Análise quantitativa de proteomas cromatina na Doença

Resumo

Avanços na espectrometria de massa permitiu a análise de alto rendimento de expressão da proteína e da modificação de uma série de tecidos. Combinada com fraccionamento subcelular e modelos de doença, a massa espectrometria quantitativa e bioinformática pode revelar novas propriedades nos sistemas biológicos. O método aqui descrito analisa cromatina proteínas associadas na definição de doença cardíaca e é prontamente aplicável a outras In vivo Modelo de doenças humanas.

Resumo

No núcleo residem os proteomas cujas funções são mais intimamente ligada com a regulação dos genes. Núcleos de cardiomiócitos de mamíferos adultos são únicos, devido à alta porcentagem de células binucleadas, ^um estado predominantemente heterocromático do DNA, ea natureza não-divisão da cardiomiócitos que torna núcleos de adultos em um permanente estado de interfase. Regulação transcricional ² durante o desenvolvimento e doença têm sido bem estudado neste órgão, ^3-5 mas que continua a ser relativamente pouco explorado o papel desempenhado pelas proteínas nucleares responsáveis ​​pela embalagem de ADN e de expressão, e como estas proteínas controlar alterações em programas de transcrição que ocorrem durante a doença. ⁶ No desenvolvido mundo, a doença cardíaca é a causa número um de morte para homens e mulheres. ⁷ dicas sobre como proteínas nucleares cooperar para regular a progressão da doença é fundamental para o avanço do atual tratamento oPÇÕES.

Espectrometria de massa é a ferramenta ideal para abordar estas questões, pois permite uma anotação imparcial da quantificação nuclear proteoma e relativo como a abundância destas proteínas mudanças com a doença. Embora tenha havido vários estudos proteômicos para mamíferos complexos proteicos nucleares, ^8-13, até recentemente, ^14, tem havido apenas um estudo examinando o proteoma nuclear cardíaco, e é considerado todo o núcleo, em vez de explorar o proteoma ao nível dos sub compartimentos nucleares . ¹⁵ Em grande parte, esta falta de trabalho é devido à dificuldade de isolar núcleos cardíaca. Núcleos cardíaco ocorrem dentro de uma superfície rígida e densa aparelho actina-miosina ao qual estão ligados através de várias extensões do retículo endoplasmático, na medida em que se altera a contração do miócito sua forma geral. ¹⁶ Além disso, os cardiomiócitos são de 40%, em volume, ¹⁷ mitocôndrias que necessitates enriquecimento do núcleo além dos outros organelos. Aqui nós descrevemos um protocolo de enriquecimento nuclear cardíaca e fraccionamento em compartimentos biologicamente relevantes. Além disso, os métodos detalhados para a etiqueta livre de dissecção de massa espectrométrica quantitativa destas fracções-técnicas passíveis de experimentação in vivo em vários modelos animais e sistemas de órgãos, onde marcação metabólica não é viável.

Protocolo

O fluxo de trabalho experimental contém sete etapas principais (Figura 1). Para qualquer trabalho envolvendo amostras que serão executados no espectrômetro de massa, o pesquisador deve vestir um jaleco, luvas e rede de cabelo e tomar cuidado para evitar a contaminação de poeira e derramamento pessoal de queratina.

1. Homogeneização coração e Isolamento Nuclear

Corações de rato são homogeneizados e um núcleo intacto pellet é isolado (Figura 2).

1. Sacrificar rato adulto, extirpar o coração, lavar em PBS gelado, e homogeneizar em gelo em Dounce de vidro (nós preferimos o triturador de tecidos Wheaton de Fisher, # 08-414-13A, mas outros métodos podem funcionar igualmente bem), contendo 2 ml de tampão de lise (uma solução hipotónica qual diferencialmente lisa a membrana celular ao longo dos organelos, incluindo o núcleo) (10 mM Tris pH 7,5, 15 mM NaCl, e 0,15% v / v Nonidet P-40 [NP-40] em água desionizada mais protease e fosfatase imistura nhibitor: 10 mM de butirato de sódio, 0,1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo [PMSF], 0,2 mM Na ₃ VO _4, 0,1 mM NaF e uma protease Roche pellet/10 ml - tampão de lise pode ser armazenado durante até uma semana à temperatura de -20 ° C ). (Nota: Nós não achar necessário para perfundir o coração com PBS, como os nossos dados de espectrometria de massa e GO análise identificar as proteínas como predominantemente cardiomiócitos [valor-p 3.8E-22] de origem ao invés de contaminação sanguínea [valor p 5,0 E-2).]
2. Despeje lisado a 100 ^ m e recolher o filtro de fluxo através de tubo de centrífuga de 1,5 ml. Neste ponto, a menos que especificado, a amostra deverá ser mantida em gelo.
3. Centrifugar a 4000 rpm durante 5 min a 4 ° C.
4. Remover o sobrenadante. (Este é o citosol, e deve ser armazenado a -80 ° C. Contém as mitocôndrias lisada.) Ressuspender o sedimento em 200 ul de tampão de lise de trituração. (Esta é a nuclear rudimentar pelota.)
5. Encher 1,5 ml tubo de centrifugação com 1 ml de sacarose lustreer (peso de 24% de sacarose / volume, Tris 10 mM, pH 7,5, e 15 mM de NaCl em água desionizada com protease / inibidor da fosfatase mistura - tampão de sacarose deve ser feita no próprio dia da utilização). Suavemente a camada de sedimento ressuspenso no topo da almofada de sacarose e centrifugar a 5000 rpm durante 10 min a 4 ° C.
6. Remover a película fina no topo, bem como a almofada de sacarose (que contêm membrana). Enxaguar o sedimento restante com 200 ul de PBS gelado / EDTA (1x PBS com EDTA 1 mM). (Este é o núcleo da pelota e podem ser solubilizados ou fixado para uso em microscopia de western blotting ou de electrões [Ver as etapas 4.1 e 4.2] para quantificar o enriquecimento.)

2. Nucleoplasma e extraiu-Detergent Fractionation Cromatina

O sedimento bruto núcleos é separado em um nucleoplasma e detergente-extraída fracção de cromatina, contendo proteínas fracamente associados com o DNA.

1. Triturar pellet a partir do passo 1.6 em 200 ul de tampão detergente de extracção (20 mM HEPES pH 7,6, 7,5 mM MgCl _2. 0,2 mM EDTA, 30 mM de NaCl, 1 M de ureia, 1% de NP-40 em água desionizada com protease / inibidor da fosfatase mistura - de tampão de extracção de detergente pode ser armazenado durante até uma semana à temperatura de -20 ° C).
2. Vortex amostra de 2 vezes, 10 segundos cada um. Colocar em gelo 10 min.
3. Centrifugar a 13.000 rpm durante 5 min a 4 ° C.
4. Remover o sobrenadante. (Este é o nucleoplasma e deve ser armazenado a -80 ° C). Enxaguar pellet com PBS gelado / EDTA. (Este é o sedimento de cromatina.)
5. Tritura-se o granulado em 300 ul de Tris, SDS, tampão de EDTA (50 mM Tris pH 7,4, EDTA 10 mM, SDS a 1% em água desionizada, com protease / inibidor da fosfatase mistura - Tris, SDS, tampão de EDTA pode ser mantido durante até uma semana à -20 ° C).
6. Sonicate 3-6 vezes por 10 segundos cada para quebrar o DNA. Mantenha amostra em gelo entre sonicações.
7. Centrifugar a 13.000 rpm durante 5 min a 4 ° C. Manter o sobrenadante. (O sobrenadante é o detergente-proteína extraída cromatina fraccionamenton e deve ser mantido a -80 ° C). O sedimento remanescente deve ser pequeno e pode ser eliminada.
8. Se usar miócitos isolados, em vez de todo o coração: Isolar miócitos ventriculares de ratos neonatos de crias de rato um dia após o nascimento utilizando digestão enzimática, seguido por cultura em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de insulina -transferrina-selenite de sódio (STI), e 1% de penicilina. Após 24 horas, a transferência para meio isento de soro (o mesmo que acima, mas sem FBS). Células colheita em tampão de lise (listados no 1.1), e começar fracionamento nuclear no passo 1.3.

3. Ácido-extracção Fractionation - DNA-bound Enriquecimento Protein

A separadas enriquece fraccionamento de proteínas de ligação forte com o DNA, incluindo as histonas.

1. Repita os passos 1,1-2,4.
2. Tritura-se o sedimento em 400 ul de cromatina de 0,4 N de ácido sulfúrico. Vortex para remover aglomerados.
3. Incubar a 4 ° C durante 30 min ou overnight durante a rotação.
4. Centrifugar a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C para remover os restos nucleares.
5. Transferir o sobrenadante para um novo tubo.
6. Adicionar 132 ul de ácido tricloroacético a gota a gota, ao sobrenadante. Inverter várias vezes. Incubar em gelo durante 30 min.
7. Centrifugar a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
8. Elimine o sobrenadante. Lave pellet com acetona gelada. (Este é o pellet de histona.)
9. Centrifugar a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
10. Repita lavagem, as etapas de 3,8-3,9.
11. Ar seco pellet.
12. Ressuspender o sedimento em 100 ul de Tris, SDS, EDTA. Definir a pH 8 pela adição de 1 M de Tris. (Use um 1 M Tris estoque que não é pH ajustado).
13. Sonicar em banho-maria durante 15 min. Evitar o superaquecimento, adicionando gelo para banho-maria. (Isto é a fracção extraídas com ácido e deve ser armazenado a -80 ° C.)

4. Verifique Pureza

Western blot e microscopia eletrônicaconfirmar enriquecimento sucesso dos núcleos e do esgotamento de outros organelos. Para ver os resultados típicos para todos os ensaios de controle de qualidade a seguir, consulte a nossa publicação anterior. ¹⁸

1. Realizar a análise de Western blot. Membrana sonda contendo cada fracção por H2A histona ou p62 nucleoporin (como marcadores nucleares para verificar enriquecimento), e para transportador de nucleótido de adenina, BiP e tubulina (como um marcador mitocondrial, marcador retículo endoplasmático, e marcador do citoesqueleto, respectivamente, para verificar a pureza). Para verificar subfractionation sucesso dos núcleos de sonda, para a histona H3 ou fibrilarina (detergente e extraídas com ácido núcleos cromatina e intacta) e SNRP70 ou E2F (nucleoplasma). Sonda para retinoblastoma ou induzível hipóxia factor-1 (enriquecido em detergente extraído da cromatina ao longo extraídas com ácido e fracção). Amostras adicionais de controle de HeLa lisado celular e lisado de todo o coração também pode ser executado no mesmo gel: Prepare HeLa controle lisado celular adicionando Tris, SDS, EDTA tampão a placa de cultura e utilizar um raspador de células para recolher amostra. Sonicar e centrifugar amostra, tal como nos passos 2,6-2,7. Prepare controle lisado todo coração por homogeneização do coração em 2 ml de tampão (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% de triton X-100, 2,5 mM de pirofosfato de sódio, 1 mM de glicerofosfato em água desionizada com protease e mistura inibidor de fosfatase). Sonicar e centrifugar tal como nos passos 2,6-2,7. Ver passo 5 para a preparação de amostras de proteína por SDS-PAGE.
2. Microscopia Electrónica: Ressuspender o pellet núcleos de 1,6 passo em tampão de lise contendo glutaraldeído a 2% e corrigir amostra a 4 ° C. Enxágüe amostras em ácido ósmico, desidratar e incorporar em resina epóxi. Corte 70 fatias nm usando uma Reichert Ultracut ultramicrótomo. Mancha amostras em acetato de uranila e chumbo e imagem usando um Microscópio Eletrônico de Transmissão JEOL 100CX. Quantificar o enriquecimento através da medição da área de núcleos intactos versus área total do material de imagens. Encontramos 60-80% de núcleos deestar intacto. ¹⁴

Considerações importantes para enriquecer contra purificar núcleos. Este protocolo foi desenvolvido para permitir análises proteômicas de cromatina cardíaca com o objetivo de estudar os processos de regulação gênica global durante a doença. Um componente importante da concepção de todo o proteoma experimentos de espectrometria de massa é a questão da faixa dinâmica e ser capaz de identificar e caracterizar baixa abundância proteínas. Para além do objectivo principal de fornecer informação sobre a biologia e a cromatina nuclear específica, enriquecendo para o proteoma nuclear, aumenta a probabilidade de detecção destas proteínas de baixa abundância, tal como subfractionation adicional do núcleo. No entanto, como discutido, o cardiomiócito adulto tem uma componente do citoesqueleto denso ligado à membrana nuclear. Nós não acreditamos que temos completamente purificados os núcleos desses outros componentes celulares. No entanto, através do enriquecimento apenas para os núcleos, temos obtered um limite aceitável para permitir que os tipos de análise descrito.

Especificamente, utilizou-EM para avaliar a pureza do nosso bruto núcleos pellet e encontrou 60-80% da fracção a ser os núcleos intactos, cerca de 10% a mitocôndria, e o restante de detritos. Além disso, sabemos do nosso estudo anterior sobre a população núcleos intacta, enquanto que miofilamentos muitos não são enriquecidas por este protocolo (incluindo tubulina e actina medida pelo ocidental) de certas proteínas (calsarcin-1) são enriquecidos, sugerindo uma população verdade biológica estas proteínas nos núcleos cardíaca ^19.

Adicionalmente, compararam-se as proteínas que se verificou estar presente na fracção de cromatina extraídas com ácido e, para as funções destas proteínas preditas por ontologia gene. É importante notar que esta análise ontologia gene não leva em conta a abundância relativa das diferentes proteínas (tal como os dados de Western blot), mas antes conta com todas as proteínas identificadas (enriquecered ou não) como igual ao identificar vias comuns e compartimentos celulares. A análise destas vias e compartimentos celulares podem ser encontrados nas nossas publicações anteriores. ^18,20 Mais importante ainda, o sucesso do enriquecimento da fracção cromatina extraídas com ácido e permitiu identificar a presença de 54 variantes de histonas no miócito rato adulto, ¹⁸ muitos dos que se baseava em um peptídeo único para a identificação e, assim, provavelmente não foram detectáveis ​​sem este protocolo enriquecimento dada a enorme complexidade do proteoma cardiomiócitos total. Dos 1.048 proteínas que identificamos dos núcleos cardíaca, 56 deles (5,3%) foram anotados por análise IR para ser parte do nucleossoma (um componente do núcleo de interesse). Outro estudo que olha o coração todo, identificado 6,180 proteínas, das quais apenas 11 proteínas (0,18%) foram anotados para fazer parte do ²¹ nucleossoma. Isto ilustra a força do nosso protocolo para meaningfully enriquecer para as proteínas nucleares.

5. Gel de proteína enzimática e Protein Digest

Proteínas são separadas por um dimensional SDS-PAGE e tripsina digerido para ser executado no espectrômetro de massa.

1. Descongelar as amostras em gelo e determinar a concentração de proteína de cada amostra utilizando o ácido bicinconínico (BCA) de ensaio de proteínas.
2. Diluir as amostras para uma concentração conhecida utilizando tampão de Laemmli 5x, fervendo durante 10 min e armazenar a -20 ° C para uma dimensão de SDS-PAGE. Diluir as amostras para uma concentração conhecida usando tampão de extracção de ureia e armazenar a -20 ° C para os géis bidimensionais.
3. Executar gel de escolha carga igual quantidade de proteína em cada pista. A proteína pode ser transferida para uma membrana de nitrocelulose, a ser utilizado para transferência de Western (tal como com os controlos no passo 4.1) ou as bandas podem ser cortados para a análise de espectrometria de massa; ver etapas seguintes.
4. Remover gel de aparelho utilizando água desionizada para transferi-lo para um recipiente limpo.Cubra gel em Oriole mancha, e recipiente embrulhe em uma folha de alumínio para bloquear a luz. Permitir que o gel a incubar à temperatura ambiente num agitador durante pelo menos 90 min.
5. Imagem de gel Oriole-coradas (Figura 3) usando a luz UV, e marca onde bandas será cortado na imagem. Cortamos cada pista em cerca de 25 bandas de 2 mm para estudos de medição do proteoma total.
6. Coloque gel sobre uma superfície limpa. Utilizar apenas materiais que foram mantidos fechados ou são pulverizados com etanol para evitar a contaminação de queratina. Corte cada banda, e posteriormente cortá-la em três partes iguais. Coloque todos os três peças de cada banda juntos em seu tubo ml próprio rotulado 1.5. Pedaços de gel pode ser armazenada à temperatura de -20 ° C durante vários meses.
7. Preparar tampões de gel para a digestão enzimática. Digest pedaços de gel utilizando tripsina a 37 ° C durante a noite. Para o protocolo detalhado gel amostra ver nossa publicação anterior ^22. Você pode digerir baixas bandas de peso molecular com quimotripsina em vez de tripsina,para eliminar a clivagem extensa tripsina de caudas de histona.

6. Espectrometria de Massa de Análise de Dados e

As amostras são separadas em um LC e analisadas por MS / MS. Os espectros são comparados com uma base de dados de proteínas para a identificação de proteínas.

1. Executar 10 ul de cada amostra através de LC / MS / MS. Usamos uma nano-flow Eskigent LC com uma coluna de fase 75 uM inversa. Use uma corrida LC optimizado para uma gama de proteínas e peptídeos. Empregam um gradiente linear de fase móvel A (acetonitrilo 0,1% de ácido fórmico a 2% [ACN] em água) a fase móvel B (0,1% de ácido fórmico, 20% de água em ACN): 60 min a partir da fase B móvel de 5% a 50 B%, em seguida 15 min a partir de 50% de B para B a 95% e finalmente 10 minutos em 95% constante B. Use uma taxa de fluxo de 200 nl / min. Aquisição de dados de espectrometria de massa em um modo de dados-dependente. Usamos uma Orbitrap Thermo que fragmenta os 6 melhores pais íons mais abundantes.
2. Repetir corre para pelo menos três biológica e dois técnicos repetições. (Recommended)
3. Use um software (opções disponíveis no mercado incluem BioWorks e Xcalibur;! Opções publicamente disponíveis incluem PROWL, X Tandem, SpectraST) para pesquisar no banco de dados espectros UniProt de escolha através de um algoritmo de busca (como Sequest ou mascote).
4. Considere modificar os parâmetros de pesquisa para permitir carbamidomethylation cisteína e oxidação da metionina, duas modificações comuns criados durante o processamento da amostra.
5. Calcular uma taxa de falsos positivos usando banco de dados de pesquisa inversa.
6. Filtrar identificações de proteínas para aceitar apenas partidas de uma confiança limiar. Recomendamos os seguintes parâmetros para começar com: Xcorr> 3 (2),> 4 (3),> 5 (4); deltaCN tolerância> 0,1, a pontuação de consenso ≥ 20, a massa de tolerância de 2 Da para íon pai de massa, de 0,5 Da para o ião do produto, pelo menos, dois péptidos únicos por proteína e não mais de três clivagens perdidas.

7. Etiqueta livre de quantificação

Determine da abundância relativa de proteínas utilizando rótulo isento de quantificação (Figura 4).

1. Uma série de programas de software são publicamente ou comercialmente disponível para a etiqueta livre de quantificação de dados de espectrometria de massa, incluindo Censos (grupo do Prof Yates), Elucidator ²³ (Microsoft), ²⁴ PENEIRA (Thermo Scientific), ^{25 de} Andaime (Software Proteome). ²⁶ Estes programas visam correlacionar o sinal de espectrometria de massa de peptídeos intactos ou o número de eventos de sequenciamento de peptídeos com quantidades de proteínas relativas entre dois ou mais estados.
2. Embora cada programa incorpora um oleoduto análise semelhante, alguns programas são limitadas aos tipos de análise específicos que podem ser realizadas sobre os dados. Inicialmente, os dados dos ensaios diferentes está alinhada, a intensidade de sinal é normalizada e os picos de péptidos foram seleccionados para análise.
3. Os dois métodos mais comuns são a quantificação baseada na contagem espectral ou LC-MS da área dos picos. Abundânciaíndices são calculados para determinar mudanças na abundância peptídica entre os diferentes grupos.
4. Estes programas podem ser interligados com algoritmos de pesquisa de proteômica (Mascote, Sequest, X Tandem!) Para correlacionar informações de quantificação para identificação de proteínas.
5. Para garantir a precisão e reprodutibilidade dos dados é fundamental para incorporar tanto biológicas (diferentes amostras experimentais) e técnicos (executando a mesma amostra no espectrômetro de massa várias vezes) repetições de dados Esp.
6. Variação do péptido em abundância e entre as condições experimentais podem ser avaliadas por ANOVA e plotados via APC (Figura 5).

Considerações importantes para etiqueta livre de quantificação. Ao realizar etiqueta livre de quantificação, uma atenção específica deve ser dada para garantir a preparação da amostra consistente, tempo de digestão e condições LC-MS/MS como cada amostra devem ser processados ​​e analisados ​​separadamente. Em contraste com a metabordagens de rotulagem abolic, comparações em etiqueta sem experimentos são feitos em dados de espectrometria de massa, corre (por causa da falta de rotulagem elimina a possibilidade de executá-los juntos), implicando alta reprodutibilidade em todos os aspectos da análise da amostra (ou seja, de preparação de amostras, LC e as etapas de MS) e uso de alta massa espectrômetros de massa de precisão.

Para ter em conta ligeiras alterações na preparação da amostra e análise de um padrão conhecido pode ser adicionado a cada amostra para auxiliar na normalização dos dados. Além disso, a maioria dos programas de software permitem que a normalização das intensidades de sinais (por exemplo, ajustando ao ruído de fundo ou de uma substância conhecida abundante), após a aquisição de dados para levar em conta as diferenças de ionização de injeção, e fragmentação. Algoritmos de alinhamento existem na maioria dos programas de software acima mencionados que ajudam a corrigir as diferenças de perfis de eluição de péptidos. O uso de réplicas biológicas e técnicas é essencial, neste tipo de estudo, uma vez que permite a análise estatística para confirmar a reprodutibilidade e consistência das alterações observadas na abundância de proteínas.

Resultados

A Figura 4 evidencia a utilidade desta forma de quantificação relativa. Mostrado no painel da esquerda são os picos de peptídeos individuais monoisotópico (sobreposta de camundongos diferentes), que tenham sido designadas como pertencentes ao HMGB1 proteína (identificados através de pesquisa de banco de dados). Cada pico, essencialmente, um cromatógrafo de iões extraídos para o dado péptido, vem de um rato diferente. Os grupos representam três diferentes estados fisiológicos: hipertrofia, b...

Discussão

Dois principais métodos para o isolamento nuclear foram revistas anteriormente: ²⁷ um é a técnica de homogeneização Behrens tecido liofilizado num solvente não-aquoso e a segunda, uma modificação do que se usar aqui, de homogeneização de tecidos em uma solução aquosa de sacarose / solução salina seguido pelo diferencial ou gradiente de densidade de centrifugação.

Subfractionation dos núcleos por extracção em meio ácido, em amostras de tecidos é uma ferramenta ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo
Dulbeco Modified Eagle Médium	Invitrogen	11965
Protease pellet	Roche	04 693 159 001
100 filtro mM	BD Falcon	352360
Ultracut ultramicrótomo	Reichert
100CX Eletrônica de Transmissão Microscópio	JEOL EUA, Inc.
Papa-figos	BioRad	161-0496
Anticorpo H2A histona	Santa Cruz	sc-8648
Nucleoporin anticorpo p62	BD Biosciences	610498
Adenina nucleoanticorpo transportador maré	Santa Cruz	sc-9299
BiP anticorpo	Santa Cruz	sc-1050
Anticorpo tubulina	Sigma	T1568
Anticorpo histona H3	Abcam	ab1791
Anticorpo fibrilarina	Sinalização celular	C12C3
SNRP70 anticorpo	Abcam	ab51266
E2F-1 anticorpo	Thermo Fisher	MS-879
Anticorpo Retinoblastoma	BD Biosciences	554136
Fator-1 induzível hipóxia anticorpo	Novus Biologicals	NB100-469
Ensaio de proteína BCA	Thermo Scientific	23227
Inverter coluna de fase	Obj Novativa	PFC7515-B14-10
Navegador BioWorks	Thermo Scientific