ניתוח הכמות של Proteomes הכרומטין במחלות

Summary

התקדמות בספקטרומטריית מסות אפשרה ניתוח התפוקה הגבוהה של ביטוי חלבון ושינוי בשורה של רקמות. בשילוב עם חלוקת subcellular ומודלי מחלות, מסה כמותית ספקטרומטריית וביואינפורמטיקה יכולות לחשוף נכסים חדשים במערכות ביולוגיות. השיטה המתוארת כאן מנתחת חלבוני הכרומטין הקשורים בהגדרה של מחלות לב, והוא בקלות ישימה אחרים In vivo מודלים של מחלות אנושיות.

Abstract

בגרעין מתגורר בproteomes שהתפקיד קשור באופן אינטימי ביותר עם רגולציה של גנים. גרעיני cardiomyocyte יונקי בוגרים הם ייחודיים בשל אחוז הגבוה של תאי binucleated, ¹ המדינה בעיקר heterochromatic של ה-DNA, והאופי שאינו מפריד-של cardiomyocyte שהופך גרעינים בוגרים במצב קבוע של interphase. בקרת שעתוק ² במהלך פיתוח ו מחלה נחקרה היטב באיבר זה, אבל מה שנשאר ^3-5 נחקר יחסית היא התפקיד שמלא את החלבונים האחראים על אריזת DNA וביטוי הגרעיניים, וכיצד החלבונים הללו לשלוט שינויים בתוכניות תעתיק המתרחשים במהלך מחלה. ⁶ בפתחו עולם, מחלות לב היא סיבת מספר אחת לתמותה עבור גברים ונשים כאחד. ⁷ תובנה על איך חלבונים גרעיניים ישתפו פעולה על מנת להסדיר את ההתקדמות של מחלה זו היא קריטי לקידום הטיפול o הנוכחיתptions.

ספקטרומטריית מסה היא הכלי האידיאלי לטיפול בשאלות אלו שכן היא מאפשרת ליאור משוחד של כימות וProteome היחסי הגרעינית לכיצד השפע של חלבונים אלו שינויים עם מחלה. אמנם יש כבר כמה מחקרי proteomic למתחמי יונקים גרעיניים חלבונים, ^8-13 עד לאחרונה ¹⁴ חלו רק מחקר אחד בודק Proteome הגרעיני הלב, והוא התייחס לכל הגרעין, במקום לחקור Proteome ברמה של תת מדורים גרעיניים ^15. במידה רבה, מחסור זה בעבודה נובע מהקושי של בידוד גרעיני לב. גרעיני לב מתרחשים בתוך מנגנון יקטין מיוזין נוקשה וצפוף שאליו הם מחוברים באמצעות הרחבות מרובות מreticulum endoplasmic, במידה שמשנה את התכווצות myocyte הצורה הכללית שלהם. ¹⁶ בנוסף, cardiomyocytes הם 40% לפי נפח ¹⁷ המיטוכונדריה שnecessitaTES העשרת הגרעין מלבד האברונים האחרים. כאן אנו מתארים פרוטוקול להעשרה גרעינית לב וחלוקה נוספת לתאים ביולוגיים רלוונטיים-. יתר על כן, שיטות פירוט נתיחת תווית חינם כמותית המונית spectrometric של שברי טכניקות המתאימים לניסויים בגוף חיים במודלים שונים של בעלי חיים ומערכות איברים בי תיוג מטבולית הוא לא ריאלי אלה.

Protocol

העבודה הניסויית מכילה שבעה שלבים עיקריים (איור 1). לכל עבודה שיש בי דגימות שתהיה לרוץ על ספקטרומטר המסות, הנסיין צריך ללבוש חלוק מעבדה, כפפות ורשת לשיער ולטפל כדי למנוע זיהום מאבק ושפיכות אישיות של קרטין.

1. Homogenization לב ובידוד גרעיני

לבבות של העכבר homogenized וגרעיני גלולה ללא פגע מבודד (איור 2).

1. להקריב את העכבר בוגר, בלו הלב, יש לשטוף בPBS קר כקרח, והומוגני על קרח בdounce זכוכית (אנחנו מעדיפים מטחנות ויטון רקמות מפישר, # 08-414-13A, אבל שיטות אחרות יכולות לעבוד היטב באותה מידה) המכיל 2 מ"ל של חיץ תמוגה (פתרון hypotonic שדיפרנציאלי lyses קרום התא על אברונים כולל הגרעין) (10 mM טריס pH 7.5, 15 המ"מ NaCl, ו0.15% v / v Nonidet P-40 [NP-40] במים בתוספת deionized פרוטאז ופוספטאזתערובת nhibitor: 10 בוטיראט נתרן מ"מ, 0.1 פלואוריד phenylmethylsulfonyl מ"מ [PMSF], 0.2 mM Na ₃ VO _4, 0.1 המ"מ NAF ו1 הרוש פרוטאז pellet/10 מ"ל - חיץ תמוגה ניתן לאחסן לתקופה של עד שבוע אחד ב -20 ° C ). (הערה: אין אנו מוצאים לנכון אנקב את הלב עם PBS, כנתוני ספקטרומטריית המסה שלנו וללכת ניתוח לזהות את החלבונים כברובה cardiomyocyte [p-value 3.8E-22] במקור בניגוד לזיהום דם [עמ שווי 5.0 E-2]).
2. יוצק lysate דרך מסננת מיקרומטר 100 ולאסוף לזרום בצינור צנטריפוגה מ"ל 1.5. בשלב זה, אלא אם צוין, מדגם צריך להיות כל זמן על קרח.
3. צנטריפוגה בסל"ד 4000 למשך 5 דקות ב 4 ° C.
4. הסרת supernatant. (זה cytosol, וצריך להיות מאוחסן ב-80 ° C. זה מכיל את המיטוכונדריה lysed.) Resuspend גלולה במאגר תמוגה μl 200 ידי triturating. (זה גולמי הגרעיני הגלולה.)
5. מלא צינור צנטריפוגה מ"ל 1.5 עם 1 מ"ל של חובב סוכרוזאה (24% סוכרוז משקל / נפח, 10 המ"מימ טריס pH 7.5, ו15 מ"מ NaCl במי deionized עם פרוטאז / תערובת מעכב phosphatase - חיץ סוכרוז צריך להיעשות טרי ביום שימוש). בעדינות שכבת גלולת resuspended על גבי משטח סוכרוז וצנטריפוגה בסל"ד 5000 עבור 10 דקות ב 4 ° C.
6. הסר את השכבה הדקה על גבי, כמו גם את כרית סוכרוז (המכיל קרום). שטוף את הכדור שנותר עם 200 PBS μl קר כקרח / EDTA (1x PBS עם mM EDTA 1). (זה גרעיני הגלולה וניתן solubilized או קבוע לשימוש במיקרוסקופ אלקטרונים או סופג מערבי [ראה צעדים 4.1 ו 4.2] לכמת העשרה.)

2. Nucleoplasm והיפוך חלוק דטרגנט-חולץ הכרומטין

גרעיני הגלולה הגולמית מופרדת לnucleoplasm ושבריר דטרגנט-חולץ הכרומטין, המכילה חלבונים הקשורים באופן רופף עם ה-DNA.

1. Triturate גלולה מצעד 1.6 במאגר 200 μl דטרגנט חילוץ (20 המ"מ HEPES pH 7.6, 7.5 מ"מ MgCl _2. 0.2 המ"מ EDTA, 30 mM NaCl, 1 ז אוריאה, 1% NP-40 במי deionized עם פרוטאז / תערובת מעכב phosphatase - חיץ מיצוי חומר ניקוי ניתן לאחסן לתקופה של עד שבוע אחד ב -20 ° C).
2. דוגמא 2 פעמים ורטקס, 10 שניות כל אחת. מניח על קרח 10 דקות.
3. צנטריפוגה בסל"ד 13000 למשך 5 דקות ב 4 ° C.
4. הסרת supernatant. (זה nucleoplasm וצריך להיות מאוחסן ב-80 ° C). יש לשטוף עם גלולה קרה כקרח PBS / EDTA. (זה הכרומטין הגלולה.)
5. Triturate גלול ב 300 טריס μl, SDS, EDTA חיץ (50 mM טריס pH 7.4, 10 mM EDTA, 1% SDS במי deionized עם פרוטאז / תערובת מעכב phosphatase - טריס, SDS, EDTA חיץ אפשר לשמור עד שבוע ב -20 ° C).
6. Sonicate 3-6 פעמים לכל 10 שניות כדי לשבור את ה-DNA. שמור מדגם על קרח בין sonications.
7. צנטריפוגה בסל"ד 13000 למשך 5 דקות ב 4 ° C. שמור את supernatant. (Supernatant הוא חלבון הכרומטין fractio דטרגנט-חולץצריך להיות כל זמן ובn -80 ° C). הגלולה שנותרה צריכה להיות קטנה ויכולה להיות מושלכת.
8. אם אתם משתמשים בmyocytes הבודד במקום כל הלב: מבודד myocytes חדרית עכברוש בילוד מגורי חולדות יום אחד לאחר לידה באמצעות עיכול אנזימטי, ואחריו בתרבות Dulbecco modified נשר בינוני (DMEM) עם 10% בסרום שור עוברי (FBS), אינסולין 1% סלניום-transferrin-נתרן (ITS), ו 1% פניצילין. לאחר 24 שעות, להעביר לתקשורת סרום חינם (כנ"ל, אבל חסר FBS). תאי קציר בחיץ תמוגה (המופיע ב1.1), ולהתחיל חלוקה גרעינית בשלב 1.3.

3. היפוך חלוק חומצת חילוץ - DNA בכריכת העשרת חלבון

A מעשיר נפרד חלוקה לחלבונים הדוק ל-DNA, כוללים ההיסטונים.

1. חזור על שלבים 1.1-2.4.
2. Triturate הכרומטין גלול ב 400 μl של חומצה גופרתית N 0.4. מערבולת להסיר גושים.
3. לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות או overnight תוך סיבוב.
4. צנטריפוגה ב XG 16000 עבור 10 דקות ב 4 ° C כדי להסיר פסולת גרעינית.
5. העברת supernatant לצינור טרי.
6. הוסף 132 μl של חומצת Trichloroacetic הנפתחת חכמה supernatant. הפוך כמה פעמים. לדגור על קרח למשך 30 דקות.
7. צנטריפוגה ב XG 16000 עבור 10 דקות ב 4 ° C.
8. בטל supernatant. לשטוף בעדינות עם אצטון גלולה קר כקרח. (זו גלולת היסטון.)
9. צנטריפוגה ב XG 16000 עבור 10 דקות ב 4 ° C.
10. חזור על לשטוף, צעדים 3.8-3.9.
11. אוויר יבש גלול.
12. Resuspend גלול ב 100 μl של טריס, SDS, EDTA חיץ. הגדר pH עד 8 על ידי הוספת 1 M טריס. (השתמש במניות 1 ז טריס, שאינה מותאם לרמת חומציות).
13. Sonicate באמבט מים במשך 15 דקות. למנוע התחממות יתר על ידי הוספת קרח למי אמבט. (זה אותו שבריר חומצת חילוץ וצריך להיות מאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס)

4. בדיקת טוהר

כתמים מערביים וכן במיקרוסקופ אלקטרוניםלאשר העשרה מוצלחת של גרעינים ודלדול של אברונים אחרים. כדי לצפות בתוצאות אופייניות לכל מבחני בקרת האיכות הבאות, ראו הפרסום הקודם שלנו. ¹⁸

1. ביצוע ניתוח כתם מערבי. קרום חללית המכיל כל שבריר לH2A היסטון או nucleoporin p62 (כסמנים גרעיניים כדי לוודא העשרה), ולטרנספורטר אדנין נוקלאוטיד, ביפ וטובולין (כסמן של המיטוכונדריה, סמן endoplasmic reticulum, וסמן cytoskeletal בהתאמה לאמת טהרה). כדי לוודא subfractionation המוצלח של הגרעינים, החללית לH3 היסטון או fibrillarin (חומרי ניקוי וגרעיני הכרומטין ושלמים חומצת חילוץ) וSNRP70 או E2F (nucleoplasm). חללית לרטינובלסטומה או מושרה היפוקסיה גורם-1 (מועשר באבקת הכרומטין-חולץ על שבריר חומצת חילוץ). דגימות בקרה נוספות של lysate תא הלה וlysate לב השלם גם ניתן להפעיל באותו הג'ל: הכן את שליטת lysate תא הלה על ידי הוספת טריס, SDS, EDחיץ ת"א למנת התרבות ובאמצעות מגרד תא כדי לאסוף דגימה. Sonicate וסרכזת מדגם כמו בשלבים 2.6-2.7. הכן שליטת lysate לב שלמה על ידי שמאחד את הלב בחיץ 2 מ"ל (20 mM טריס pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, pyrophosphate נתרן 2.5 מ"מ, glycerophosphate 1 מ"מ במי deionized עם פרוטאז ותערובת מעכב phosphatase). Sonicate וסרכזת כמו בשלבים 2.6-2.7. ראה שלב 5 להכנת דגימות חלבון לSDS-PAGE.
2. מיקרוסקופי אלקטרונים: Resuspend גרעיני הגלולה מ -1.6 צעד במאגר המכילים תמוגה gluteraldehyde 2% ולתקן מדגם ב 4 ° C. יש לשטוף את דגימות בחומצת osmic, לייבש, ולהטביע בשרף אפוקסי. חותך 70 פרוסות ננומטר באמצעות רייכרט Ultracut ultramicrotome. כתם דגימות בתצטטנה uranyl ולאחר מכן להוביל ותמונה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני JEOL 100CX הילוכים. לכמת העשרה על ידי מדידת השטח של גרעינים שלמים לעומת שטח כולל של חומר הדמיה. אנו מוצאים 60-80% מגרעינים ללהיות שלם ^14.

שיקולים חשובים עבור העשרה לעומת טיהור גרעינים. פרוטוקול זה פותח כדי לאפשר מנתח proteomic של הכרומטין לב לצורך לימוד תהליכי ויסות גני העולם במהלך מחלה. מרכיב עיקרי בעיצוב ניסויי ספקטרומטריית מסה שלם Proteome הוא הבעיה של טווח דינמי ויכולת לזהות ולאפיין חלבונים נמוכי שפע. בנוסף למטרה העיקרית של מתן מידע על ביולוגיה גרעינית והכרומטין ספציפי, המעשיר את Proteome הגרעיני, מגביר את הסבירות לזיהוי חלבונים נמוכי שפע אלה, כפי שעושה subfractionation הנוסף של הגרעינים. עם זאת, כפי שראה, cardiomyocyte המבוגר יש מרכיב cytoskeletal צפוף מחובר לקרום הגרעין. אנחנו לא מאמינים שיש לנו מטוהרי גרעינים ממרכיבים תאיים אחרים אלה לחלוטין. עם זאת, על ידי העשרה רק לגרעינים, יש לנו להשיגעורך סף מקובל כדי לאפשר את סוגי ניתוחים שתואר.

באופן ספציפי, יש לנו להשתמש EM להעריך את הטוהר של גרעיני הגלולה הגולמית שלנו ומצאתי 60-80% מהשבריר להיות גרעינים שלמים, בערך 10% מיטוכונדריה, ופסולת השאר. בנוסף, אנו יודעים מהמחקר הקודם שלנו על אוכלוסיית הגרעינים השלמות, כי בעוד myofilaments רב אינו מועשר בפרוטוקול זה (לרבות טובולין ויקטין כפי שנמדד על ידי מערב) חלבונים מסוימים (calsarcin-1) מעשירים, מה שמרמז אוכלוסייה ביולוגית אמיתית של חלבונים אלה בלב. הגרעינים ¹⁹

בנוסף, השוו את החלבונים שנמצאנו להיות נוכח בשבריר הכרומטין חומצת החילוץ, לתפקידים החזויים של חלבונים אלו על ידי אונטולוגיה גן. חשוב מכך, ניתוח אונטולוגיה גן זה אינו לוקח בחשבון את השפע היחסי של חלבונים השונים (כמו גם נתוני הכתם המערביים שלנו), אלא סופר את כל החלבונים שזוהו (להעשיראד או לא) כשווה בעת זיהוי מסלולים נפוצים ותאים סלולריים. ניתוח של המסלולים האלה ותאים סלולריים ניתן למצוא בפרסומים הקודמים שלנו. ^18,20 והכי חשוב, ההצלחה של ההעשרה בשבריר הכרומטין חומצה חולץ אפשרה לנו לזהות את נוכחותם של 54 גרסות היסטון בmyocyte העכבר המבוגר, ¹⁸ רבים מהם הסתמכו על פפטיד ייחודי אחד לזיהוי, ולכן הייתי סיכוי לא היה לגלות אותו בלי פרוטוקול העשרה זה בהתחשב במורכבות העצומה של Proteome cardiomyocyte המוחלט. של 1048 חלבונים שזוהינו מגרעיני הלב, 56 מתוכם (5.3%) היו מבוארים על ידי GO ניתוח להיות חלק מהנוקלאוזום (מרכיב אחד של הגרעין של עניין). מחקר נוסף שמסתכל על כל הלב, זיהה 6,180 חלבונים, מתוכם רק 11 חלבונים (0.18%) היו מבוארים להיות חלק ^מ21 נוקלאוזום. עוד הדבר זה ממחיש את כוחו של הפרוטוקול שלנו לmeaningfully להעשיר לחלבונים גרעיניים.

5. ג'ל חלבון והחלבון דייג'סט אנזימתי

חלבונים מופרדים על ידי אחד ממדים SDS-PAGE וטריפסין מתעכל שיופעל בספקטרומטר המסה.

1. הפשר דגימות על קרח ולקבוע ריכוז חלבון לכל דגימה באמצעות חומצת bicinchoninic (BCA) assay חלבון.
2. לדלל דגימות לריכוז ידוע באמצעות חיץ Laemmli 5x, להרתיח במשך 10 דקות וחנות ב -20 ° C לSDS-PAGE חד ממדי. לדלל דגימות לריכוז ידוע באמצעות חיץ וחנות חילוץ אוריאה ב -20 ° C לג'לים דו ממדים.
3. הפעל ג'ל של בחירת העמסת כמות זהה של חלבון בכל מסלולים. חלבון יכול להיות מועבר לממברנת ניטרוצלולוזה לשמש למערב סופג (כמו עם פקדים בשלב 4.1) או להקות ניתן לחתוך לניתוח ספקטרומטריית מסות, ראה שלבים הבאים.
4. הסרת הג'ל ממכשיר באמצעות מי deionized להעבירו למכל נקי.כיסוי ג'ל בזהבן כתם, ומכל לעטוף ברדיד אלומיניום כדי לחסום את האור. אפשר ג'ל לדגירה בטמפרטורת חדר שבייקר ללפחות 90 דקות.
5. ג'ל התמונה זהבן המוכתם (איור 3) באמצעות אור UV, וסימן שבו תהיינה מנותקות להקות בתמונה. אנחנו חותכים כל נתיב לכ 25 להקות 2-מ"מ ללימודי מדידת Proteome המוחלט.
6. הנח ג'ל על משטח נקי. השתמש רק בחומרים שנשמרו אטום או רוססו באתנול על מנת למנוע זיהום קרטין. חותך את כל להקה, ואז עוד יותר לפרוס אותו לתוך 3 חתיכות שווות. מקם את כל השלוש החתיכות של כל להקה ביחד לצינור משלו שכותרתו 1.5 מ"ל. חתיכות ג'ל ניתן לאחסן ב -20 ° C למשך מספר חודשים.
7. הכן את אטמי ג'ל לעיכול אנזימטי. חתיכות ג'ל Digest באמצעות טריפסין על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לפרוטוקול מדגם ג'ל מפורט בפרסום הקודם שלנו. אתה יכול לעכל ²² להקות משקל מולקולריות נמוכות עם chymotrypsin במקום טריפסין,לחסל המחשוף הרחב של טריפסין של זנבות היסטון.

6. ספקטרוסקופיית מסות וניתוח נתונים

דוגמאות מופרדות בLC ונותחו על ידי MS / MS. הספקטרומים חפשו מול מסד נתוני חלבון לזיהוי חלבון.

1. הפעלת 10 μl של כל דגימה באמצעות LC / MS / MS. אנו משתמשים בננו זרימת Eskigent LC עם עמודת שלב 75 מיקרומטר הפוכה. השתמש בטווח LC המותאם למגוון רחב של חלבונים ופפטידים. מעסיק שיפוע ליניארי משלב נייד (0.1% חומצה פורמית, 2% אצטוניטריל [ACN] במים) לסלולרי שלב ב '(0.1% חומצה פורמית, מי 20% בACN): 60 דקות משלב ב' נייד 5% עד 50 B%, ולאחר מכן 15 דקות מ-B ל-B 50% 95% ולבסוף 10 דקות ב קבוע 95% ב 'השתמש בקצב זרימה של 200 nl / דקה. להשיג נתוני ספקטרומטריית מסה במצב נתונים תלויים. אנו משתמשים Orbitrap Thermo שברים את 6 יונים ההוריים הנפוצים ביותר העליונים.
2. חזור פועל במשך לפחות שלוש ביולוגיים ושתי טכניים משכפלים. (Recommended)
3. השתמש בתוכנה (אפשרויות זמינות מסחרי כוללות BioWorks וXcalibur;! אפשרויות בפומבי זמינות כוללות טרף, X טנדם, SpectraST) כדי לחפש ספקטרום מול מסד נתוני Uniprot של בחירה באמצעות אלגוריתם חיפוש (כגון SEQUEST או קמע).
4. שקול שינוי פרמטרי חיפוש, כדי לאפשר carbamidomethylation ציסטאין ומתיונין חמצון, שני שינויים נפוצים שנוצרו במהלך עיבוד המדגם.
5. חישוב שיעור חיובי כוזב באמצעות חיפוש מסד נתונים הפוך.
6. סנן הזדהויות חלבון לקבל התאמות של אמון סף בלבד. אנו ממליצים על הפרמטרים הבאים להתחיל עם: Xcorr> 3 (2),> 4 (3),> 5 (4); deltaCN סובלנות> 0.1, ציון הקונצנזוס ≥ 20, 2 דה הסובלנות המונית ליון הורה, מסה של 0.5 דה ליוני מוצר, לפחות 2 פפטידים ייחודיים בחלבון ולא יותר מ 3 החמיצו שסעים.

7. Quantitation תווית חינם

Determine השפע היחסי של חלבונים באמצעות quantitation תווית חינם (איור 4).

1. מספר תוכנות הם בפומבי או זמין מסחרי כדי לכמת ללא תווית של נתוני ספקטרומטריית מסה כולל המפקד (קבוצתו של פרופ 'ייטס), ²³ Elucidator (Microsoft), ²⁴ נפו (Thermo Scientific), ²⁵ פיגום (תוכנת Proteome) ^26. תוכניות אלה מכוונות כדי לתאם את אות ספקטרומטריה של פפטידים שלמים או את מספר אירועי רצף פפטיד עם כמויות חלבון יחסיות בין שתי מדינות או יותר.
2. אמנם כל תכנית משלבת צינור ניתוח דומה, חלק מהתוכניות מוגבלות לסוגים של ניתוח ספציפי שניתן לבצע על הנתונים. בתחילה, נתוני ריצות שונות מיושרים, עוצמת אות מנורמלת ופסגות פפטיד נבחרות לניתוח.
3. שתי השיטות הנפוצות ביותר הן כימות מבוסס על ספירת רפאים או אזור LC-MS שיא. שפעיחס זה מחושב על מנת להבחין בשינויים בשפע פפטיד בין קבוצות שונות.
4. תוכניות אלה יכולות להיות ממשק עם אלגוריתמי חיפוש proteomic (קמע, Sequest, X! טנדם) כדי לתאם מידע כימות לזיהוי חלבון.
5. כדי להבטיח דיוק ושחזור של הנתונים הוא חיוני כדי לשלב שני המדגמים שונים (ניסיוניים) הביולוגיים וטכניים (מפעיל אותו המדגם בספקטרומטר המסה מספר פעמים) משכפל נתוני spec המוניים.
6. הווריאציה של שפע פפטיד ובבין תנאי ניסוי ניתן להעריך על ידי ANOVA ולהתוות דרך PCA (איור 5).

שיקולים חשובים עבור quantitation החופשי תווית. בעת ביצוע quantitation ללא תווית, תשומת לב חייבים להינתן ספציפית כדי להבטיח הכנה עקבית מדגם, זמן עיכול ותנאי LC-MS/MS כחייבת להיות מעובד כל דגימה ונותחה בנפרד. בניגוד לנפגשגישות תיוג abolic, השוואות בניסויים ללא תווית נעשות על נתונים מספקטרומטריית מסות מובחנת פועלת (בגלל חוסר התיוג obviates את האפשרות להפעיל אותם יחד), ובכך תחייבנה שחזור גבוה בכל ההיבטים של ניתוח מדגם (כלומר של מכין מדגם, צעדי MS LC ו) ושימוש בספקטרומטר מסה המונית דיוק גבוה.

כדי להסביר שינויים קלים בהכנת מדגם וניתוח סטנדרטי ידוע ניתן להוסיף לכל דגימה על מנת לסייע בנורמליזציה של נתונים. בנוסף, רוב התוכנות מאפשרות נורמליזציה של עוצמת אות (למשל, על ידי התאמה לרעשי רקע או אנליטי שפע ידוע) לאחר רכישת נתונים כדי להסביר את ההבדלים בזריקה, יינון ופיצול. אלגוריתמי יישור קיימים ברוב התוכנות שבנדון, המסייעות בתיקון הבדלים בפרופילי elution פפטיד. השימוש בביולוגי וטכני הוא משכפל אסןTial בסוג זה של מחקר, שכן היא מאפשרת ניתוחים סטטיסטיים על מנת לאשר את השחזור והעקביות של כל שינויים שנצפו בשפע חלבון.

תוצאות

איור 4 מדגיש את התועלת של צורה זו של כימות יחסי. מוצגים בלוח השמאלי הן הפסגות הבודדות monoisotopic פפטיד (מעולף מעכברים שונים), שנקבעו כלשייכת לHMGB1 החלבון (מזוהה באמצעות חיפוש באתר). כל שיא, למעשה כרומטוגרף יוני חילוץ לפפטיד הנתון, מגיע מעכבר אחר. הקבוצות מייצגות את ש...

Discussion

שתי שיטות עיקריות לבידוד גרעיני כבר נבדקו בעבר: ²⁷ אחד היא טכניקת הרנס של מאחד רקמת lyophilized בממס בלתי מימי ושנייה, שינוי שאנו משתמשים כאן, מאחדים רקמה בתמיסת מלח סוכרוז / מימי אחרי בהפרש או צנטריפוגה צפיפות שיפוע.

Subfractionation של ה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים
Dulbeco שינוי נשר בינוני	Invitrogen	11965
פרוטאז גלולה	רוש	04 693 159 001
מסננת מיקרומטר 100	BD פלקון	352360
Ultracut ultramicrotome	רייכרט
100CX הילוכי אלקטרונים מיקרוסקופ	JEOL ארה"ב, Inc
זהבן	BioRad	161-0496
נוגדן H2A היסטון	סנט קרוז	SC-8648
נוגדן Nucleoporin p62	BD Biosciences	610498
אדנין Nucleoנוגדן טרנספורטר גאות	סנט קרוז	SC-9299
BIP נוגדן	סנט קרוז	SC-1050
נוגדן טובולין	סיגמא	T1568
נוגדן H3 היסטון	Abcam	ab1791
נוגדן Fibrillarin	איתות תא	C12C3
SNRP70 נוגדן	Abcam	ab51266
E2F-1 נוגדן	תרם פישר	MS-879
נוגדן רטינובלסטומה	BD Biosciences	554136
גורם-1 מושרה היפוקסיה נוגדן	נובוס ביולוגי	NB100-469
assay החלבון BCA	Thermo Scientific	23227
הפוך עמודת שלב	Obj החדשective	PFC7515-B14-10
דפדפן BioWorks	Thermo Scientific