JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا نعرض بروتوكول بسيطة وفعالة لتوليد iPSCs الإنسان من مل 3-4 من الدم المحيطي واحد باستخدام ناقلات lentiviral إعادة برمجة. إعادة برمجة خلايا الدم متاحة بسهولة وعود لتسريع استخدام تكنولوجيا التوجيهية من خلال جعلها في متناول مجتمع بحثي واسع النطاق.

Abstract

من خلال التعبير خارج الرحم من عوامل النسخ الأربعة، Oct4، Klf4، وSox2 cMyc، يمكن تحويل الخلايا الجسدية الإنسان إلى حالة المحفزة، وتوليد ما يسمى الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs) 1-4. المريض محددة iPSCs تفتقر إلى المخاوف الأخلاقية التي تحيط الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية)، وسوف تجاوز الرفض المناعي ممكن. وهكذا، وقد اجتذبت اهتماما كبيرا لiPSCs دراسات النمذجة المرض، وفحص المركبات الدوائية، والعلاج التجديدي 5.

لقد أظهرنا توليد التحوير خالية iPSCs الإنسان من المرضى الذين يعانون من أمراض الرئة المختلفة باستخدام واحد excisable الجذعية lentiviral متعدد المقارين راديو كاسيت الخليوي (STEMCCA) ترميز العوامل ياماناكا 6. وقد تم توليد هذه الخطوط التوجيهية من الخلايا الليفية الجلد، ونوع من الخلايا الأكثر شيوعا التي تستخدم لإعادة البرمجة. عادة، والحصول على الخلايا الليفية الجلد يتطلب كمة خزعة تليها التوسع في الخليةق في الثقافة لبضع فقرات و. الأهم من ذلك، فقد أفاد عدد من المجموعات إعادة برمجة خلايا الدم المحيطي في iPSCs 7-9. في دراسة واحدة، كان يعمل على إصدار محرض تيت من ناقلات STEMCCA 9، الأمر الذي يتطلب أن تكون خلايا الدم المصابة في وقت واحد مع الفيروسة البطيئة بالموقع جوهري ترميز العكس التتراسيكلين transactivator. وعلى النقيض من الخلايا الليفية، يمكن جمعها عن طريق الخلايا الدموية المحيطية والإجراءات مينيملي، والحد بشكل كبير من الانزعاج والضيق للمريض. ويجوز للبروتوكول بسيطة وفعالة لإعادة برمجة خلايا الدم باستخدام ناقلات التأسيسي excisable واحدة الإسراع في تطبيق التكنولوجيا التوجيهية من خلال جعلها في متناول مجتمع بحثي واسع النطاق. وعلاوة على ذلك، إعادة برمجة الخلايا الدموية المحيطية ويسمح لتوليد iPSCs من الأفراد التي ينبغي تجنبها خزعات الجلد (أي. الشاذة تندب) أو بسبب ظروف المرض موجود مسبقا preventiنانوغرام الحصول على الخزعات لكمة.

هنا علينا أن نبرهن على بروتوكول لتوليد iPSCs الإنسان من الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMCs) باستخدام واحد floxed-excisable ناقلات lentiviral معربا عن العوامل جوهري 4. يتم توسيع PBMCs جمعها طازجة أو إذابة لمدة 9 أيام كما هو موضح في المتوسط ​​10،11 المحتوية على حمض الاسكوربيك، SCF، IGF-1، IL-3 و EPO قبل transduced مع الفيروسة البطيئة STEMCCA. ومطلي الخلايا ثم على MEFs وESC مثل المستعمرات يمكن تصور أسبوعين بعد الإصابة. وأخيرا، يتم توسيع استنساخ مختارة واختبار للتعبير عن علامات تعدد القدرات SSEA-4، ترا-1-60 و ترا-1 81. هذا البروتوكول بسيطة وقوية ومتسقة للغاية، وتوفير منهجية موثوقة لتوليد iPSCs الإنسان من الوصول إليها بسهولة ML 4 من الدم.

Protocol

1. العزلة والتوسع في خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (PBMCs)

اليوم 0

  1. رسم 4 مل من الدم المحيطي في أنبوب BD CPT Vacutainer إعداد الخليوي مع سترات الصوديوم. قلب الأنبوب 8 إلى 10 مرات وأجهزة الطرد المركزي عند 1،800 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. من الناحية المثالية، ينبغي أن يتم هذه الخطوة ضمن 2 ساعة من جمعها.
  2. جمع الخلايا وحيدات النوى (MCS) من قبل pipetting معطف الشهباء (طبقة الخلايا حاجز بين جل والبلازما) إلى أنبوب العقيمة 15 مل المخروطية الطرد المركزي. تحقيق إجمالي حجم 10 مل مع لالفوسفات مخزنة المالحة عقيمة (PBS)، عكس عدة مرات وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 15 دقيقة.
  3. إعادة تعليق الخلايا في 10 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة وتنفيذ عدد خلايا. نقل 2X10 1 إلى 6 خلايا في أنبوب 15 مل العقيمة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي المخروطية في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
  4. إعادة تعليق الخلايا في 2 مل من التوسع المتوسطة (EM) (QBSF-60 متوسطة الخلايا الجذعية التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل أسكوحمض rbic، 50 نانوغرام / مل SCF، 10 نانوغرام / مل IL-3، 2 U / مل EPO، 40 نانوغرام / مل IGF-1، 1 ميكرومتر و 100 ديكساميتازون ميكروغرام / مل أو 1٪ primocin القلم / بكتيريا) ونقلها إلى بئر واحد من لوحة 12-أيضا. احتضان الخلايا في C ° 37، 5٪ CO 2 الحاضنة.
  5. أجهزة الطرد المركزي في الخلايا المتبقية 300 × ز لمدة 10 دقيقة وتجميد ~ 2X10 6 خلايا / قارورة تحتوي على FBS DMSO في 10٪.
  6. لبدء باستخدام بروتوكول PBMCs المجمدة، ذوبان الجليد 1 فيال من الخلايا في 10 مل من المتوسط ​​QBSF وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة. إعادة تعليق الخلايا في 2 مل من EM ونقل إلى إحدى جيدا لوحة 12-أيضا. احتضان الخلايا في C ° 37، 5٪ CO 2 الحاضنة.

DAY 3 و DAY 6

  1. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل المخروطية العقيمة ويغسل مرة واحدة مع البئر 1 مل من QBSF-60 خلية الجذعية متوسطة لجمع الخلايا الملتصقة.
  2. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
  3. إعادة تعليق الخلايا في 2 مل من EM ونقل إلى إحدى جيدا لمدة 12جيدا لوحة. احتضان الخلايا في C ° 37، 5٪ CO 2 الحاضنة.

2. تنبيغ من PBMCs مع الفيروسة البطيئة STEMCCA

يوم 9

  1. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل المخروطية العقيمة ويغسل مرة واحدة مع البئر 1 مل من QBSF-60 خلية الجذعية متوسطة لجمع الخلايا الملتصقة.
  2. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
  3. إعادة تعليق الخلايا في 1 مل من EM الطازجة تحتوي على 5 ميكروغرام / مل من polybrene والفيروسة البطيئة STEMCCA (MOI = 1 إلى 10) ونقل إلى إحدى جيدا لوحة 12-أيضا. (يمكن الاطلاع على وصف بروتوكول انتاج جسيمات lentiviral في http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/ )
  4. تدور في لوحة 2250 دورة في الدقيقة في C ° 25 لمدة 90 دقيقة.
  5. بعد زيادة ونقصان، إضافة إضافية 1 مل من EM جديدة تحتوي على 5 ميكروغرام / مل من polybrene لما مجموعه 2 مل من المتوسط ​​واحتضان لوحة في C ° 37،5٪ CO 2 الحاضنة.

يوم 10

  1. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل المخروطية العقيمة ويغسل مرة واحدة مع البئر 1 مل من QBSF-60 خلية الجذعية متوسطة لجمع الخلايا الملتصقة.
  2. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
  3. إعادة تعليق الخلايا في 2 مل من EM ونقل إلى 1 من لوحة جيدا 12-أيضا. احتضان الخلايا في C ° 37، 5٪ CO 2 الحاضنة.

3. Transduced الطلاء على خلايا MEFs

اليوم 11

  1. معطف من الآبار لوحة 6 جيدا مع الجيلاتين 0.1٪ والخلايا الليفية الماوس لوحة المعطل الجنينية (MEFs) في الخلايا 5 2X10 / بشكل جيد في المتوسط ​​MEF (IMDM تحتوي على 10٪ FBS، 1٪ غير الأحماض الأمينية الأساسية، و 100 ميكرومتر β- المركابتويثانول، 2 مم L-الجلوتامين، 100 ميكروغرام / مل primocin أو 1٪ القلم / بكتيريا). 3 آبار في إعداد العدوى.

اليوم 12

  1. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل المخروطية العقيمة ويغسل مرة واحدة مع البئر 1 مل من QBSF-60 خلية الجذعية متوسطة لجمع الخلايا الملتصقة.
  2. إعادة تعليق الخلايا في 3 مل من المتوسط ​​MEF تحتوي على 10 نانوغرام / مل bFGF، وحمض الاسكوربيك وعوامل النمو في تركيزات نفس المستخدمة في EM المتوسطة (50 حمض الاسكوربيك ميكروغرام / مل، 50 نانوغرام / مل SCF، 10 نانوغرام / مل IL -3، 2 U / مل EPO، 40 نانوغرام / مل IGF-1، 1 ميكرومتر ديكساميتازون).
  3. لوحة 1 مل من الخلايا لكل بئر من لوحة 6 جيدا تحتوي على MEFs. إضافة 1.5 مل من وسائل الإعلام MEF مع bFGF، حمض الأسكوربيك، وعوامل النمو ليصبح المجموع 2.5 مل من وسائل الإعلام / أيضا.
  4. تدور لوحة في 500 دورة في الدقيقة عند 25 لمدة 30 دقيقة C °. احتضان لوحة في 37 ° C، 5٪ CO 2 حاضنة.

اليوم 14

  1. الخلايا تغذية كل يوم مع 2.5 مل من وسائل الإعلام MEF تحتوي على 10 نانوغرام / مل و 50 bFGF حمض الأسكوربيك ميكروغرام / مل (أي عوامل النمو). وتجاهل الخلايا نضح العائمة مع كل رضعة.
  2. إضافة MEFs إضافية حسب الحاجة (عادة مرة واحدة في الأسبوع).
ع "> يوم 20 ~

  1. مرة واحدة مستعمرات صغيرة تظهر، وخلايا تغذية يومية مع 2 مل من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC) متوسطة (DMEM/F12 تحتوي على استبدال 20٪ مصل خروج المغلوب، 1٪ غير الأحماض الأمينية الأساسية، و 100 ميكرومتر β-المركابتويثانول، 2 مم L-الجلوتامين ، 100 ميكروغرام / مل primocin أو 1٪ القلم / بكتيريا و 10 نانوغرام / مل bFGF).

4. قطف والتوسع في النسخ اللجنة التوجيهية

~ DAY 30 حتي 40

  1. اختيار كل مستعمرة في الآبار الفردية من لوحة 12-جيدا مسبقا مع المصنف MEFs المعطل يحتوي على 1 مل / بئر المتوسطة بالإضافة إلى 10 ميكرومتر hESC من Stemolecule Y27632 (ROCK المانع).
  2. تغذية الخلايا بعد ذلك يوميا مع 1 مل من المتوسط ​​hESC فقط (لا مانع ROCK).

5. تلوين المناعي للعلامات تعدد القدرات

  1. تم إجراء تلطيخ استخدام عدة "خلية ES ماركر كيت عينة" من ميليبور وبعد بروتوكول الشركة المصنعة.

6. استئصال INTEGتصنيف STEMCCA المتجهات

  1. ويتحقق استئصال إعادة برمجة كاسيت الاستفادة من لجنة المساواة العرقية، IRES-بورو ترنسفكأيشن ناقلات معربا عن بعد وجيزة اختيار بوروميسين كما هو موضح 6.

النتائج

علينا أن نبرهن على بروتوكول بسيطة وفعالة لتوليد iPSCs الإنسان من PBMCs باستخدام ناقلات lentiviral واحد. الشكل 1A يظهر التمثيل التخطيطي للبروتوكول. يتم جمع الدم في أنبوب BD CPT Vacutainer إعداد الخليوي مع سترات الصوديوم، وبعد الطرد المركزي، ويمكن جمع النوى من الخلايا واجهة بي?...

Discussion

نحن هنا تصف استخدام ناقلات lentiviral STEMCCA لتوليد iPSCs من خلايا وحيدات النوى الإنسان عزله من ملليلتر قليلة من الدم المحيطي جمعها طازجة. ويمكن أيضا أن تستخدم بروتوكول لإعادة برمجة PBMCs المجمدة (التي تم الحصول عليها مباشرة من معطف الشهباء)، والتفاصيل من آثار عملية كبيرة عند اس?...

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وقد تم تمويل هذه الدراسات في جزء من جائزة UO1HL107443 NIH-01 لGJM وجنرال موتورز.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة كتالوج رقم التعليقات (اختياري)
BD خلية CPT Vacutainer أنبوب التحضير مع سترات الصوديوم BD العلوم البيولوجية 362760
QBSF-60 الخلايا الجذعية متوسطة الجودة البيولوجية 160-204-101
IMDM إينفيتروجن 12440
DMEM/F12 إينفيتروجن 11330
FBS أتلانتا الحيوية S10250
استبدال خروج المغلوب المصل إينفيتروجن 10828
Primocin Invivogen النمل PM-2
القلم / بكتيريا إينفيتروجن 15140
الجلوتامين L- إينفيتروجن 25030
غير الأحماض الأمينية الأساسية إينفيتروجن 11140
β-المركابتويثانول النائب Biomedicals 190242
حمض الاسكوربيك سيجما A4544
IGF-1 R & D أنظمة 291-G1
IL-3 R & D أنظمة 203-IL
SCF R & D أنظمة 255-SC
EPO R & D أنظمة 286-EP
ديكساميثازون سيجما D4902
Polybrene سيجما H-9268
bFGF R & D أنظمة 233-FB
Stemolecule Y27632 Stemgent 04-0012
ES عينة ماركر خلية كيت ميليبور SCR002

References

  1. Lowry, W. E., Richter, L., Yachechko, R., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
  2. Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
  3. Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  4. Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  5. Stadtfeld, M., Hochedlinger, K., et al. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24, 2239-2263 (2010).
  6. Somers, A., Jean, J. C., Sommer, C. A., et al. Generation of transgene-free lung disease-specific human induced pluripotent stem cells using a single excisable lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 28, 1728-1740 (2010).
  7. Loh, Y. H., Hartung, O., Li, H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
  8. Seki, T., Yuasa, S., Oda, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
  9. Staerk, J., Dawlaty, M. M., Gao, Q., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
  10. Chou, B. K., Mali, P., Huang, X., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21, 518-529 (2011).
  11. vanden Akker, E., Satchwell, T. J., Pellegrin, S., Daniels, G., Toye, A. M. The majority of the in vitro erythroid expansion potential resides in CD34(-) cells, outweighing the contribution of CD34(+) cells and significantly increasing the erythroblast yield from peripheral blood samples. Haematologica. 95, 1594-1598 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

68 iPSCs PBMCs lentiviral excisable STEMCCA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved