病におけるクロマチンプロテオームの定量的解析

要約

質量分析法の進歩により、組織の宿主におけるタンパク質発現および変更のハイスループット解析を可能にした。細胞下分画と疾患モデルと組み合わせることで、定量的質量分析法とバイオインフォマティクス、生物学的システムに新しい特性を明らかにすることができます。本明細書に記載される方法は、心臓病の設定でクロマチン関連タンパク質を解析し、他に容易に適用可能であるヒト疾患のモデル。

要約

核の中でその機能が最も密接な遺伝子調節にリンクされているプロテオームを常駐しています。哺乳類成体心筋細胞核DNAの大部分はヘテロクロマチン状態、相間の永続的な状態にある成人核をレンダリングする心筋細胞の非分裂性質^1、二核細胞の割合が高いのために独特である^。2転写調節は、開発時とこの病気は、このオルガンでよく研究されて^3月5日が、何が比較的未開拓のままでは、DNAのパッケージングおよび発現に関与する核タンパク質が果たす役割であり、どのように病気の経過中に生じる転写プログラムにおけるこれらのタンパク質制御の変更。開発した⁶世界では、心臓病は、男性と女性両方のため死亡原因の第1位です。核タンパク質は、この病気の進行を調節するために協力する方法について⁷ Insightは、現在の治療oを進めるために重要であるptions。

質量分析法は、それが病気とどのようにこれらのタンパク質の量が変化するため、核プロテオームと相対定量の公平な注釈を可能として、これらの質問に対処するための理想的なツールです。最近まで哺乳類の核タンパク質複合体^、8月13日にいくつかのプロテオミクス研究がなされているものの^14は、心臓核プロテオームを調べるだけで一つの研究がなされており、それはむしろ核サブコンパートメントのレベルでプロテオームを探索するのではなく、核全体を考慮¹⁵大部分では、仕事のこの不足は、心臓核を単離することが困難なためである。心臓核が筋収縮を変化させるが、その全体的な形状図^16はさらに、心筋細胞は¹⁷巻までに40％ミトコンドリアである限り、彼らは小胞体からの複数の拡張子を介して接続されている硬質かつ緻密なアクチン-ミオシン装置内で発生するnecessita他の細胞小器官は別に核の濃縮をTES。ここでは、心臓の核濃縮と生物学的に関連したコンパートメントにさらに分別するためのプロトコルを記述します。さらに、代謝標識が不可能な様々な動物モデルや器官系を用いたin vivo実験で影響を受けやすいこれらの画-技法のラベルフリー定量的質量分析解離の詳細メソッド。

プロトコル

実験のワークフローの主要7の手順を実行します（ 図1）が含まれています。質量分析計で実行されるサンプルを含む任意の仕事のために、実験者は白衣、手袋、ヘアネットを着用し、粉塵やケラチンの個人的な脱落による汚染を避けるために世話をする必要があります。

1。ハート均質化と核分離

マウスの心臓は均質化され、無傷の核ペレット（ 図2）を単離する。

1. 2ミリリットルを含む、心臓消費税、成体マウスを生け贄に（私たちは、フィッシャーから＃08-414-13Aをウィートン組織グラインダーを好むが、他の方法が均等にうまくいくかもしれませんが）を氷冷PBSですすぎ、ガラスダウンス氷上でホモジナイズ溶解バッファー（10 mMトリスpH 7.5、15 mMのNaCl、0.15％（v / v）のノニデットP-40 [NP-40]脱イオン水に加えて（差動核を含む細胞内小器官を介して細胞膜を溶解低張液）のプロテアーゼおよびホスファターゼInhibitor混合液：10mMの酪酸ナトリウム、0.1mMのフッ化フェニル[PMSF]、0.2 mMののNa ₃ VO _4、0.1mMのNaFおよび1ロシュプロテアーゼpellet/10ミリリットル-溶解緩衝液を-20℃で1週間まで保存することができる）。 （ 注：私達は私達の質量分析データとして、PBSで心臓を灌流することが必要になると分析は、主に心筋血液汚染とは対照的に、起源は[p値3.8E-22] [p値5.0としてタンパク質を同定行かないE-2]。）
2. 100μmのストレーナーを通してライセートおよび1.5 mlの遠心チューブ内を通る流れを集める注ぐ。指定がない限り、この時点で、サンプルを氷上で保たれるべきである。
3. 4℃で5分間4000 rpmで遠心
4. 上清を除去します。 （これは細胞質であり、-80℃で保存してくださいC.それは溶解ミトコンドリアが含まれています）。摩により200μlの溶解バッファーでペレットを再懸濁します。 （これは粗核ペレットです。）
5. スクロースバフ1mlの1.5 mlの遠心管を埋めるER（24％ショ糖重量/体積の10mMトリス（pH7.5）、およびプロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤の混合物とイオン水のNaCl 15mMの - スクロースバッファーは、使用当日に新鮮なされるべきである）。 4℃で10分間5,000 rpmでスクロースパッドと遠心の上にそっと層、再懸濁したペレットを
6. 上に薄膜と同様にスクロースパッド（膜を含む）を削除します。 200μlの氷冷PBS / EDTA（1mMのEDTAの1x PBS）で残ったペレットを洗浄します。 （これは核ペレットで、ウエスタンブロット法や電子顕微鏡で使用するための可溶化または固定することができます[手順4.1と4.2を参照してください]濃縮を定量化する。）

2。核質と洗剤に抽出されたクロマチン分画

粗製核ペレットを緩くするDNAに関連するタンパク質を含む、核質と洗剤抽出クロマチン画分とに分離される。

1. 200μlの洗剤抽出緩衝液（2のステップ1.6からペレットをひいて粉にする0 mMのHEPES緩衝液pH 7.6、7.5 mMのMgCl _2。 0.2mMのEDTA、30mMのNaCl、1mMのM尿素、1％NP-40プロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤の混合物との脱イオン水で - 洗剤抽出バッファー）は-20℃で1週間用に保存することができます。
2. 渦サンプル2回、10秒毎に。氷上で10分間の上に置きます。
3. 4℃で5分間、13,000 rpmで遠心する
4. 上清を除去します。 （これは核質であり、-80℃で保存してください）​​。氷冷PBS / EDTAでペレットを洗浄します。 （これはクロマチンペレットです。）
5. トリス、SDS、EDTA緩衝液で1週間のために状態に保つことができます - プロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤の混合物を用いて脱イオン水で1％SDSを300μlのトリス、SDS、EDTA緩衝液（50mMトリスpH7.4、10mMのEDTA、ペレットを砕いて粉にする-20℃）。
6. 10秒毎にDNAを分割するための3-6倍を超音波洗浄します。 sonications間にサンプルを氷上に保つ。
7. 4℃で5分間、13,000 rpmで遠心する上清をキープする。 （上清洗剤抽出されたクロマチンタンパク質fractioですnとは-80℃）で保たれるべきである。残ったペレットは小さくなければならず、廃棄することができる。
8. 10％ウシ胎児血清（FBS）を含むダ​​ルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、1％のインスリンで培養した酵素消化を用いて、出生後の仔ラット1日から新生仔ラット心室筋細胞を分離：全体ではなく、心の孤立した筋細胞を使用している場合 - トランスフェリン - 亜セレン酸ナトリウム（ITS）、および1％ペニシリン。 24時間後、無血清培地（上記と同じですが、FBSを欠く）に転送されます。収穫溶解緩衝液中の細胞（1.1に記載されている）、ステップ1.3で核分別を開始します。

3。酸抽出分画 - DNA結合タンパク質の濃縮

ヒストンを含めしっかりとDNAに結合したタンパク質に対して、個別の分別を豊かに。

1. ステップ1.1から2.4を繰り返します。
2. 0.4 N硫酸400μlのクロマチンペレットを砕いて粉末にする。塊を削除する渦。
3. 30分またはovern 4℃でインキュベートIGHT回転させながら。
4. 4℃で10分間16000×gで遠心°C核破片を除去する。
5. 新しいチューブに上清を移してください。
6. トリクロロ酢酸の132μlの上清に滴下を追加します。数回転倒。氷上で30分間インキュベートします。
7. 4℃で10分間16000×gで遠心分離し、
8. 上清を捨てる。優しく氷冷アセトンでペレットをすすいでください。 （これはヒストンペレットです。）
9. 4℃で10分間16000×gで遠心分離し、
10. 洗浄、ステップ3.8から3.9を繰り返します。
11. 空気乾燥ペレット。
12. トリス、SDS、EDTA緩衝液100μl中にペレットを再懸濁します。 1MのTrisを添加することによりpHを8に設定します。 （pH調整しない1 Mトリスの在庫を使用してください。）
13. 15分間水浴中で超音波洗浄します。水浴に氷を追加することで過熱を防止。 （これは、酸抽出画分であり、-80℃で保存してください）

4。純度チェック

ウエスタンブロット法および電子顕微鏡核や他の細胞小器官の枯渇の成功濃縮を確認します。以下の品質管理検定のすべての典型的な結果を表示するには、我々の前の出版物を参照してください^。18

1. ウエスタンブロット分析を実行します。ヒストンH2AまたはヌクレオポリンP62（濃縮を確認するために核のマーカーとして）、およびアデニンヌクレオチドトランスポーター、BIPおよびチューブリン（ミトコンドリアマーカー、小胞体マーカー、それぞれ純度を検証するための細胞骨格マーカーなど）の各画分を含むプローブメンブレン。核の亜分画に成功、ヒストンH3またはフィブリラリン（洗剤と酸抽出したクロマチンと無傷核）とSNRP70またはE2F（核質）用プローブを確認します。網膜芽細胞腫または低酸素誘導因子-1用プローブ（酸抽出画分オーバー洗剤抽出クロマチンに富む）。 HeLa細胞ライセートと心臓全体溶解物の追加の制御サンプルも同じゲルで実行することができます：ED、トリス、SDSを加えることによってHeLa細胞ライセートコントロールを準備培養皿にバッファTAとサンプルを収集するために、セルスクレーパーを使用しています。超音波処理およびステップ2.6から2.7のように試料を遠心分離する。 2mlの緩衝液（20mMトリスpH7.4、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのEGTA、1％トリトンX-100、2.5mMのピロリン酸ナトリウム、脱イオン水で1 mMのグリセロリンに心を均質化することにより、心臓全体のライセートのコントロールを準備プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤の混合物を含む）。超音波処理およびステップ2.6から2.7のように遠心分離します。 SDS-PAGE用のタンパク質試料を調製するためのステップ5を参照してください。
2. 電子顕微鏡：2％グルタルアルデヒドを含む溶解緩衝液中でステップ1.6から核ペレットを再懸濁し、4℃でサンプルを修正℃にオスミウム酸でサンプルをすすぎ、脱水、エポキシ樹脂中に埋め込みます。ライヘルトUltracutウルトラミクロトームを用いた70nmのスライスをカット。 JEOL 100CX透過型電子顕微鏡を用いて酢酸ウラニルと、リードと画像のサンプルを染色。画像化された材料の総面積に対する無傷核の面積を測定することによって濃縮を定量化する。 我々は核 ​​の60から80パーセントを見つける無傷で¹⁴

核を豊かに対浄化するための重要な考慮事項について説明します。このプロトコルは、病気の間にグローバルな遺伝子制御プロセスの勉強のために、心臓のクロマチンのプロテオーム解析を可能にするために開発されました。全プロテオーム質量分析実験を設計の主要なコンポーネントは、ダイナミックレンジと低濃度タンパク質を同定し、特徴づけることができるという問題です。核のプロテオームを濃縮、核およびクロマチン固有の生物学に関する情報の提供を第一の目標に加えて、核のさらなる亜分画が行うように、これらの低濃度タンパク質を検出らしさを向上させます。説明したようにしかし、成体心筋細胞は核膜に接続されている高密度の細胞骨格成分を持っています。我々は完全にこれらの他の細胞成分から核を精製していることを信じていません。しかし、核だけ豊かで、我々は入手していED説明解析の種類を有効にするには、許容可能なしきい値。

具体的には、我々は原油核ペレットの純度を評価するためにEMを使用し、無傷核、ミトコンドリアは約10％、残りの破片であることが分画の60から80パーセントを発見した。さらに、我々は無傷核集団における我々の以前の研究から、知っている多くの筋フィラメントは、このプロトコルの特定のタンパク質（calsarcin-1）濃縮されている（西によって測定されたチューブリンやアクチンを含む）の真の生物学的な人口を示唆することによって豊かにされていない間心臓核におけるこれらのタンパク質¹⁹

さらに、我々は、遺伝子オントロジーによって、これらのタンパク質の予測ロールに、酸抽出したクロマチン分画に存在することが判明したタンパク質を比較した。重要なのは、この遺伝子オントロジー分析はアカウントの異なるタンパク質の相対量（当社のウエスタンブロットデータの場合と同様に）を考慮していないのではなく、識別されたすべてのタンパク質（豊かカウント等しいとしてEDかどうかにかかわらず）共通の経路と細胞区画を識別する。これらの経路と細胞区画我々の以前の出版物で見つけることができるの分析^。18,20最も重要なことは、酸抽出したクロマチン分画の濃縮の成功は、私たちは成体マウスの心筋細胞の54ヒストン変異体の存在を識別するために許可され^、18そのうちの多くは、その身分を示す1ユニークなペプチドに頼って、従っておそらく合計心筋細胞プロテオームの膨大な複雑さを指定して、この濃縮プロトコルなしで検出可能でなかったでしょう。我々は心臓核から同定1048タンパク質のうち、そのうちの56例（5.3％）がヌクレオソーム（関心の核の1コンポーネント）の一部であるとの分析をGOで注釈された。心臓全体を見て別の研究では、わずか11タンパク質（0.18％）がヌクレオソーム²¹の一部であることを注釈されたうち、6180のタンパク質を同定した。これは、さらなるmeaningfuに、我々のプロトコルの強さを示してLLY核タンパク質を濃縮する。

5。タンパク質ゲルおよび酵素タンパク質消化

タンパク質は、質量分析計で実行されるように消化された一次元SDS-PAGEおよびトリプシンで区切られています。

1. サンプルを氷上で解凍し、ビシンコニン酸（BCA）タンパク質アッセイを用いて、各サンプルのタンパク質濃度を決定する。
2. 一次元SDS-PAGEのために-20℃で10分間、店舗用に5倍Laemmliバッファー、ボイルを使用して、既知の濃度になるように試料を希釈します。 2次元ゲル-20℃で尿素抽出バッファーとストアを使用して既知の濃度にサンプルを希釈します。
3. 各レーンに等量のタンパク質をロードする選択肢のゲルを実行します。タンパク質ウェスタンブロット法（ステップ4.1のコントロールと同じように）またはバンドに使用されるニトロセルロース膜に転写することができますが、質量分析のためにカットすることができます。次の手順を参照してください。
4. 清潔な容器にそれを転送するために脱イオン水を使用している装置からゲルを取り出します。オリオールでゲル染色し、光を遮断するためアルミホイルでラップ容器をカバーしています。ゲルは少なくとも90分間シェーカーで室温でインキュベートすることができます。
5. バンドはイメージにカットされた画像オリオール染色し、UV光を用いたゲル（ 図3）、マーク。 我々は合計プロテオームを測定する研究のために約25 mmの2バンドに各レーンを切った。
6. 清浄表面上にゲルを置きます。シール性を保持されているか、またはケラチン汚染を防止するために、エタノールを噴霧するだけの材料を使用してください。各バンドを切り出した後、さらに3等分にスライスする。独自のラベルの付いた1.5 mlチューブにまとめて、各バンドのすべての3つのピースを置きます。ゲル片は数ヶ月のために-20℃で保存することができます。
7. 酵素消化のためにゲルプラグを準備します。ダイジェストゲル片を37℃で一晩トリプシンを使用しています。詳細なゲル試料プロトコルのための私達の前の資料を参照してください^。22あなたは、トリプシンの代わりにキモトリプシンで低分子量のバンドを消化することができ、ヒストン尾部のトリプシンの広範な谷間を解消します。

6。質量分析とデータ解析

サンプルは、LCで分離し、MS / MSによって分析される。スペクトルは、タンパク質同定のタンパク質データベースに対して検索されます。

1. LC / MS / MSを介して各サンプルの10μlを実行します。我々は、75μmの逆相カラムを用いたナノフローEskigent LCを使用しています。タンパク質およびペプチドの範囲に最適化LC分析を使用しています。 （0.1％ギ酸、2％アセトニトリル[ACN]水）移動相から移動相Bの直線勾配を採用（0.1％ギ酸、ACN中20％水）：5％移動相Bの50から60分％Bは、定数95％Bで50％Bからついに95％B、10分〜15分は200 NL / minの流量を使用します。データ依存モードでの質量分析データを取得する。 我々はトップ6最も豊富な親イオンを断片サーモオービトラップを使用しています。
2. 繰り返しは、少なくとも3つの生物のために動作し、2つの技術的には複製されます。 （Recommended）
3. 検索アルゴリズム（例えばSEQUESTまたはマスコットとして）を経由して、選択したUNIPROTデータベースに対してスペクトルを検索し、（公に利用可能なオプションは、徘徊を含む、Xタンデム、SpectraST！市販オプションはBioWorksとXcaliburを含む）には、ソフトウェアを使用してください。
4. カルバミドメチルシステイン及びメチオニン酸化、サンプルの処理中に作成された2つの一般的な変更を可能にするために、検索パラメータを変更することを検討します。
5. 逆にデータベース検索を使用して偽陽性率を計算します。
6. しきい値の信頼のマッチだけを受け入れるようにタンパク質同定をフィルタリングします。我々は、で開始するには、次のパラメータをお勧めします。xcorrは> 3（2）> 4（3）> 5（4）; deltaCN> 0.1、コンセンサススコア≥20、親イオンの質量公差2 DA、質量公差プロダクトイオンは0.5 DAの、少なくとも2つのユニークなタンパク質あたりのペプチドおよびこれ以上より3裂を逃した。

7。ラベルフリー定量

Deteラベルフリー定量（ 図4）を用いたタンパク質の相対量をrmine。

1. ソフトウェアプログラムの数は、国勢調査（教授Yatesのグループ^）、23説明者（マイクロソフト^）、24篩（サーモサイエンティフィック^）、25足場（プロテオームソフトウェア）を含む質量分析データのラベルフリー定量化のために公にまたは市販されている^。26これらのプログラムは、無傷のペプチドまたは2つ以上の状態との間の相対的なタンパク質の量を有するペプチドシークエンシングのイベント数の質量信号を相関させることを目指しています。
2. 各プログラムは類似した解析パイプラインを組み込んだが、一部のプログラムがデータに対して実行できる特定の分析のタイプに制限されます。当初は、異なる実行からデータが整列し、信号強度が正規化されたペプチドのピークは分析のために選択される。
3. 二つの最も一般的な方法は、スペクトルカウントまたはLC-MSピーク面積に基づいて定量化されています。豊富比率が異なるグループ間のペプチド量の変化を決定するために計算されます。
4. これらのプログラムは、タンパク質の同定に定量情報を相関させるためにプロテオミクス検索アルゴリズム（マスコット、SEQUEST、X！タンデム）とインタフェースすることができます。
5. それは（質量分析計で複数回同じサンプルを実行している）生物（異なる実験試料）と技術の両方を組み込むことが重要であるデータの精度と再現性を確保するための質量分析データのレプリケートされます。
6. 実験条件との間のペプチド豊かさの変動をANOVAによって評価およびPCA（ 図5）を介してプロットすることができます。

ラベルフリー定量化のための重要な考慮事項。ラベルフリー定量を行う場合は、特別な注意は、各試料が処理され、別々に分析しなければならないので、一貫性のある試料調製、消化時間とLC-MS/MS条件を確保するために与えられなければならない。 METとは対照的に（ラベリングの欠如が一緒にそれらを実行する可能性を回避するため）abolicラベリング·アプローチは、ラベルフリーの実験で比較することにより、（サンプル準備のすなわち 、サンプル分析のすべての面で高い再現性を必要と、異なる質量分析実行からのデータに作られていますLCとMSの手順）と高質量精度質量分析計を用いる。

試料調製及び分析知られている標準のわずかな変化を把握するために、データの正規化を支援するために、各試料に添​​加してもよい。また、ほとんどのソフトウェアプログラムは、注射、イオン化し、断片化の違いを考慮するために、データ取得後のシグナル強度（バックグラウンドノイズまたは既知の豊富な検体に調整することによって、 など ）の標準化を可能にします。整列アルゴリズムは、ペプチド溶出プロファイルの違いを補正するのに役立つ上に参照したソフトウェアプログラムのほとんどに存在します。生物学的および技術的レプリケートの使用が不可欠であるそれは統計解析は、タンパク質が豊富で、任意の観測された変化の再現性と一貫性を確認することができるように、研究のこのタイプでは必須の条件です。

結果

図4は、相対定量のこの形式の有用性を強調しています。左側のパネルに表示されているタンパク質HMGB1（データベース検索を経由して識別される）に属するものとして指定されている個々のモノペプチドのピークは（異なるマウスから重ねて）である。各ピークは、本質的に与えられたペプチドの抽出イオンクロマトグラフは、異なるマウスから来ている。 3生物学的なグルー?...

ディスカッション

核の単離のための2つの主な方法は、以前に検討されている^：27 1は、水性スクロース/塩溶液中で組織を均質化する非水系溶媒に凍結乾燥組織を均質化するベーレンス技術そして第二に、我々はここで使用しているかに変更、です続く差動または密度勾配遠心分離による。

組織サンプルの酸抽出による核の亜分画は、ヒストンを分析するためにある本来の目的で196...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号
Dulbeco改変イーグル培地	インビトロジェン	11965
プロテアーゼペレット	ロッシュ	04 693 159 001
100μmのストレーナー	BDファルコン	352360
Ultracutミクロトーム	ライヘルト
100CX透過電子 顕微鏡	JEOL USA社
コウライウグイス	BioRad社	161-0496
ヒストンH2A抗体	サンタクルス	SC-8648
ヌクレオポリンP62抗体	BD Biosciences社	610498
アデニンnucleo潮トランスポーター抗体	サンタクルス	SC-9299
BiPの抗体	サンタクルス	SC-1050
チューブリン抗体	シグマ	T1568
ヒストンH3抗体	アブカム	ab1791
フィブリラリン抗体	細胞シグナリング	C12C3
SNRP70抗体	アブカム	ab51266
E2F-1抗体	サーモフィッシャー	MS-879
網膜芽細胞腫の抗体	BD Biosciences社	554136
低酸素誘導因子-1抗体	ノーバスバイオ	NB100-469
BCAタンパク質アッセイ	サーモサイエンティフィック	23227
相カラムを反転	新しいOBJective	PFC7515-B14-10
BioWorksブラウザ	サーモサイエンティフィック