Análisis cuantitativo de proteomas cromatina en la enfermedad

Resumen

Los avances en la espectrometría de masas han permitido el análisis de alto rendimiento de la expresión de proteínas y la modificación en un huésped de tejidos. En combinación con el fraccionamiento subcelular y modelos de enfermedad, espectrometría de masa cuantitativa y bioinformática puede revelar nuevas propiedades en los sistemas biológicos. El método descrito en la presente memoria analiza asociadas a la cromatina proteínas en el contexto de las enfermedades del corazón y es fácilmente aplicable a otras In vivo Modelos de enfermedad humana.

Resumen

En el núcleo residen los proteomas cuyas funciones están íntimamente vinculadas con la regulación de genes. Núcleos de cardiomiocitos adultos de mamíferos son únicos debido al alto porcentaje de células binucleadas, ^un estado predominantemente heterochromatic del ADN, y la naturaleza no división de los cardiomiocitos que hace que los núcleos adulto en un estado permanente de interfase. ² Regulación transcripcional durante el desarrollo y enfermedad han sido bien estudiados en este órgano, ^3-5, pero lo que permanece relativamente inexplorado es el papel que desempeñan las proteínas nucleares responsables de empaquetamiento del ADN y la expresión, y cómo estas proteínas controlan los cambios en los programas transcripcionales que ocurren durante la enfermedad. ⁶ En los países desarrollados mundo, la enfermedad cardíaca es la principal causa de mortalidad tanto en hombres como en mujeres. ⁷ Insight sobre cómo las proteínas nucleares cooperar para regular la progresión de esta enfermedad es fundamental para avanzar en el tratamiento actual opciones.

La espectrometría de masas es la herramienta ideal para abordar estas cuestiones, ya que permite una anotación imparcial de la cuantificación nuclear proteoma y relativo de cómo la abundancia de estas proteínas cambia con la enfermedad. Si bien se han realizado varios estudios proteómicos para mamíferos complejos de proteínas nucleares, ^8-13 hasta hace ¹⁴ sólo ha habido un estudio que examina el proteoma nuclear cardíaca, y se considera el núcleo entero, en lugar de explorar el proteoma a nivel de sub-compartimentos nucleares . ¹⁵ En gran parte, esta escasez de trabajo se debe a la dificultad de aislar núcleos cardíaco. Núcleos cardiacos ocurren dentro de un rígido y denso de actina-miosina aparato al que están conectados a través de múltiples extensiones desde el retículo endoplásmico, en la medida en que altera la contracción de miocitos su forma general. ¹⁶ Además, los cardiomiocitos son 40% mitocondrias en volumen ¹⁷ que necessitàtes enriquecimiento del núcleo aparte de los otros orgánulos. Aquí se describe un protocolo para el enriquecimiento nuclear cardíaca y fraccionamiento adicional en compartimentos biológicamente relevantes. Además, los métodos de detalle de la etiqueta libre de disección de espectrometría de masa cuantitativa de estas fracciones-técnicas susceptibles de experimentación in vivo en varios modelos animales y sistemas de órganos en el etiquetado metabólico no es factible.

Protocolo

El flujo de trabajo experimental contiene siete pasos principales (Figura 1). Para cualquier trabajo relacionado con las muestras que se ejecutan en el espectrómetro de masas, el experimentador debe usar una bata de laboratorio, guantes y redecilla para el pelo y tener cuidado para evitar la contaminación por polvo y derramamiento personal de la queratina.

1. Corazón homogeneización y Aislamiento Nuclear

Corazones de ratón se homogeneizó y un intacta núcleos de pellets es aislado (Figura 2).

1. Sacrificar el ratón adulto, escindir el corazón, enjuagar en PBS enfriado en hielo, y se homogeneiza sobre hielo en Dounce de vidrio (se prefiere que el triturador de tejidos Wheaton de Fisher, # 08-414-13A, pero otros métodos pueden funcionar igual de bien) que contiene 2 ml de tampón de lisis (una solución hipotónica que diferencialmente lisa la membrana celular a través de los orgánulos, incluyendo el núcleo) (10 mM Tris pH 7,5, 15 mM NaCl, y 0,15% v / v de Nonidet P-40 [NP 40-] en agua desionizada más proteasa y fosfatasa imezcla nhibitor: 10 mM de butirato de sodio, 0,1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo [PMSF], 0,2 mM Na ₃ VO _4, 0,1 mM de NaF y 1 Roche proteasa pellet/10 ml - tampón de lisis que se puede almacenar hasta por una semana a -20 ° C ). (Nota: Nosotros no consideramos que sea necesario para perfundir los corazones con PBS, ya que nuestros datos de espectrometría de masas y análisis IR identificar las proteínas como predominantemente cardiomiocitos [p-valor de 3.8E-22] en origen frente a la contaminación de la sangre [p valor 5,0 E-2].)
2. Verter lisado a través de filtro de micras 100 y recoger el flujo a través de tubo de centrífuga de 1,5 ml. En este punto, salvo que se especifique, la muestra debe mantenerse en hielo.
3. Centrifugar a 4.000 rpm durante 5 min a 4 ° C.
4. Eliminar el sobrenadante. (Este es el citosol, y deben ser almacenados a -80 ° C; contiene el lisado mitocondrias.) Resuspender el sedimento en 200 l de tampón de lisis por trituración. (Este es el sedimento nuclear bruto.)
5. Llenar 1,5 ml tubo de centrífuga con 1 ml de sacarosa buffer (24% en peso de sacarosa / volumen, 10 mM Tris pH 7,5, y 15 mM de NaCl en agua desionizada con proteasa / mezcla de inhibidor de fosfatasa - tampón de sacarosa debe ser fresca en el día de uso). Suavemente capa del precipitado resuspendido en la parte superior de la almohadilla de sacarosa y se centrifuga a 5.000 rpm durante 10 min a 4 ° C.
6. Eliminar la película delgada en la parte superior, así como la almohadilla de sacarosa (que contienen la membrana). Enjuague el sedimento remanente con 200 l de hielo frío PBS / EDTA (1x PBS con 1 mM EDTA). (Esta es la núcleos de pellets y pueden solubilizarse o fijada para el uso en microscopía electrónica de Western Blot o [Véanse los pasos 4,1 y 4,2] para cuantificar enriquecimiento.)

2. Nucleoplasma y detergente a extraer Fraccionamiento cromatina

El crudo núcleos de pellets se separa en una nucleoplasma y detergente a extraer la fracción de cromatina, que contiene proteínas estrechamente asociados con el ADN.

1. Triturar pellet de paso 1.6 en 200 l tampón de extracción de detergente (20 mM HEPES pH 7,6, 7,5 mM de MgCl _2. 0,2 mM EDTA, 30 mM NaCl, 1 M de urea, 1% de NP-40 en agua desionizada con proteasa / mezcla de inhibidor de fosfatasa - tampón detergente extracción se puede almacenar hasta por una semana a -20 ° C).
2. Vórtice de la muestra 2 veces, 10 segundos cada uno. Se coloca sobre hielo 10 min.
3. Centrifugar a 13.000 rpm durante 5 min a 4 ° C.
4. Eliminar el sobrenadante. (Este es el nucleoplasma y debe almacenarse a -80 ° C). Enjuague pellet con PBS enfriado en hielo / EDTA. (Este es el sedimento de cromatina.)
5. Se tritura el pellet en 300 l de Tris, SDS, tampón de EDTA (50 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1% SDS en agua desionizada con proteasa / mezcla de inhibidor de fosfatasa - Tris, SDS, tampón de EDTA se puede mantener durante un máximo de una semana a -20 ° C).
6. Sonicar 3-6 veces durante 10 segundos cada uno para romper el ADN. Mantenga la muestra en hielo entre sonicaciones.
7. Centrifugar a 13.000 rpm durante 5 min a 4 ° C. Mantener el sobrenadante. (Sobrenadante es el detergente extraído cromatina proteína fraccionamienton y debe mantenerse a -80 ° C). El sedimento remanente debe ser pequeña y puede ser desechado.
8. Si se utiliza miocitos aislados en lugar de todo el corazón: Aislar neonatales miocitos ventriculares de rata a partir de crías de rata de un día después del nacimiento mediante digestión enzimática, seguido por cultivo en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con fetal 10% de suero bovino (FBS), 1% de insulina -transferrina-selenito sódico (ITS), y 1% de penicilina. Después de 24 h, la transferencia a medios libres de suero (igual que el anterior, pero que carecen de FBS). Cosecha de células en tampón de lisis (que se enumeran en el punto 1.1), y comenzar fraccionamiento nuclear en el paso 1.3.

3. Ácido-extracción Fraccionamiento - ADN enlazado enriquecimiento proteico

A enriquece de fraccionamiento para separar las proteínas fuertemente unidas al ADN, incluyendo histonas.

1. Repita los pasos 1.1-2.4.
2. Se tritura el sedimento de cromatina en 400 l de ácido sulfúrico 0,4 N. Vortex para eliminar grumos.
3. Incubar a 4 º C durante 30 min o Overnight mientras gira.
4. Se centrifuga a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C para eliminar los desechos nucleares.
5. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
6. Añadir 132 l de ácido tricloroacético gota a gota al sobrenadante. Voltear varias veces. Incubar en hielo durante 30 min.
7. Centrifugar a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
8. Desechar el sobrenadante. Enjuague suavemente pellet con helado de acetona. (Esta es la histona pellet.)
9. Centrifugar a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
10. Repita el lavado, los pasos 3.8-3.9.
11. Aire seco en pelets.
12. Resuspender el precipitado en 100 l de Tris, SDS, EDTA tampón. Ajuste de pH a 8 mediante la adición de 1 M Tris. (Utilizar un stock de Tris 1 M que no es de pH ajustado.)
13. Someter a ultrasonidos en baño de agua durante 15 min. Evitar el sobrecalentamiento mediante la adición de hielo al baño María. (Esta es la fracción extraída con ácido y debe almacenarse a -80 º C)

4. Pureza Check

Western blot y microscopía electrónicaconfirmar enriquecimiento exitoso de los núcleos y el agotamiento de otros orgánulos. Para ver los resultados típicos para todos los ensayos de control de calidad siguientes, por favor lea nuestra publicación anterior ^18.

1. Realizar un análisis de transferencia Western. Sonda de membrana que contiene cada fracción para la histona H2A o nucleoporin p62 (como marcadores nucleares para verificar el enriquecimiento), y para el transportador de nucleótido adenina, BIP y la tubulina (como un marcador mitocondrial, marcador del retículo endoplásmico y marcador citoesquelético respectivamente para verificar la pureza). Para verificar subfraccionamiento éxito de los núcleos, sonda para la histona H3 o fibrilarina (detergente y extraída con ácido núcleos de cromatina y intacto) y SNRP70 o E2F (nucleoplasma). Sonda para el retinoblastoma o inducible de hipoxia factor-1 (enriquecido en detergente a extraer la cromatina durante extraída con ácido fracción). Las muestras adicionales de control de lisado de células HeLa y lisado de todo corazón también se puede ejecutar en el mismo gel: Preparar lisado de células HeLa de control mediante la adición de Tris, SDS, EDTA tampón para placa de cultivo y el uso de un rascador de células para recoger la muestra. Someter a ultrasonidos y centrifugar la muestra como en los pasos 2.6-2.7. Preparar el control conjunto lisado corazón homogeneizando el corazón en 2 ml de tampón (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2,5 mM de pirofosfato de sodio, 1 mM de glicerofosfato en agua desionizada con la proteasa y la mezcla de inhibidor de la fosfatasa). Someter a ultrasonidos y centrifugar como en los pasos 2.6-2.7. Vea el paso 5 para la preparación de muestras de proteína por SDS-PAGE.
2. Microscopía electrónica: Resuspender el pellet a partir de núcleos de 1,6 a paso en tampón de lisis que contiene 2% de glutaraldehído y fijar la muestra a 4 ° C. Enjuague las muestras en ácido ósmico, deshidratar e incrustar en resina epoxi. Cortar rebanadas de 70 nm utilizando un Reichert Ultracut ultramicrótomo. Mancha de muestras en acetato de uranilo y luego el plomo y la imagen con un microscopio JEOL 100CX electrónico de transmisión. Cuantificar el enriquecimiento mediante la medición del área de los núcleos intactos contra área total de material filmado. Encontramos 60-80% de los núcleos aestar intacto. ¹⁴

Consideraciones importantes para enriquecer frente a purificar núcleos. Este protocolo fue desarrollado para permitir a los análisis proteómicos de la cromatina cardíaco con el fin de estudiar los procesos globales de regulación génica durante la enfermedad. Un componente importante del diseño de todo el proteoma experimentos de espectrometría de masas es el problema de rango dinámico y ser capaz de identificar y caracterizar las proteínas de baja abundancia. Además del objetivo principal de proporcionar información sobre la biología y de la cromatina nuclear específico, enriqueciendo para el proteoma nuclear, aumenta la probabilidad de detectar estas proteínas de baja abundancia, como lo hace el subfraccionamiento adicional de los núcleos. Sin embargo, como se discutió, el cardiomiocito adulto tiene una alta densidad de componentes del citoesqueleto conectado a la membrana nuclear. No creemos que hemos purificado por completo los núcleos de estos componentes celulares. Sin embargo, mediante el enriquecimiento sólo para los núcleos, hemos obtenidoed de un umbral aceptable para permitir a los tipos de análisis descrito.

Específicamente, hemos EM utilizado para evaluar la pureza de nuestra núcleos pellet crudo y encontraron 60-80% de la fracción a ser núcleos intactos, aproximadamente el 10% mitocondrias, y el resto escombros. Además, sabemos por nuestro anterior estudio sobre la población de núcleos intactos, mientras que los miofilamentos muchos no se enriquecen con este protocolo (incluyendo la tubulina y actina, medido a través de Western) ciertas proteínas (calsarcin-1) se enriquecen, lo que sugiere una verdadera población biológica de estas proteínas en los núcleos cardíaco. ¹⁹

Además, se compararon las proteínas que se encuentran a estar presente en la fracción de cromatina extraído con ácido, a las funciones de estas proteínas predichas por la ontología de genes. Es importante destacar que este análisis de genes ontología no tiene en cuenta la abundancia relativa de las diferentes proteínas (como lo hace nuestros datos de Western blot), sino que cuenta todas las proteínas identificadas (enriquecered o no) como igual al identificar vías comunes y compartimentos celulares. El análisis de estas vías y compartimentos celulares se pueden encontrar en nuestras publicaciones anteriores. ^18,20 es más importante, el éxito del enriquecimiento en la fracción de cromatina extraída con ácido nos permitió identificar la presencia de 54 variantes de las histonas en el miocito ratón adulto, ¹⁸ muchos de los cuales se basó en un péptido único de identificación, por lo que probablemente no hubiera sido detectable sin este protocolo de enriquecimiento dada la enorme complejidad del proteoma cardiomiocitos total. De las 1.048 proteínas que hemos identificado a partir de los núcleos cardiaca, 56 de ellos (5,3%) fueron anotados por análisis IR para ser parte de la nucleosoma (un componente del núcleo de interés). Otro estudio que analiza todo el corazón, identificado 6.180 proteínas, de las cuales sólo 11 proteínas (0,18%) fueron anotados para ser parte de la nucleosoma ^21. Esto ilustra la fuerza de nuestro protocolo de meaningfuLLY enriquecer para las proteínas nucleares.

5. Protein Gel y enzimática de proteínas Resumen

Las proteínas se separan mediante uno dimensional SDS-PAGE y se digirieron con tripsina para ser ejecutado en el espectrómetro de masas.

1. Descongelar las muestras en hielo y determinar la concentración de proteína para cada muestra usando el ácido bicinconínico (BCA) ensayo de proteínas.
2. Diluir las muestras con una concentración conocida utilizando 5x tampón de Laemmli, hervir durante 10 min y se almacena a -20 ° C para una dimensión SDS-PAGE. Diluir las muestras a una concentración conocida utilizando tampón de extracción de urea y almacenar a -20 ° C para geles de dos dimensiones.
3. Ejecutar gel de elección cargar la misma cantidad de proteína en cada carril. Las proteínas pueden ser transferidos a una membrana de nitrocelulosa que se utilizará para la transferencia Western (como con los controles en el paso 4,1) o las bandas pueden ser cortadas para el análisis de espectrometría de masas; consulte los pasos siguientes.
4. Retirar el gel de aparatos que utilizan agua desionizada para transferirlo a un recipiente limpio.Cubra gel en Oriole mancha, y el envase envuelva en papel de aluminio para bloquear la luz. Permitir gel de incubar a temperatura ambiente en un agitador durante al menos 90 min.
5. Imagen Oriole manchado de gel (Figura 3) con luz UV, y la marca donde las bandas se reducirá en la imagen. Cortamos cada carril en aproximadamente 25 2-mm bandas para los estudios de medición del proteoma total.
6. Coloque gel sobre una superficie limpia. Utilice sólo los materiales que se han mantenido cerrado o se rocían con etanol para evitar la contaminación de la queratina. Corte cada banda, y luego se lo rebana en 3 pedazos iguales. Coloque las tres piezas de cada banda junto a su propio tubo etiquetado de 1,5 ml. Los trozos de gel se pueden almacenar a -20 ° C durante varios meses.
7. Preparar los tapones de gel para la digestión enzimática. Digest piezas de gel utilizando tripsina a 37 ° C durante la noche. Para el protocolo detallado muestra de gel ver nuestra publicación anterior. ²² Puede digerir bajo peso molecular bandas con quimotripsina en lugar de tripsina,para eliminar la escisión extensa de tripsina de colas de las histonas.

6. Espectrometría de Masas y Análisis de Datos

Las muestras se separaron en un LC y se analizaron mediante MS / MS. Los espectros se registraron en contra de una base de datos de proteínas para la identificación de proteínas.

1. Ejecutar 10 l de cada muestra a través de LC / MS / MS. Usamos un nano-flujo Eskigent LC con una columna de fase inversa 75 micras. Utilice una ejecución de LC optimizado para un rango de proteínas y péptidos. Emplear un gradiente lineal de fase móvil A (acetonitrilo 0,1% de ácido fórmico, 2% [ACN] en agua) a la fase móvil B (0,1% de ácido fórmico, 20% de agua en ACN): 60 min de la fase B 5% a 50 móvil % B, 15 min luego de 50% B a 95% B y finalmente 10 minutos a 95% constante B. Utilizar una velocidad de flujo de 200 nl / min. Adquirir datos de espectrometría de masas de un modo dependiente de los datos. Usamos un Orbitrap Thermo que fragmenta las 6 iones primarios más abundantes.
2. Repetición ejecuta durante al menos tres repeticiones biológica y dos técnicos. (Recommended)
3. Utilice el software (las opciones disponibles en el mercado incluyen BioWorks y Xcalibur;! Públicamente opciones disponibles incluyen PROWL, X Tandem, SpectraST) para buscar los espectros de la base de datos Uniprot de elección a través de un algoritmo de búsqueda (como SEQUEST o mascota).
4. Considerar la modificación de los parámetros de búsqueda para permitir carbamidomethylation cisteína y la oxidación de metionina, dos modificaciones comunes creados durante el procesamiento de la muestra.
5. Calcular una tasa de falsos positivos mediante la búsqueda de base de datos inversa.
6. Filtrar identificación de proteínas a aceptar sólo los partidos de la confianza umbral. Recomendamos los siguientes parámetros para empezar: Xcorr> 3 (2),> 4 (3),> 5 (4); tolerancia deltaCN> 0,1, la puntuación de consenso ≥ 20, la tolerancia masa 2 Da ion para padres, masa Da de 0,5 por iones producto, por lo menos 2 péptidos únicos por proteína y 3 no es más que perder divisiones.

7. Etiqueta libre de cuantificación

Determine la abundancia relativa de proteínas utilizando la etiqueta libre de cuantificación (Figura 4).

1. Una serie de programas de software son públicamente o disponibles comercialmente para la etiqueta libre de cuantificación de datos de espectrometría de masas, incluyendo Censos (grupo del Prof. Yates), ²³ Elucidator (Microsoft), ²⁴ SIEVE (Thermo Scientific), ²⁵ Andamio (Software Proteoma) ^26. Estos programas tienen como objetivo correlacionar la señal de espectrometría de masas de péptidos intactos o el número de eventos de secuenciación de péptidos de proteínas con cantidades relativas entre dos o más estados.
2. Si bien cada programa incorpora un análisis de tuberías similar, algunos programas se limitan a los tipos de análisis específicos que se pueden realizar sobre los datos. Inicialmente, los datos de diferentes ejecuciones está alineado, intensidad de la señal se normaliza y picos de péptidos se seleccionan para su análisis.
3. Los dos métodos más comunes son la cuantificación basada en el recuento espectral o LC-MS área del pico. Abundanciacoeficientes se calculan para determinar los cambios en la abundancia peptídico entre los diferentes grupos.
4. Estos programas pueden ser interconectados con algoritmos de búsqueda de proteómica (Mascot, Sequest, X! Tandem) para correlacionar la información cuantificación para la identificación de proteínas.
5. Para asegurar la precisión y reproducibilidad de los datos es crucial para incorporar tanto biológicos (diferentes muestras experimentales) y técnicos (ejecutando la misma muestra en el espectrómetro de masas múltiples veces), repeticiones de los datos de espectrometría de masas.
6. Variación de la abundancia de péptidos en y entre las condiciones experimentales se puede evaluar por ANOVA y se representa a través de PCA (Figura 5).

Consideraciones importantes para la etiqueta sin cuantificación. Cuando se realiza sin etiquetas cuantificación, se prestará especial se debe dar para asegurar la preparación de la muestra constante, el tiempo de digestión y condiciones LC-MS/MS como cada muestra deben ser procesados ​​y analizados por separado. En contraste con metenfoques Abolic etiquetado, las comparaciones libres en la etiqueta experimentos se realizan sobre los datos de espectrometría de masas distintas carreras (ya que la falta de etiquetado evita la posibilidad de correr juntos), lo que requiere una alta reproducibilidad en todos los aspectos del análisis de la muestra (es decir, de preparación de muestras, LC y pasos MS) y el uso de espectrómetros de masas de alta precisión en masa.

Para tener en cuenta los cambios leves en la preparación de muestras y análisis de un estándar conocido puede ser añadido a cada muestra para ayudar en la normalización de los datos. Además, la mayoría de los programas de software permiten la normalización de las intensidades de la señal (por ejemplo, mediante el ajuste al ruido de fondo o un analito conocido abundante) después de la adquisición de datos para tener en cuenta diferencias en la inyección, la ionización y fragmentación. Algoritmos de alineación existe en la mayoría de los programas de software referencia anteriormente que ayudan en la corrección de las diferencias en los perfiles de elución de péptidos. El uso de repeticiones biológica y técnica es esencialcial en este tipo de estudio, ya que permite que los análisis estadísticos para confirmar la reproducibilidad y consistencia de los cambios observados en la abundancia de proteínas.

Resultados

La figura 4 pone de manifiesto la utilidad de esta forma de cuantificación relativa. Se muestra en el panel de la izquierda son los picos individuales monoisotópicas péptidos (superpuesta de diferentes ratones), que han sido designados como pertenecientes a la proteína HMGB1 (identificados mediante una búsqueda de base de datos). Cada pico, esencialmente un cromatógrafo iónico extrae para el péptido dado, proviene de un ratón diferente. Los grupos representan tres diferentes estados fisiológic...

Discusión

Existen dos métodos principales para el aislamiento nuclear han sido revisados ​​previamente: ²⁷ una es la técnica Behrens de homogeneizar tejido liofilizado en un disolvente no acuoso y la segunda, una modificación de la que se utiliza aquí, de homogenizar el tejido en un acuosa de sacarosa / solución salina seguido por diferencial o centrifugación en gradiente de densidad.

Subfraccionamiento de los núcleos mediante extracción con ácido en muestras de tejido es una h...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
Dulbeco Modificado Medio Eagle	Invitrogen	11965
Proteasa pellet	Roche	04 693 159 001
100 m colador	BD Falcon	352360
Ultracut ultramicrótomo	Reichert
100CX Electrónica de Transmisión Microscopio	JEOL EE.UU., Inc.
Oriol	BioRad	161-0496
Histona H2A anticuerpo	Santa Cruz	sc-8648
Nucleoporin p62 anticuerpo	BD Biosciences	610498
Adenina nucleomarea anticuerpo transportador	Santa Cruz	sc-9299
Bip anticuerpo	Santa Cruz	sc-1050
Tubulina de anticuerpos	Sigma	T1568
Histona H3 anticuerpo	Abcam	ab1791
Fibrilarina anticuerpo	Señalización Celular	C12C3
SNRP70 anticuerpo	Abcam	ab51266
E2F-1 anticuerpo	Thermo Fisher	MS-879
Retinoblastoma anticuerpo	BD Biosciences	554136
Factor-1 inducible por hipoxia anticuerpo	Novus Productos Biológicos	NB100-469
BCA ensayo de proteínas	Thermo Scientific	23227
Columna de fase inversa	Obj Nuevoective	PFC7515-B14-10
BioWorks Browser	Thermo Scientific