A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
هنا نعرض بروتوكول بسيطة وفعالة لتوليد iPSCs الإنسان من مل 3-4 من الدم المحيطي واحد باستخدام ناقلات lentiviral إعادة برمجة. إعادة برمجة خلايا الدم متاحة بسهولة وعود لتسريع استخدام تكنولوجيا التوجيهية من خلال جعلها في متناول مجتمع بحثي واسع النطاق.
من خلال التعبير خارج الرحم من عوامل النسخ الأربعة، Oct4، Klf4، وSox2 cMyc، يمكن تحويل الخلايا الجسدية الإنسان إلى حالة المحفزة، وتوليد ما يسمى الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs) 1-4. المريض محددة iPSCs تفتقر إلى المخاوف الأخلاقية التي تحيط الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية)، وسوف تجاوز الرفض المناعي ممكن. وهكذا، وقد اجتذبت اهتماما كبيرا لiPSCs دراسات النمذجة المرض، وفحص المركبات الدوائية، والعلاج التجديدي 5.
لقد أظهرنا توليد التحوير خالية iPSCs الإنسان من المرضى الذين يعانون من أمراض الرئة المختلفة باستخدام واحد excisable الجذعية lentiviral متعدد المقارين راديو كاسيت الخليوي (STEMCCA) ترميز العوامل ياماناكا 6. وقد تم توليد هذه الخطوط التوجيهية من الخلايا الليفية الجلد، ونوع من الخلايا الأكثر شيوعا التي تستخدم لإعادة البرمجة. عادة، والحصول على الخلايا الليفية الجلد يتطلب كمة خزعة تليها التوسع في الخليةق في الثقافة لبضع فقرات و. الأهم من ذلك، فقد أفاد عدد من المجموعات إعادة برمجة خلايا الدم المحيطي في iPSCs 7-9. في دراسة واحدة، كان يعمل على إصدار محرض تيت من ناقلات STEMCCA 9، الأمر الذي يتطلب أن تكون خلايا الدم المصابة في وقت واحد مع الفيروسة البطيئة بالموقع جوهري ترميز العكس التتراسيكلين transactivator. وعلى النقيض من الخلايا الليفية، يمكن جمعها عن طريق الخلايا الدموية المحيطية والإجراءات مينيملي، والحد بشكل كبير من الانزعاج والضيق للمريض. ويجوز للبروتوكول بسيطة وفعالة لإعادة برمجة خلايا الدم باستخدام ناقلات التأسيسي excisable واحدة الإسراع في تطبيق التكنولوجيا التوجيهية من خلال جعلها في متناول مجتمع بحثي واسع النطاق. وعلاوة على ذلك، إعادة برمجة الخلايا الدموية المحيطية ويسمح لتوليد iPSCs من الأفراد التي ينبغي تجنبها خزعات الجلد (أي. الشاذة تندب) أو بسبب ظروف المرض موجود مسبقا preventiنانوغرام الحصول على الخزعات لكمة.
هنا علينا أن نبرهن على بروتوكول لتوليد iPSCs الإنسان من الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMCs) باستخدام واحد floxed-excisable ناقلات lentiviral معربا عن العوامل جوهري 4. يتم توسيع PBMCs جمعها طازجة أو إذابة لمدة 9 أيام كما هو موضح في المتوسط 10،11 المحتوية على حمض الاسكوربيك، SCF، IGF-1، IL-3 و EPO قبل transduced مع الفيروسة البطيئة STEMCCA. ومطلي الخلايا ثم على MEFs وESC مثل المستعمرات يمكن تصور أسبوعين بعد الإصابة. وأخيرا، يتم توسيع استنساخ مختارة واختبار للتعبير عن علامات تعدد القدرات SSEA-4، ترا-1-60 و ترا-1 81. هذا البروتوكول بسيطة وقوية ومتسقة للغاية، وتوفير منهجية موثوقة لتوليد iPSCs الإنسان من الوصول إليها بسهولة ML 4 من الدم.
1. العزلة والتوسع في خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (PBMCs)
اليوم 0
DAY 3 و DAY 6
2. تنبيغ من PBMCs مع الفيروسة البطيئة STEMCCA
يوم 9
يوم 10
3. Transduced الطلاء على خلايا MEFs
اليوم 11
اليوم 12
اليوم 14
4. قطف والتوسع في النسخ اللجنة التوجيهية
~ DAY 30 حتي 40
5. تلوين المناعي للعلامات تعدد القدرات
6. استئصال INTEGتصنيف STEMCCA المتجهات
علينا أن نبرهن على بروتوكول بسيطة وفعالة لتوليد iPSCs الإنسان من PBMCs باستخدام ناقلات lentiviral واحد. الشكل 1A يظهر التمثيل التخطيطي للبروتوكول. يتم جمع الدم في أنبوب BD CPT Vacutainer إعداد الخليوي مع سترات الصوديوم، وبعد الطرد المركزي، ويمكن جمع النوى من الخلايا واجهة بي?...
نحن هنا تصف استخدام ناقلات lentiviral STEMCCA لتوليد iPSCs من خلايا وحيدات النوى الإنسان عزله من ملليلتر قليلة من الدم المحيطي جمعها طازجة. ويمكن أيضا أن تستخدم بروتوكول لإعادة برمجة PBMCs المجمدة (التي تم الحصول عليها مباشرة من معطف الشهباء)، والتفاصيل من آثار عملية كبيرة عند اس?...
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
وقد تم تمويل هذه الدراسات في جزء من جائزة UO1HL107443 NIH-01 لGJM وجنرال موتورز.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
اسم كاشف | شركة | كتالوج رقم | التعليقات (اختياري) |
BD خلية CPT Vacutainer أنبوب التحضير مع سترات الصوديوم | BD العلوم البيولوجية | 362760 | |
QBSF-60 الخلايا الجذعية متوسطة | الجودة البيولوجية | 160-204-101 | |
IMDM | إينفيتروجن | 12440 | |
DMEM/F12 | إينفيتروجن | 11330 | |
FBS | أتلانتا الحيوية | S10250 | |
استبدال خروج المغلوب المصل | إينفيتروجن | 10828 | |
Primocin | Invivogen | النمل PM-2 | |
القلم / بكتيريا | إينفيتروجن | 15140 | |
الجلوتامين L- | إينفيتروجن | 25030 | |
غير الأحماض الأمينية الأساسية | إينفيتروجن | 11140 | |
β-المركابتويثانول | النائب Biomedicals | 190242 | |
حمض الاسكوربيك | سيجما | A4544 | |
IGF-1 | R & D أنظمة | 291-G1 | |
IL-3 | R & D أنظمة | 203-IL | |
SCF | R & D أنظمة | 255-SC | |
EPO | R & D أنظمة | 286-EP | |
ديكساميثازون | سيجما | D4902 | |
Polybrene | سيجما | H-9268 | |
bFGF | R & D أنظمة | 233-FB | |
Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
ES عينة ماركر خلية كيت | ميليبور | SCR002 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved