Analisi quantitativa di proteomi cromatina nella malattia

Riepilogo

I progressi nella spettrometria di massa hanno permesso l'analisi ad alta velocità di espressione della proteina e la modifica in una miriade di tessuti. In combinazione con frazionamento subcellulare e modelli di malattia, di massa quantitativa spettrometria e bioinformatica può rivelare nuove proprietà nei sistemi biologici. Il metodo qui descritto analizza cromatina proteine ​​associate alla regolazione di malattie cardiache ed è facilmente applicabile ad altre In vivo Modelli di malattie umane.

Abstract

Nel nucleo risiedono le proteomi le cui funzioni sono più intimamente collegati con regolazione genica. Adulto nuclei cardiomiociti mammiferi sono unici a causa della elevata percentuale di cellule binucleated, ¹ lo stato prevalentemente eterocromatico del DNA, e la non divisione natura del cardiomiociti che rende nuclei adulto in uno stato permanente di interfase. ² Regolazione trascrizionale durante lo sviluppo e la malattia sono stati ben studiati in questo organo, ^3-5 ma ciò che rimane relativamente inesplorato è il ruolo svolto dalle proteine ​​nucleari responsabili per il confezionamento del DNA e di espressione, e di come queste proteine ​​controllare i cambiamenti nei programmi trascrizionali che si verificano durante la malattia. ⁶ Nella sviluppato mondo, la malattia di cuore è la causa numero uno di mortalità sia per gli uomini e le donne. ⁷ Insight su come proteine ​​nucleari cooperano per regolare la progressione di questa malattia è fondamentale per far progredire l'attuale trattamento opzioni.

La spettrometria di massa è lo strumento ideale per affrontare queste domande in quanto permette una annotazione imparziale della quantificazione nucleare proteoma e relativo per come l'abbondanza di queste proteine ​​cambiamenti con la malattia. Mentre ci sono stati diversi studi di proteomica per mammiferi complessi proteici nucleari, ^8-13 fino a poco tempo ¹⁴ vi è stato un solo studio che esamina la proteoma cardiaco nucleare, ed è considerato il nucleo intero, piuttosto che esplorare il proteoma a livello di compartimenti sub nucleari . ¹⁵ In gran parte, questa carenza di lavoro è dovuta alla difficoltà di isolare nuclei cardiaca. Nuclei cardiaca avvenire entro un rigido e denso actina-miosina dell'apparecchio a cui sono collegati tramite estensioni multiple dal reticolo endoplasmatico, nella misura in cui altera contrazione miociti loro forma complessiva. ¹⁶ Inoltre, cardiomiociti sono il 40% in volume mitocondri ¹⁷ che necessitates arricchimento del nucleo parte le altri organelli. Qui si descrive un protocollo per cardiaca arricchimento nucleare e ulteriore frazionamento in compartimenti biologicamente rilevanti. Inoltre, i metodi di dettaglio per l'etichetta senza dissezione massa quantitativa spettrometria di queste frazioni-tecniche suscettibili di sperimentazione in vivo in vari modelli animali e sistemi di organi in cui marcatura metabolica non è fattibile.

Protocollo

Il flusso di lavoro sperimentale contiene sette fasi principali (Figura 1). Per ogni lavoro che coinvolge i campioni che verranno eseguiti sul spettrometro di massa, lo sperimentatore deve indossare un camice da laboratorio, guanti e retina per capelli e fare attenzione per evitare la contaminazione da polvere e spargimento personale di cheratina.

1. Cuore Omogeneizzazione e isolamento nucleare

Cuore di topo sono omogeneizzare e una intatta nuclei pellet è isolato (Figura 2).

1. Sacrificio topo adulto, accisa il cuore, sciacquare in ghiaccio PBS freddo, e omogeneizzare sul ghiaccio in Dounce vetro (noi preferiamo il Grinder Tissue Wheaton da Fisher, # 08-414-13A, ma altri metodi possono funzionare altrettanto bene) contenente 2 ml di tampone di lisi (una soluzione ipotonica che lisa differenziale la membrana cellulare negli organelli tra il nucleo) (10 mM Tris pH 7,5, 15 mM NaCl, e 0,15% v / v Nonidet P-40 [NP-40] in acqua deionizzata più proteasi e fosfatasi imiscela nhibitor: 10 butirrato di sodio mM, 0.1 mM fluoruro fenilmetilsulfonil [PMSF], 0,2 mM Na ₃ VO _4, 0.1 mM NaF e 1 Roche proteasi pellet/10 ml - tampone di lisi può essere conservato per un massimo di una settimana a -20 ° C ). (Nota: Non troviamo necessario perfusione i cuori con PBS, come dati di massa e spettrometria nostri GO analisi identificare le proteine ​​come prevalentemente cardiomiociti [p-value 3.8E-22] in origine piuttosto che la contaminazione del sangue [p valore di 5,0 E-2].)
2. Versare lisato mediante filtro da 100 micron e raccogliere il flusso attraverso in 1,5 ml di tubo di centrifuga. A questo punto, se non specificato, campione deve essere tenuta in ghiaccio.
3. Centrifugare a 4000 rpm per 5 min a 4 ° C.
4. Rimuovere il surnatante. (Questo è il citosol, e deve essere conservato a -80 ° C. Contiene mitocondri lisato.) Risospendere il precipitato in 200 microlitri di tampone di lisi triturando. (Questa è l'nucleare grezzo pellet.)
5. Riempire 1,5 ml provetta da centrifuga con 1 ml di appassionato di saccarosioer (peso saccarosio 24% / volume, 10 mM Tris pH 7,5, e 15 mM di NaCl in acqua deionizzata con proteasi / inibitore miscela fosfatasi - tampone saccarosio deve essere reso fresco il giorno di utilizzo). Delicatamente strato sedimento risospeso su sopra il pannello di saccarosio e centrifugare a 5000 rpm per 10 minuti a 4 ° C.
6. Rimuovere la pellicola sopra così come il pad saccarosio (che contengono membrana). Risciacquare il restante pellet con 200 pl ghiacciata PBS / EDTA (1x PBS con 1 mM EDTA). (Questa è l'nuclei pellet e può essere solubilizzato o fissati per uso in western blotting o microscopia elettronica [Vedere fasi 4.1 e 4.2] per quantificare arricchimento.)

2. Nucleoplasma e detergente-estratto Frazionamento cromatina

Il grezzo nuclei pellet viene separato in una nucleoplasma e detergente-estratta frazione cromatina, contenente proteine ​​liberamente associate al DNA.

1. Triturare pellet dal punto 1,6 in 200 microlitri di buffer di estrazione detergente (20 mM HEPES pH 7,6, 7,5 mM MgCl _2. 0,2 mM EDTA, 30 mM NaCl, 1 M Urea, 1% NP-40 in acqua deionizzata con proteasi / inibitore miscela fosfatasi - estrazione tampone detergente può essere conservato fino ad una settimana a -20 ° C).
2. Vortex campione di circa 2 volte, ogni 10 sec. Posto su ghiaccio 10 min.
3. Centrifugare a 13.000 rpm per 5 min a 4 ° C.
4. Rimuovere il surnatante. (Questa è nucleoplasma e deve essere conservato a -80 ° C). Sciacquare pellet con ghiacciata PBS / EDTA. (Questo è il pellet cromatina.)
5. Triturare pellet in 300 ml di Tris, SDS, EDTA (50 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1% SDS in acqua deionizzata con proteasi / inibitore miscela fosfatasi - Tris, SDS, EDTA può essere conservato fino ad una settimana al -20 ° C).
6. Sonicare 3-6 volte per 10 secondi ciascuna per rompere il DNA. Tenere campione su ghiaccio tra sonications.
7. Centrifugare a 13.000 rpm per 5 min a 4 ° C. Conservare il surnatante. (Supernatante è il detergente-estratto cromatina proteine ​​frazionamenton e deve essere conservato a -80 ° C). Il restante pellet dovrebbe essere piccolo e può essere scartato.
8. Se si utilizza invece miociti isolati del cuore: Isolare miociti ventricolari neonatali di ratto da ratti di un giorno dalla nascita tramite digestione enzimatica, seguita da coltura in Dulbecco modified Eagle medium (DMEM) con 10% di siero fetale bovino (FBS), 1% di insulina transferrina sodio selenite (ITS), e 1% di penicillina. Dopo 24 ore, il trasferimento di mezzi privi di siero (come sopra, ma privo di FBS). Cellule della raccolta, in tampone di lisi (elencati al punto 1.1), e iniziano frazionamento nucleare nella fase 1.3.

3. Acid-estrazione Frazionamento - DNA-proteina legato Enrichment

Si arricchisce di un frazionamento separati per le proteine ​​strettamente legate al DNA, tra cui gli istoni.

1. Ripetere i passaggi 1,1-2,4.
2. Triturare il pellet cromatina in 400 ml di acido solforico 0,4 N. Vortex per rimuovere i grumi.
3. Incubare a 4 ° C per 30 minuti o overnight durante la rotazione.
4. Centrifugare a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C per rimuovere i detriti nucleare.
5. Trasferire il surnatante in una nuova provetta.
6. Aggiungere 132 ml di acido tricloroacetico goccia a goccia al supernatante. Capovolgere più volte. Incubare su ghiaccio per 30 min.
7. Centrifugare a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C.
8. Gettare il surnatante. Lavare delicatamente pellet con gelida acetone. (Questa è l'istone pellet.)
9. Centrifugare a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C.
10. Ripetere il lavaggio, i passaggi 3,8-3,9.
11. Aria secca pellet.
12. Risospendere il pellet in 100 ml di Tris, SDS, EDTA. Impostato a pH 8 mediante aggiunta di 1 M Tris. (Utilizzare una M 1 stock Tris che non è il pH modificato.)
13. Sonicare a bagnomaria per 15 minuti. Evitare il surriscaldamento con l'aggiunta di ghiaccio a bagnomaria. (Questa è l'estratte con acido frazione e deve essere conservato a -80 ° C.)

4. Purezza Verifica

Western blot e la microscopia elettronicaconfermare arricchimento successo dei nuclei e l'esaurimento di altri organelli. Per visualizzare i risultati tipici per tutti i seguenti saggi di controllo di qualità, si prega di consultare la nostra pubblicazione precedente ^18.

1. Eseguire l'analisi Western blot. Sonda membrana contenente ogni frazione per istone H2A o nucleoporin P62 (come marcatori nucleari per verificare arricchimento), e per il trasportatore adenina nucleotide, BiP e tubulina (come marcatore mitocondriale, pennarello reticolo endoplasmatico, e marcatore citoscheletrico rispettivamente per verificare la purezza). Per verificare subfractionation successo della sonda nuclei, per l'istone H3 o fibrillarina (detergente e estratte con acido nuclei cromatina e intatto) e SNRP70 o E2F (nucleoplasma). Sonda per retinoblastoma o inducibile dall'ipossia fattore-1 (arricchito con detergente-estratto cromatina su estratte con acido, frazione). Campioni di controllo supplementari lisato cellulare HeLa e lisato tutto il cuore può essere eseguito anche nel gel stesso: Preparare controllo delle cellule HeLa lisato con l'aggiunta di Tris, SDS, EDTA buffer per piastra di coltura e l'utilizzo di un raschietto cellula per la raccolta del campione. Sottoporre ad ultrasuoni e centrifugare campione come nei passaggi 2,6-2,7. Preparare intero controllo lisato cuore omogeneizzando il cuore in 2 ml di tampone (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, pirofosfato di sodio 2,5 mM, 1 mM glicerofosfato in acqua deionizzata con proteasi e fosfatasi inibitore miscela). Sottoporre ad ultrasuoni e centrifugare come nei passaggi 2,6-2,7. Vedere il passaggio 5 per la preparazione di campioni di proteine ​​per SDS-PAGE.
2. Microscopia elettronica: Risospendere il pellet di nuclei da 1,6 passo in tampone di lisi contenente 2% di glutaraldeide e fissare campione a 4 ° C. Sciacquare i campioni in acido osmico, disidratano, e incorporare in resina epossidica. Tagliare 70 fette nm utilizzando un Reichert Ultracut ultramicrotomo. Colorare i campioni in acetato di uranile e poi piombo e immagine utilizzando un JEOL 100CX microscopio elettronico a trasmissione. Quantificare arricchimento misurando l'area di nuclei intatti rispetto superficie totale del materiale con immagini. Troviamo 60-80% dei nuclei diessere intatto ^14.

Considerazioni importanti per arricchire contro depurazione nuclei. Questo protocollo è stato sviluppato per consentire analisi proteomica della cromatina cardiaca allo scopo di studiare i processi globali di regolazione genica durante la malattia. Una componente importante della progettazione di tutto il proteoma esperimenti di spettrometria di massa è la questione della gamma dinamica e di essere in grado di identificare e caratterizzare le proteine ​​a bassa abbondanza. Oltre all'obiettivo primario di fornire informazioni sulla biologia nucleare e cromatina-specifici, per arricchire il proteoma nucleare, aumenta la probabilità di rilevare queste proteine ​​a bassa abbondanza, così come subfractionation ulteriore dei nuclei. Tuttavia, come discusso, il cardiomiociti adulti ha una componente citoscheletrico densa collegato alla membrana nucleare. Noi non crediamo che abbiamo completamente purificati i nuclei di queste altre componenti cellulari. Tuttavia, arricchendo solo per i nuclei, abbiamo ottenereed una soglia accettabile per consentire i tipi di analisi descritto.

Specificamente, abbiamo EM usato per valutare la purezza della nostra nuclei pellet greggio e trovato 60-80% della frazione da nuclei intatti, circa il 10% mitocondri, e il resto detriti. Inoltre, sappiamo da un nostro precedente studio sulla popolazione nuclei intatti, che, mentre molti non miofilamenti sono arricchiti da questo protocollo (compresi tubulina e actina come misurato da occidentale) alcune proteine ​​(calsarcin-1) sono arricchiti, suggerendo una popolazione vera biologica queste proteine ​​nei nuclei cardiaca ^19.

Inoltre, abbiamo confrontato le proteine ​​abbiamo trovato ad essere presente nel estratte con acido frazione cromatina, ai ruoli previsti di queste proteine ​​dall'ontologia gene. È importante sottolineare che questa analisi ontologia gene non tiene in considerazione l'abbondanza relativa delle diverse proteine ​​(così come i nostri dati Western Blot), ma conta piuttosto tutte le proteine ​​identificate (arricchirendr o meno) uguali al momento di individuare percorsi comuni e compartimenti cellulari. L'analisi di queste vie e dei compartimenti cellulari si trovano nelle nostre pubblicazioni precedenti. ^18,20 più importante, il successo della arricchimento nel estratte con acido, frazione cromatina ci ha permesso di identificare la presenza di 54 varianti istoniche in miociti topo adulto, ¹⁸ molte delle quali basata su un peptide unico per l'identificazione e, quindi, probabilmente non sono stati rilevabili senza questo protocollo di arricchimento data l'enorme complessità del proteoma cardiomiociti totale. Delle proteine ​​1048 abbiamo identificato dai nuclei cardiaca, 56 di essi (5,3%) sono stati annotati da GO analisi a far parte del nucleosoma (un componente del nucleo di interesse). Un altro studio guardando il cuore, identificato 6.180 proteine, di cui solo 11 proteine ​​(0,18%) sono stati annotati far parte del nucleosoma ^21. Ciò conferma ulteriormente la forza del nostro protocollo meaningfully arricchire per le proteine ​​nucleari.

5. Proteine ​​Gel e enzimatica delle proteine ​​Digest

Le proteine ​​sono separate da uno dimensionale SDS-PAGE e tripsina digerito da eseguire sul spettrometro di massa.

1. Scongelare i campioni sul ghiaccio e determinare la concentrazione di proteine ​​per ogni campione mediante l'acido bicinconinico (BCA) dosaggio delle proteine.
2. Diluire i campioni ad una concentrazione nota con 5x tampone di Laemmli, bollire per 10 min e conservare a -20 ° C per unidimensionale SDS-PAGE. Diluire i campioni ad una concentrazione nota di estrazione utilizzando tampone urea e conservare a -20 ° C per gel bidimensionali.
3. Eseguire gel di scelta carico pari quantità di proteina in ciascuna corsia. Proteine ​​possono essere trasferiti ad una membrana di nitrocellulosa da utilizzare per Western blotting (come con controlli passo 4.1) o bande può essere tagliato per analisi di spettrometria di massa; vedere passi seguenti.
4. Rimuovere il gel da apparecchi con acqua deionizzata per trasferirla in un contenitore pulito.Copertura gel in Oriole macchia, e contenitore avvolgere in un foglio di alluminio per bloccare la luce. Permettono gel ad incubare a temperatura ambiente su un agitatore per almeno 90 min.
5. Immagine Oriole macchiato di gel (Figura 3) usando la luce ultravioletta, e marchio, se le bande saranno tagliati sull'immagine. Abbiamo tagliato ogni corsia in circa 25 2 mm di bande per gli studi di misurazione del proteoma totale.
6. Inserire gel su una superficie pulita. Utilizzare solo materiali che sono stati tenuti chiusi o vengono spruzzati con etanolo per prevenire la contaminazione cheratina. Tagliare ogni banda, e quindi ulteriormente tagliare in 3 parti uguali. Mettere tutti e tre i pezzi di ogni band insieme il meglio di sé etichettato 1,5 ml tubetto. Pezzi di gel possono essere conservati a -20 ° C per diversi mesi.
7. Preparare spine gel per la digestione enzimatica. Digest pezzi gel usando tripsina a 37 ° C per una notte. Per il protocollo dettagliato esempio gel di vedere la nostra pubblicazione precedente. ²² È possibile digerire fasce a basso peso molecolare con chimotripsina in luogo di tripsina,per eliminare scollatura ampia tripsina di code degli istoni.

6. Spettrometria di massa e analisi dei dati

Campioni sono separati su un LC e analizzati mediante MS / MS. Gli spettri sono confrontati con un database di proteine ​​per l'identificazione di proteine.

1. Eseguire 10 microlitri di ciascun campione mediante LC / MS / MS. Usiamo un nano-flusso Eskigent LC con una colonna di 75 micron di fase inversa. Utilizzare un run LC ottimizzato per una gamma di proteine ​​e peptidi. Impiegare un gradiente lineare da fase mobile A (0,1% di acido formico, acetonitrile 2% [ACN] in acqua) a fase mobile B (0,1% di acido formico, 20% di acqua in ACN): 60 min dal 5% B fase mobile a 50 B%, poi 15 min da 50% B a 95% B e infine 10 min a 95% costante B. Utilizzare una portata di 200 Nl / min. Acquisire dati di spettrometria di massa in un modo dipendente dai dati. Usiamo un Orbitrap Thermo che frammenta i primi 6 ioni madri più abbondanti.
2. Ripetizione viene eseguito per almeno tre tecniche biologiche e due repliche. (Recommended)
3. Utilizzare il software (le opzioni disponibili in commercio comprendono Bioworks e Xcalibur;! Pubblicamente opzioni disponibili includono PROWL, X Tandem, SpectraST) per cercare spettri sul database UniProt di scelta tramite un algoritmo di ricerca (ad esempio SEQUEST o MASCOT).
4. Provare a modificare i parametri di ricerca per consentire carbamidomethylation cisteina e metionina ossidazione, due modifiche comuni creati durante l'elaborazione del campione.
5. Calcolare un tasso di falsi positivi con la ricerca inversa database.
6. Filtro identificazioni proteiche per accettare solo le partite di una confidenza soglia. Si consigliano i seguenti parametri di iniziare con: Xcorr> 3 (+2),> 4 (+3),> 5 (+4), la tolleranza deltaCN> 0,1, il punteggio consenso ≥ 20, la tolleranza di massa per gli ioni 2 Da genitore, di massa di 0,5 Da per ioni prodotto, almeno due peptidi unici al proteine ​​e non più di 3 mancati spaccature.

7. Etichetta senza quantificazione

Determine l'abbondanza relativa di proteine ​​usando label-free quantificazione (Figura 4).

1. Un certo numero di programmi software sono pubblicamente disponibili in commercio o per l'etichetta senza quantificazione dei dati di spettrometria di massa tra cui Censimento (gruppo del Prof. Yates '), ²³ Elucidator (Microsoft), ²⁴ SETACCIO (Thermo Scientific), ²⁵ Scaffold (Software Proteome) ^26. Questi programmi mirano a correlare il segnale di spettrometria di massa di peptidi intatti o il numero di peptide eventi di sequenziamento di un quantitativo di proteine ​​relativi tra due o più stati.
2. Mentre ciascun programma incorpora una pipeline simile analisi, alcuni programmi sono limitati ai tipi di analisi specifiche che possono essere eseguite sui dati. Inizialmente, i dati da diverse esecuzioni è allineato, intensità del segnale viene normalizzato e picchi peptidici vengono selezionati per l'analisi.
3. I due metodi più comuni sono una quantificazione basata sul conteggio spettrale o LC-MS area del picco. Abbondanzaindici sono calcolati per determinare le variazioni in abbondanza peptide tra gruppi diversi.
4. Questi programmi possono essere interfacciato con algoritmi di ricerca di proteomica (Mascot, Sequest, X! Tandem) di correlare le informazioni quantificazione per l'identificazione delle proteine.
5. Per garantire precisione e riproducibilità dei dati è fondamentale incorporare entrambe biologici (diversi campioni sperimentali) e tecniche (esecuzione stesso campione dello spettrometro di massa più volte) replicati di dati spettrometro di massa.
6. Variazione del peptide in abbondanza e tra condizioni sperimentali può essere valutata mediante ANOVA e tracciati tramite PCA (Figura 5).

Considerazioni importanti per l'etichetta senza quantificazione. Quando si esegue l'etichetta priva di quantificazione, particolare attenzione deve essere data per assicurare la preparazione uniforme del campione, il tempo di digestione e le condizioni di LC-MS/MS come ogni campione devono essere elaborati e analizzati separatamente. A differenza di metapprocci in materia di etichettatura, abolic confronti nel label-free esperimenti sono fatti sui dati di spettrometria di massa distinta corre (a causa della mancanza di etichettatura di evitare la possibilità di correre insieme), cosicché egli debba alta riproducibilità in tutti gli aspetti di analisi dei campioni (cioè di preparazione del campione, LC e ms) e l'uso di spettrometri di massa ad alta precisione di massa.

Per tenere conto di lievi modifiche nella preparazione del campione e analisi uno standard noto può essere aggiunto ad ogni campione per facilitare la normalizzazione dei dati. Inoltre, la maggior parte dei programmi software consentono normalizzazione delle intensità di segnale (ad esempio regolando al rumore di fondo o di un analita noto abbondante) dopo l'acquisizione dei dati di conto delle differenze di iniezione, ionizzazione e frammentazione. Algoritmi di allineamento esistono nella maggior parte dei sopra citati programmi software che aiutano a correggere differenze nei profili di eluizione del peptide. L'uso di repliche biologiche e tecnico è Essenziale in questo tipo di studio, in quanto consente analisi statistiche per confermare la riproducibilità e coerenza delle variazioni osservate in abbondanza proteine.

Risultati

Figura 4 mette in evidenza l'utilità di questa forma di quantificazione relativa. Mostrata nel pannello di sinistra sono i singoli picchi peptide monoisotopico (sovrapposto da diversi tipi di mouse), che sono state designate come appartenenti alla proteina HMGB1 (identificato tramite ricerca nel database). Ogni picco, essenzialmente un cromatografo ionico estratta per il dato peptide, proviene da un mouse diverso. I gruppi rappresentano tre diversi stati fisiologici: basale, l'ipertrofia cardia...

Discussione

Due metodi principali per isolamento nucleare sono stati esaminati in precedenza: ²⁷ uno è la tecnica di omogeneizzazione Behrens tessuto liofilizzato in un solvente non acquoso e la seconda, una modifica che usiamo qui, omogeneizzazione di tessuto in una soluzione acquosa di saccarosio / soluzione salina seguita dal differenziale o centrifugazione in gradiente di densità.

Subfractionation dei nuclei mediante estrazione acido su campioni di tessuto è uno strumento importante pe...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo
Dulbeco Eagle modificato Media	Invitrogen	11965
Proteasi pellet	Roche	04 693 159 001
100 um filtro	BD Falcon	352360
Ultracut ultramicrotomo	Reichert
100CX elettronica a trasmissione Microscopio	JEOL USA, Inc.
Rigogolo	BioRad	161-0496
Istone H2A anticorpo	Santa Cruz	sc-8648
Nucleoporin anticorpo p62	BD Biosciences	610498
Adenina nucleomarea trasportatore anticorpo	Santa Cruz	sc-9299
BiP anticorpo	Santa Cruz	sc-1050
Tubulina	Sigma	T1568
Istone H3 anticorpo	Abcam	ab1791
Fibrillarina anticorpo	Segnalazione cellulare	C12C3
SNRP70 anticorpo	Abcam	ab51266
E2F-1 anticorpo	Thermo Fisher	MS-879
Retinoblastoma anticorpo	BD Biosciences	554136
Ipossia inducibile fattore-1 anticorpo	Novus Biologicals	NB100-469
BCA proteina test	Thermo Scientific	23227
Colonna a fase inversa	Obj Nuovocace	PFC7515-B14-10
Bioworks Browser	Thermo Scientific