليمة) وSNRP70 أو E2F (جبلة النواة). دقق في الشبكية أو محرض نقص الأكسجة عامل-1 (المخصب في الكروماتين المنظفات استخراج أكثر من حمض المستخرج آسر). ويمكن أيضا التحكم في عينات إضافية من الخلايا المحللة وهيلا كله المحللة القلب يتم تشغيلها في نفس الجل: إعداد التحكم هيلا lysate الخلية عن طريق إضافة تريس، SDS، EDTA عازلة لصحن الثقافة واستخدام مكشطة الخلية لجمع العينة. يصوتن وأجهزة الطرد المركزي كما هو الحال في نموذج الخطوات 2،6-2،7. إعداد كامل السيطرة المحللة القلب بنسبة المجانسة في قلب مل العازلة 2 (20 ملي تريس درجة الحموضة 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم، EDTA 1 ملم، 1 ملم EGTA، 1٪ تريتون X-100، بيروفوسفات الصوديوم 2.5 ملم، 1 ملم في المياه جليسروفوسفات منزوع الأيونات مع البروتيني والفوسفاتيز خليط المانع). يصوتن وأجهزة الطرد المركزي كما هو الحال في الخطوات 2،6-2،7. انظر الخطوة 5 لإعداد العينات للبروتين SDS-PAGE.
2. المجهر الإلكتروني: إعادة تعليق بيليه نواة من 1.6 في خطوة تحلل العازلة التي تحتوي على 2٪ gluteraldehyde وتحديد العينة عند 4 ° C. شطف عينات الحمض في الأوسميك، يذوى، وتغرس في راتنجات الايبوكسي. قطع شرائح نانومتر باستخدام 70 Ultracut رايشرت مشراح مستدق. وصمة عار في عينات خلات اليورانيل ثم الرصاص والصورة باستخدام JEOL انتقال الإلكترون 100CX المجهر. تحديد تخصيب عن طريق قياس مجال نواة سليمة مقابل المساحة الإجمالية من المواد المصورة. نجد 60-80٪ من النوى إلىتكون سليمة ¹⁴

اعتبارات هامة لتخصيب مقابل تنقية نوى. وقد تم تطوير هذا البروتوكول لتمكينها من التحليلات البروتين لونين من القلب لغرض دراسة العمليات العالمية خلال تنظيم الجينات المرض. ومن العناصر الرئيسية في تصميم كامل بروتيوم تجارب مطياف الكتلة هي قضية النطاق الديناميكي والقدرة على تحديد وتوصيف المنخفضة وفرة البروتينات. بالإضافة إلى الهدف الأساسي من توفير المعلومات عن الأحياء النووية ومحددة لونين، وإثراء للبروتيوم النووية، ويزيد من احتمالية الكشف عن هذه البروتينات المنخفضة وفرة، كما يفعل subfractionation المزيد من النوى. ومع ذلك، كما تمت مناقشته، وcardiomyocyte الكبار على عنصر كثيفة هيكل الخلية مرتبطة الغشاء النووي. ونحن لا نعتقد أن لدينا تنقيته تماما من مكونات نواة هذه الخلايا الأخرى. ومع ذلك، من خلال إثراء فقط للنواة، لدينا الحصول علىإد وصف عتبة مقبولة لتمكين أنواع من التحليلات.

على وجه التحديد، وقد استخدمنا EM لتقييم نقاء نواة لدينا بيليه الخام وجدت 60-80٪ من الكسر ليكون نواة سليمة، ما يقرب من 10٪ الميتوكوندريا، وبقية الحطام. بالإضافة إلى ذلك، ونحن نعلم من دراستنا السابقة على السكان نواة سليمة، أنه في حين لا المخصب لل myofilaments العديد من هذا البروتوكول (بما في ذلك تويولين والأكتين التي تقاس الغربية) بروتينات معينة (calsarcin-1) هي المخصب، مما يشير إلى السكان صحيح البيولوجي لل هذه البروتينات في نواة القلب ¹⁹

بالإضافة إلى ذلك، قارنا البروتينات وجدنا أن تكون موجودة في جزء لونين حمض المستخرج، إلى الأدوار المتوقعة من هذه البروتينات من الأنطولوجيا الجينات. الأهم من ذلك، هذا التحليل الجيني الأنطولوجيا لا يأخذ بعين الاعتبار الوفرة النسبية من البروتينات المختلفة (كما يفعل البيانات المتوفرة لدينا لطخة غربية) لكنها تعتمد بدلا عن البروتينات المحددة (تخصيبإد أم لا) على قدم المساواة عند تحديد مسارات مشتركة ومقصورات الخلوية. ويمكن الاطلاع على تحليل هذه المسارات ومقصورات الخلوية في منشوراتنا السابقة. ^18،20 الأهم من ذلك أن نجاح التخصيب في جزء لونين حمض المستخرج سمح لنا للتعرف على وجود متغيرات من 54 هيستون في خلية عضلية الماوس الكبار، ¹⁸ اعتمد كثير منها على واحدة فريدة من نوعها لتحديد الببتيد، وبالتالي من المحتمل أن لا تم كشفها هذا البروتوكول دون تخصيب نظرا لتعقيد هائلة من بروتيوم cardiomyocyte الإجمالي. من البروتينات وجدناها 1048 من نواة القلب، وكانت 56 من هذه (5.3٪) المشروح بواسطة التحليل لتكون جزءا من النيوكليوسومات (أحد مكونات نواة الفائدة). دراسة أخرى تبحث في قلب كله، حددت 6180 البروتينات، والتي فقط 11 البروتينات (0.18٪) كانت المشروح لتكون جزءا من ال ²¹ النيوكليوسومات. هذا يوضح زيادة قوة جهدنا لبروتوكول meaningfuLLY إثراء للبروتينات نووية.

5. جل البروتين وهضم البروتينات الأنزيمية

يتم فصل البروتينات واحد الأبعاد SDS-PAGE والتربسين هضم ليتم تشغيلها على مطياف الكتلة.

1. ذوبان الجليد على الجليد وعينات تحديد تركيز البروتين لكل عينة باستخدام حمض bicinchoninic (BCA) فحص البروتين.
2. تخفيف عينات إلى تركيز المعروفة باستخدام 5X Laemmli العازلة، يغلي لمدة 10 دقيقة وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة الأبعاد SDS-PAGE. تخفيف عينات إلى تركيز اليوريا المعروف باستخدام العازلة استخراج وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة الأبعاد المواد الهلامية.
3. تشغيل هلام في الاختيار تحميل كمية متساوية من البروتين في كل حارة. يمكن نقل البروتين إلى غشاء النيتروسليلوز لاستخدامها في النشاف الغربية (كما هو الحال مع عناصر التحكم في الخطوة 4.1) أو يمكن خفض نطاقات لتحليل الطيف الكتلي، وانظر الخطوات التالية.
4. إزالة هلام من جهاز باستخدام الماء منزوع الأيونات نقله إلى وعاء نظيف.تغطية جل في الصفارية وصمة عار، والتفاف الحاويات في رقائق الألومنيوم لمنع الضوء. السماح لاحتضان جل في درجة حرارة الغرفة على شاكر لمدة لا تقل 90 دقيقة.
5. الصورة الملطخة الصفارية هلام (الشكل 3) استخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية، وعلامة حيث سيتم قطع العصابات على الصورة. قطع كل منا في حارة 2-العصابات حوالي 25 ملم للدراسات قياس بروتيوم الإجمالي.
6. وضع الجل على سطح نظيف. استخدام المواد الوحيدة التي ظلت مختومة أو يتم رش مع الايثانول لمنع التلوث الكيراتين. قطع كل نطاق، ومن ثم شريحة كذلك إلى 3 أقسام متساوية. وضع جميع القطع الثلاث معا في كل نطاق منها صفت أنبوب مل 1.5. ويمكن تخزين القطع هلام في -20 درجة مئوية لمدة عدة أشهر.
7. إعداد المقابس هلام لعملية الهضم الأنزيمي. خلاصة هلام باستخدام قطعة التربسين عند 37 درجة مئوية خلال الليل. لبروتوكول مفصلة جل عينة انظر نشر رسائلنا السابقة. ²² يمكنك الهضم منخفضة الوزن الجزيئي مع العصابات كيموتربسين بدلا من التربسين،للقضاء على الانقسام التربسين الواسعة من ذيول هيستون.

6. قياس الطيف الكتلي وتحليل البيانات

يتم فصل العينات على وتحليلها بواسطة LC MS / MS. يتم البحث الأطياف مقابل قاعدة بيانات لتحديد البروتين البروتين.

1. تشغيل 10 ميكرولتر من كل عينة من خلال LC / MS / MS. نستخدم النانو تدفق Eskigent LC مع عمود ميكرون 75 مرحلة عكسي. استخدام التشغيل LC الأمثل لمجموعة من البروتينات والببتيدات. توظيف الانحدار الخطي من الطور المتحرك A (الأسيتونيتريل حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ و 2٪ [ACN] في الماء) إلى الطور المتحرك B (حمض الفورميك بنسبة 0.1٪، والمياه بنسبة 20٪ في ACN): 60 دقيقة من 5٪ B الطور المتحرك إلى 50 B٪، ثم 15 دقيقة من B 50٪ إلى 95٪ B، وأخيرا 10 دقيقة في 95٪ ثابت B. استخدام معدل التدفق من 200 NL / دقيقة. الحصول على بيانات مطياف الكتلة في وضع البيانات التابعة. نحن نستخدم الحرارية التي Orbitrap شظايا أعلى 6 أيونات الرئيسي الأكثر وفرة.
2. تكرار يمتد لثلاثة على الأقل البيولوجية ويعيد التقنيتين. (Recommended)
3. استخدام البرمجيات (الخيارات المتاحة تجاريا تشمل BioWorks وXcalibur؛! الخيارات المتاحة علنا ​​تشمل جوس، جنبا إلى جنب X، SpectraST) للبحث الأطياف مقابل قاعدة البيانات عن طريق اختيار Uniprot من خوارزمية البحث (مثل SEQUEST أو MASCOT).
4. النظر في تعديل معلمات البحث للسماح للأكسدة carbamidomethylation السيستين والميثيونين، واثنين من التعديلات المشتركة التي أنشئت خلال تجهيز العينات.
5. حساب معدل إيجابية كاذبة باستخدام البحث العكسي قاعدة البيانات.
6. تصفية البروتين لتحديد الهوية فقط نقبل مباريات ثقة العتبة. نوصي المعلمات التالية لتبدأ: Xcorr> 3 (+2)،> 4 (+3)،> 5 (+4)؛ deltaCN التسامح> 0.1، درجة الإجماع ≥ 20، 2 دا التسامح الشامل لايون الأم والكتلة من 0.5 دا لايون المنتج، على الأقل 2 الببتيدات فريدة من نوعها في البروتين و 3 لا يزيد غاب الانشقاقات.

7. التسمية خالية الكمي

Determine الوفرة النسبية للبروتينات باستخدام التسمية خالية من الكميات (الشكل 4).

1. وهناك عدد من البرامج هي علانية أو لتحديد الكميات المتاحة تجاريا التسمية خالية من البيانات بما في ذلك مطياف الكتلة Elucidator ²³ التعداد (مجموعة الأستاذ ييتس ')، (مايكروسوفت)، ²⁴ غربال (الحرارية العلمية)، ²⁵ سقالة (بروتيوم البرمجيات) ²⁶ هذه البرامج تهدف إلى ربط إشارة الشامل الطيفي من الببتيدات سليمة أو عدد الببتيد الأحداث التسلسل مع كميات البروتين النسبية بين دولتين أو أكثر من الدول.
2. بينما يتضمن كل برنامج خط أنابيب تحليل مماثل، وتقتصر بعض البرامج إلى أنواع محددة من التحليل التي يمكن القيام بها على البيانات. في البداية، يتم محاذاة البيانات من أشواط مختلفة، وتطبيع كثافة إشارة ويتم اختيار قمم الببتيد للتحليل.
3. الطريقتين الأكثر شيوعا هي الكمي يعتمد على عد الطيفية أو LC-MS منطقة الذروة. وفرةوتحسب نسب لتحديد التغيرات في وفرة الببتيد بين المجموعات المختلفة.
4. يمكن لهذه البرامج أن تكون ربطه مع خوارزميات البحث البروتين (التميمة، SEQUEST، X! جنبا الى جنب) لربط المعلومات لتحديد الكمي البروتين.
5. لضمان الدقة واستنساخ البيانات لا بد من دمج كل من البيولوجي (مختلف نماذج تجريبية) والتقنية (تشغيل نفس العينة على مطياف الكتلة عدة مرات) يعيد للبيانات المواصفات الشامل.
6. ويمكن تقييم التباين في وفرة الببتيد وبين الظروف التجريبية من ANOVA وتآمر عبر PCA (الشكل 5).

اعتبارات هامة لتحديد الكميات التسمية مجانا. عند تنفيذ التسمية خالية من تحديد الكميات، لا بد من إيلاء اهتمام خاص لضمان اتساق إعداد العينات، والوقت وظروف LC-MS/MS الهضم ويجب أن تتم معالجة كل عينة وتحليلها بشكل منفصل. وعلى النقيض من الحدمصنوعة نهج وضع العلامات abolic، مقارنات في التسمية خالية من التجارب على بيانات من مطياف الكتلة متميزة يعمل (لأن عدم وجود وسم يغني عن إمكانية تشغيلها معا)، مما يجعل من الضروري استنساخ عالية في جميع جوانب تحليل العينة (أي من عينة الإعدادية، والخطوات LC MS) واستخدام عالية الدقة الطيف الشامل الشامل.

قد لمراعاة التغييرات الطفيفة في إعداد العينات وتحليلها على مستوى المعروف أن تضاف إلى كل عينة للمساعدة في تطبيع البيانات. بالإضافة إلى ذلك، معظم برامج البرمجيات تسمح تطبيع كثافة إشارة (مثل من خلال تعديل للضجيج في الخلفية أو المعروفة وفيرة الحليلة) بعد الحصول على البيانات لحساب الاختلافات في التأين، والحقن والتجزئة. خوارزميات المحاذاة موجودة في معظم البرامج المشار إليها أعلاه التي تساعد في تصحيح الاختلافات في ملامح شطف الببتيد. استخدام مكررات البيولوجية والتقنية ايسنقيمه في هذا النوع من الدراسة، لأنه يتيح التحليلات الإحصائية للتأكد من اتساق واستنساخ أي التغيرات الملحوظة في وفرة البروتين.

النتائج

الشكل 4 يسلط الضوء على فائدة هذا النوع من القياس الكمي النسبية. هو موضح في اللوحة اليمنى هي الببتيد الفردية قمم monoisotopic (مضافين من الفئران مختلفة)، والتي تم تعيينها على أنها تنتمي إلى HMGB1 البروتين (التي تم تحديدها من خلال البحث في قاعدة البيانات). كل الذروة، في ?...

Discussion

وقد استعرضت طريقتين رئيسيتين لعزل النووية سابقا: ²⁷ واحد هو أسلوب بيرنس من المجانسة الأنسجة مجفف بالتجميد في المذيبات غير المائية، والثاني، وهو التعديل الذي نستخدمه هنا، من التجانس في الأنسجة السكروز المائي / محلول الملح يتبع بواسطة الطرد المركزي أو الفرق الكث...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم
Dulbeco معدلة النسر متوسطة	إينفيتروجن	11965
البروتيني بيليه	روش	04 693 159 001
100 ميكرون مصفاة	BD الصقر	352360
Ultracut مشراح مستدق	رايشرت
100CX ناقل الكترون مجهر	JEOL الولايات المتحدة الأمريكية، وشركة
الصفارية	BioRad	161-0496
هيستون H2A الأجسام المضادة	سانتا كروز	SC-8648
Nucleoporin P62 الأجسام المضادة	BD العلوم البيولوجية	610498
الأدينين nucleoالمد نقل الأجسام المضادة	سانتا كروز	SC-9299
BIP الأجسام المضادة	سانتا كروز	SC-1050
تويولين الأجسام المضادة	سيجما	T1568
هيستون H3 الجسم المضاد	Abcam	ab1791
Fibrillarin الأجسام المضادة	خلية اشارة	C12C3
SNRP70 الأجسام المضادة	Abcam	ab51266
E2F-1 الضد	الحرارية فيشر	MS-879
الأجسام المضادة الشبكية	BD العلوم البيولوجية	554136
نقص الأكسجين عامل محرض الأجسام المضادة-1	نوفوس البيولوجية	NB100-469
BCA البروتين مقايسة	الحرارية العلمية	23227
عكس العمود المرحلة	الكائنات الجديدةECTIVE	PFC7515-B14-10
BioWorks متصفح	الحرارية العلمية