在疾病的染色质蛋白质组的定量分析

摘要

允许在质谱高通量分析蛋白的表达和组织了一系列修改。结合亚细胞的分馏和疾病模型，定量质量法和生物信息学在生物系统中发现新的属性。这里描述的方法分析染色质相关蛋白在心脏疾病的设置和容易地适用于其他人类疾病的模型。

摘要

在位于细胞核内的蛋白质组，其功能是最密切相关的基因调控。成年哺乳动物的心肌细胞的核是独特的，由于双核细胞的百分比很高^，1为主的异染色质的DNA的状态，和非分割的性质的心肌细胞呈现成人细胞核在相间的永久状态^。2在开发过程中的转录调控和病已经很好的研究在此器官^{​​，3-5，}但仍然相对未开发的核蛋白质负责DNA的包装和表达所扮演的角色，以及如何将这些蛋白质控制转录程序的变化过程中发生的疾病。在发达国家世界，心脏疾病是男性和女性的头号死亡原因^。7洞察核蛋白质合作，如何规范这种疾病的进展是至关重要的推进，目前的治疗Ø的选项是。

质谱法是解决这些问题的理想工具，因为它允许一个公正的核蛋白质组的注释和相对定量，这些蛋白质丰富的变化与疾病。虽然有过几次蛋白质组学研究哺乳动物核蛋白质复合物^，8-13，直到最近，只有一个心脏的核蛋白质组研究，并认为整个细胞核，而不是研究蛋白质组的在核分舱水平¹⁵在很大程度上，这不足的工作是由于隔离心脏核的难度。心肌细胞核内发生的刚性和密集的肌动蛋白-肌球蛋白设备通过它们所连接的多个扩展名从内质网的范围内，心肌细胞的收缩改变他们的整体造型^。16此外，心肌细胞线粒体40％第¹⁷卷necessita韭细胞核富集除了从其他细胞器。在这里，我们描述了一个协议，用于心肌核浓缩和进一步的分离与生物相关的车厢。此外，我们无标记定量质谱夹层这些馏分技术适合于在各种动物模型和器官系统的代谢标记是不可行的体内实验的详细方法。

研究方案

实验工作流包含七个主要步骤（ 图1）。对于任何有关的工作，将运行在质谱仪的样品，实验人员应穿白大褂，手套和头发网和照顾，以避免污染，灰尘和脱落的角质个人。

1。心同质化和核孤立

小鼠心脏均化和一个完整的核颗粒中分离（ 图2）。

1. 牺牲成年小鼠，切除心脏，在冰冷的PBS冲洗，并在冰上摇匀玻璃DOUNCE（我们优选从Fisher的威敦组织磨床，＃08-414-13A，但其它方法也同样出色的工作）含有2毫升裂解缓冲液（低渗溶液，其中差分溶解细胞膜的细胞器，包括细胞核）（10mM的Tris pH为7.5，15 mM氯化钠，0.15％体积/体积NONIDET P-40 [NP-40]在去离子水中加蛋白酶和磷酸我nhibitor混合物：10mM的丁酸钠，0.1 1mM苯甲磺酰氟[PMSF]，0.2毫摩尔的Na ₃ VO _4，0.1mM的NaF和1罗氏蛋白酶pellet/10毫升-裂解缓冲液可以存储最多一周的在-20℃下）。 （ 注：我们不觉得有必要与PBS灌注的心，我们的质谱数据，GO分析鉴定的蛋白质为主心肌细胞的P-值3.8E-22]，而不是起源于血液污染[p值5.0 E-2]）。
2. 倒裂解液通过100微米的过滤器，并通过收集流量1.5 mL离心管中。在这一点上，除非特别指明，样品应保存在冰中。
3. 4,000 rpm离心5分钟，在4℃下离心
4. 除去上清液。 （这是胞质溶胶中，并应贮存于-80℃。包含溶解的线粒体。）沉淀重悬在200μl裂解缓冲液由捣碎。 （这是粗核丸）。
5. 用1毫升蔗糖的buff填充1.5毫升离心管中蔗糖24％重量/体积，pH为7.5的10mM Tris，和15mM NaCl在与蛋白酶的去离子水/磷酸酶抑制剂混合物（呃 - 蔗糖缓冲液应在使用当天新鲜）。轻轻层，将重新悬浮的颗粒蔗糖垫的顶部和离心机在5,000 rpm，10分钟，在4℃下
6. 拆下顶部的薄膜上，以及蔗糖垫（包含膜）。冲洗剩余的沉淀用200μl冰冷的PBS / EDTA（1×PBS，用1mM EDTA）。 （这是细胞核沉淀和蛋白质印迹或电子显微镜中使用的，可以溶解或固定[见步骤4.1和4.2]量化富集。）

2。核质和洗涤剂提取的染色质分馏

将粗核沉淀被分离成核质和洗涤剂提取染色质馏分，含有蛋白质与DNA松散联系。

1. 捣碎颗粒从步骤1.6的洗涤剂在200μl提取缓冲液（20 mM HEPES的pH为7.6，7.5毫摩尔MgCl _2。 1 M尿素，30 mM氯化钠，0.2mM的EDTA，1％NP-40中的去离子水与蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物 - 洗涤剂提取缓冲液可以存储最多一周的在-20℃）。
2. 涡样品2次，每次10秒。放置在冰上10分钟。
3. 离心机以13,000 rpm离心5分钟，在4℃下
4. 除去上清液。 （这是核质，并应贮存在-80℃下）。冲洗沉淀，用冰冷的PBS / EDTA。 （这是染色质的颗粒。）
5. 捣碎沉淀中加入300μl的Tris，SDS，EDTA缓冲液（50mM的Tris pH值7.4，10mM的EDTA，1％SDS在去离子水中用蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物 - 的Tris，SDS，EDTA缓冲液可以保持长达1周-20°C）。
6. 超声波清洗3-6次，持续10秒，打破了DNA。保持样品在冰之间的超声处理。
7. 离心机以13,000 rpm离心5分钟，在4℃下保留上清液。 （上清液的洗涤剂提取染色质蛋白fraction和应保持在-80℃）。余下的颗粒应该是小的，并且可以被丢弃。
8. 如果使用的，而不是整个心脏的离体心肌细胞：分离新生大鼠心室肌细胞从出生后幼鼠1天，用酶消化，其次是文化的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），10％胎牛血清（FBS），1％的胰岛素转亚硒酸钠（ITS），和1％青霉素。 24小时后，转移到无血清培养基（同上，但缺乏FBS）。收获细胞裂解缓冲液（1.1），并开始核分馏步骤1.3。

3。酸萃取分馏 - DNA结合蛋白的富集

一个单独的分馏丰富的蛋白质紧密地结合到DNA上，包括组蛋白。

1. 重复步骤1.1-2.4。
2. 捣碎的染色质的颗粒在400微升0.4 N硫酸。涡删除团块。
3. 在4℃下孵育30分钟或overnIGHT而旋转。
4. 在16000 XG离心10分钟，在4°C，以消除核碎片。
5. 上清转移到一个新的管。
6. 三氯乙酸逐滴上清液中加入132μl。反转几次。在冰上孵育30分钟。
7. 在4℃下以16,000 xg离心10分钟，离心
8. 弃去上清液。轻轻漂洗沉淀用冰冷的丙酮。 （这是组蛋白的颗粒。）
9. 在4℃下以16,000 xg离心10分钟，离心
10. 重复洗，步骤3.8-3.9。
11. 空气干燥沉淀。
12. 将沉淀重悬于100微升的Tris，SDS，EDTA缓冲液。通过加入1M Tris，设置pH至8。 （使用的1 M Tris股票，PH值不调整）。
13. 超声水浴中15分钟。冰水浴防止过热。 （这是萃取的酸部分，并应贮存于-80℃。）

4。纯度检查

Western印迹和电子显微镜确认成功富集的细胞核和其他细胞器的枯竭。要看到所有的下列质量控制分析的典型结果，请参见我们之前发表的^。18

1. 进行Western blot分析。探头的膜含有各馏分的组蛋白H2A nucleoporin的p62的（为核标记验证富集），和腺嘌呤核苷酸转运体，BiP和微管蛋白（作为线粒体标记，内质网的标记，和细胞骨架的标记分别验证纯度）。为了验证成功subfractionation的原子核，探头组蛋白H3或核仁纤维（洗涤剂和酸提取细胞核染色质和完整的）和SNRP70或E2F（核质）。 2002视网膜母细胞瘤或缺氧诱导因子-1（在洗涤剂中提取染色质丰富，酸提取部分）。额外的控制样品的HeLa细胞裂解液和整个心脏裂解液也可以运行在同一凝胶：准备HeLa细胞裂解液加入三，SDS，ED的控制TA缓冲液的培养皿中，用细胞刮刀收集样品。超声波清洗离心样品的步骤2.6-2.7。通过均质化的心脏在2ml缓冲液（20mM的Tris pH值7.4，150mM的NaCl，1mM的EDTA，1mM的EGTA，1％的Triton X-100，2.5 mM的焦磷酸钠，在去离子水中的1mM的磷酸甘油准备整个心脏溶解物控制用蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物）。超声波清洗和离心的步骤2.6-2.7。请参阅第5步中，用于制备蛋白质样品进行SDS-PAGE。
2. 电子显微镜：细胞核沉淀重悬于含有2％戊二醛在裂解缓冲液从步骤1.6和修复样品在4℃下冲洗样品在锇酸，脱水，并嵌入在环氧树脂中。把70纳米片使用赖克特ULTRACUT超薄切片机。染色醋酸铀和铅和图像使用JEOL 100CX透射电子显微镜的样品。丰富的量化测量完整的细胞核的面积与总面积的材料成像， 我们发现60％至80％的核是完整的^。

重要的考虑因素，富集与净化核。该协议的目的是使心脏染色质蛋白质组分析的研究全球基因调控过程，在疾病的目的。全蛋白质组质谱实验设计的一个重要组成部分，是动态范围和低丰度蛋白能够识别和表征的问题。除提供核染色质特定的生物学信息，丰富的核蛋白质的主要目标，这些低丰度蛋白的检测，增加了调子一样进一步subfractionation的原子核。然而，正如所讨论的，成人的心肌细胞具有致密的细胞骨架成分连接到核膜。我们不认为我们已经完全纯化的细胞核从其他细胞成分。然而，仅通过丰富的原子核，我们有获得编的可接受阈值，使分析的类型描述。

具体而言，我们已经使用了EM，以评估我们的粗核颗粒的纯度，并发现60％至80％的馏分是完整的细胞核中，大约10％的线粒体，其余的碎片。此外，我们知道，从我们以前的研究完整的细胞核人口，而许多肌原纤维丰富的协议（包括微管蛋白和肌动蛋白，采用Western），丰富的某些蛋白质（calsarcin-1），这表明一个真正的生物种群的这些蛋白在心脏核¹⁹

此外，我们比较的蛋白质，我们发现本萃取酸染色质馏分中，预测的角色，这些蛋白质通过基因本体。更重要的是，这种基因本体论分析没有考虑到不同的蛋白质的相对丰度（如Western blot检测数据），而是计算所有蛋白质（丰富ed或不）相等时，确定共同的途径和细胞区室。这些途径和细胞区室分析，可以发现在我们以前的出版物中^，18,20最重要的是，丰富的酸提取的染色质部分的成功使我们能够识别54个组蛋白变体的存在，在成年小鼠的心肌细胞^，18其中许多依赖于一个独特的识别肽，并因此可能不会被检测到没有这个浓缩的协议总心肌细胞蛋白质组的巨大复杂性。我们发现从心核的1048个蛋白质，其中56（5.3％）注释GO分析的一个组成部分的核心利益的核小体（）的一部分。在整个心脏的另一项研究，确定了6180蛋白质，其中只有11个蛋白（0.18％）是注释的一部分的核小体^21。这进一步说明了我们的协议实力meaningfuLLY丰富的核蛋白质。

5。蛋白质凝胶和酶蛋白精华

蛋白质是由一维SDS-PAGE和胰蛋白酶消化质谱仪上运行分离。

1. 解冻样品在冰上，并确定使用二辛可宁酸（BCA）蛋白质测定每个样品的蛋白质浓度。
2. 稀释样品到一个已知浓度的5倍Laemmli缓冲液，煮沸10分钟，并储存在-20°C的一维SDS-PAGE。稀释样品到一个已知的浓度使用尿素提取缓冲液并储存在-20℃下的二维凝胶。
3. 加载等于每个泳道中的蛋白量，选择运行凝胶。蛋白质可以被转移到硝酸纤维素膜用于Western印迹法（如在步骤4.1中，与对照）或频带可以削减用于质谱分析，参见以下步骤。
4. 使用去离子水，将它转移到一个干净的容器从装置中取出凝胶。覆盖凝胶，黄鹂染色，包装容器铝箔挡光。允许凝胶在振荡器上在室温下孵育至少90分钟。
5. 图片黄鹂染色的凝胶（ 图3）UV光，标记的图像乐队将被削减。 我们把每个车道约25毫米波段测量总蛋白质组的研究。
6. 将凝胶到一个干净的表面。仅使用材料一直保持密封或喷用乙醇，以防止角蛋白污染。剪下每个波段，然后再切分成3等份。将各带三件一起到自己的标记1.5 ml管。凝胶片可以存储在-20℃，数个月。
7. 准备凝胶插头酶消化。月刊凝胶片使用胰蛋白酶于37℃培养过夜。对于详细的凝胶样的协议，请参见我们之前发表的²²可以代替胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶消化的低分子量条带，消除胰蛋白酶裂解广泛的组蛋白尾部。

6。质谱法和数据分析

样品上的LC分离，并通过MS / MS进行分析。光谱对蛋白质鉴定蛋白质数据库的搜索。

1. 运行10μl的每个样品通过LC / MS / MS分析。我们使用了纳米流Eskigent LC 75微米反相柱。使用优化的范围内的蛋白质和肽的LC运行。采用一种线性梯度从流动相A（含0.1％甲酸，2％乙腈[ACN]在水中），流动相B：60分钟（0.1％甲酸的乙腈溶液，20％的水）从5％流动相B 50 ％的B，然后从50％B到95％B 15分钟，最后10分钟以恒定的95％B.使用200升/分钟的流速。采集质谱数据，在数据依赖的模式。 我们用一个热的Orbitrap最丰富的母离子的碎片。
2. 重复运行至少三个生物，两个技术复制。 （Recommended）
3. 使用软件（市售的选项包括BioWorks和Xcalibur建立公开可用的选项包括PROWL，X！串联，SpectraST）的UniProt数据库的选择通过光谱对搜索的搜索算法（如SEQUEST或吉祥物）。
4. 考虑修改搜索参数，以使半胱氨酸的carbamidomethylation和蛋氨酸氧化，来样加工过程中的两个共同创建的修改。
5. 计算使用反向数据库检索的假阳性率。
6. 过滤蛋白质的鉴定，只接受比赛的阈值的信心。我们推荐以下的参数来启动：Xcorr 3（+2），4（3），5（+4）; deltaCN> 0.1，共识得分≥20，质量误差2张大为母离子，质量公差0.5沓产物离子，至少2种独特的每蛋白的肽和不超过3错过分裂。

7。无标记定量

DETErmine的相对丰度蛋白无标记定量（ 图4）。

1. 许多软件程序是公开的或市售的无标记定量质谱数据，包括普查（耶兹的教授组^），23的 Elucidator（微软^），24 SIEVE（赛默科学^），25脚手架（蛋白质组软件^）。26这些方案的目的是相互关联的完整肽的质谱信号或两个或两个以上国家的数量与相关蛋白肽测序事件的数量。
2. 虽然每个程序采用了类似的分析管道，一些方案限定的类型的具体的分析，可以对数据执行的。最初，从不同的运行中的数据对准，信号强度的归一化和肽峰被选作分析。
3. 两种最常见的方法是量化的基础上光谱计数或LC-MS峰面积。丰富比例的计算方法，以确定不同群体之间的肽丰度的变化。
4. 这些程序可以与蛋白质组学搜索算法（吉祥物，SEQUEST，X！TANDEM）相关蛋白质鉴定的定量信息。
5. 为了确保数据的准确性和可重复性的关键是将两种生物（不同的实验样品）和技术（质谱仪多次运行相同的样品）质谱数据进行复制。
6. 和实验条件之间的肽丰度的变化，可以评估由方差分析和绘制通过PCA（ 图5）。

无标记定量重要的考虑因素。进行无标记定量时，必须特别注意，因为每个样本必须分别进行处理和分析，以确保一致的样品制备，消化时间和LC-MS/MS条件。在对比遇见从不同的运行质谱（标记方法abolic，比较无标记的实验数据的标签，因为缺乏消除他们一起运行的可能性），从而有必要进行高重现性样品分析的各个方面（ 即样品制备， LC和MS步骤）和高的质量准确度质谱仪的使用。

轻微的变化，在一个已知的标准样品制备和分析到账户可以被添加到每个样品的数据归一化，以协助。此外，大多数软件程序允许正常化的信号强度（ 例如，通过调整背景噪声或已知的丰富的分析）后注射，电离和碎裂的差异数据采集帐户。比对算法中存在的大部分的以上提及的软件程序，以协助在纠正在肽的洗脱曲线的差异。利用生物技术复制埃森TiAl金属在这种类型的研究，因为它允许统计分析，以确认蛋白丰度的任何观察到的变化的可重复性和一致性。

结果

图4显示这种形式的相对定量的效用。在左侧面板是个别的单一同位素肽峰（覆盖从不同的鼠标），它已被指定为属于蛋白HMGB1（通过数据库检索标识）。每个峰值，本质上是一个给定的肽的提取离子色谱仪，来自不同的鼠标。这些团体代表三种不同的生理状态：基础，心肌肥厚，心脏衰竭，有三个生物复制为每个组。通过集成的曲线下的面积，可以计算出的相对丰度。在中间面板中?...

讨论

核分离的两个主要方法已被先前评论^：27 1是均质冻干组织中的非水溶剂中的贝伦斯技术和第二，其中在这里，我们使用的变形例，在水性的蔗糖/盐溶液均质组织随后由差分或密度梯度离心。

Subfractionation的核酸提取的组织样本，研究与原来的目标是分析组蛋白染色质已自1960年以来^，28的重要工具。酸提取协议开发为实现这一目标的纯化核心的核小体的组蛋白...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录编号
Dulbeco改良的Eagle培养基	Invitrogen公司	11965
蛋白酶颗粒	罗氏公司	04 693 159 001
100微米过滤器	BD猎鹰	352360
ULTRACUT超薄切片机	赖克特
100CX透射电子 显微镜	，JEOL美国公司
莺	BioRad公司	161-0496
组蛋白H2A抗体	圣克鲁斯	SC-8648
Nucleoporin P62抗体	BD Biosciences公司	610498
腺嘌呤核苷酸潮转运抗体	圣克鲁斯	SC-9299
Bip抗体	圣克鲁斯	SC-1050
微管蛋白抗体	西格玛	T1568
组蛋白H3抗体	Abcam公司	ab1791
核仁纤维蛋白抗体	细胞信号转导	C12C3
SNRP70抗体	Abcam公司	ab51266
E2F-1抗体	赛默飞世尔	MS-879
视网膜母细胞瘤抗体	BD Biosciences公司	554136
缺氧诱导因子-1抗体	诺伟司生物制品	NB100-469
BCA蛋白检测	Thermo Scientific的	23227
反相柱	新的OBJective	PFC7515-B14-10
BioWorks浏览器	Thermo Scientific的