Geração de Células-tronco pluripotentes induzidas a partir de sangue periférico usando o STEMCCA Lentivirus Vector

Resumo

Aqui, mostramos um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs humanos a partir de 3-4 ml de sangue periférico utilizando um vector lentiviral única reprogramação. Reprogramação de células do sangue prontamente disponíveis promete acelerar a utilização da tecnologia iPSC tornando-o acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa.

Resumo

Através da expressão ectópica de quatro factores de transcrição, Oct4, Klf4, Sox2 e cMyc, as células somáticas humanas pode ser convertido para um estado pluripotente, gerando assim chamadas células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) ^1-4. Específicas do paciente iPSCs faltam as preocupações éticas que envolvem as células-tronco embrionárias (CTEs) e seria ignorar rejeição imunológica possível. Assim, iPSCs têm atraído considerável atenção para estudos de doenças de modelagem, a triagem de compostos farmacológicos e terapias regenerativas ^5.

Nós mostramos a geração de transgene livres iPSCs humanos a partir de pacientes com doenças pulmonares diferentes, utilizando um único coletável policistrónica lentiviral Cassete Stem Cell (STEMCCA) codificando os factores Yamanaka ^6. Estas linhas iPSC foram gerados a partir de fibroblastos da pele, o tipo celular mais comum utilizado para a reprogramação. Normalmente, a obtenção de fibroblastos requer uma biópsia por punção da pele seguido de expansão das célulass na cultura de algumas passagens. É importante notar que um certo número de grupos têm relatado a reprogramação de células humanas de sangue periférico em iPSCs ^7-9. Num estudo, uma versão induzível Tet do vector STEMCCA foi empregue ^9, o que exigia que as células do sangue a ser simultaneamente infectadas com um lentivírus constitutivamente activo que codifica a tetraciclina reversa transactivador. Em contraste com os fibroblastos, células do sangue periférico podem ser recolhidas através de procedimentos minimamente invasivos, reduzindo o desconforto e sofrimento do paciente. Um protocolo simples e eficaz para a reprogramação de células de sangue utilizando um único vetor constitutivo coletável pode acelerar a aplicação da tecnologia iPSC tornando-o acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa. Além disso, a reprogramação de células de sangue periférico permite a geração de iPSCs de indivíduos em que as biópsias da pele devem ser evitados (ie. Aberrante cicatriz) ou devido a condições de doença pré-existente prevenng acesso a punch.

Aqui demonstramos um protocolo para a geração de iPSCs humanos a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMC), utilizando um vector floxed-coletável único lentiviral que expressam constitutivamente as quatro factores. PBMCs recolhidos de fresco ou descongelado são expandidos durante 9 dias, tal como descrito em ^10,11 de ácido ascórbico, meio contendo SCF, IGF-1, IL-3 e EPO antes de serem transduzidas com o lentivirus STEMCCA. As células são então plaqueadas em MEFs e ESC-como colónias podem ser visualizadas de duas semanas após a infecção. Finalmente, os clones seleccionados são expandidos e testados quanto a expressão dos marcadores de pluripotência SSEA-4, Tra-1-60 e Tra-1-81. Este protocolo é simples, robusto e altamente consistente, fornecendo uma metodologia fiável para a geração de iPSCs humanos prontamente acessível a partir de 4 ml de sangue.

Protocolo

1. Isolamento e expansão de células mononucleares do sangue periférico (PBMC)

DIA 0

1. Aspire 4 ml de sangue periférico num Vacutainer CPT BD Tubo Preparação celular com citrato de sódio. Inverter o tubo de 8 a 10 vezes e centrifugar a 1800 xg durante 30 min à temperatura ambiente. Idealmente, esta etapa deve ser feito dentro de 2 horas da coleta.
2. Recolher as células mononucleares (MCs), pipetando buffy coat (camada de células entre barreira de gel e de plasma) para um tubo de 15 ml estéril de centrífuga cónico. Levar o volume total a 10 ml com fosfato estéril-salino tamponado (PBS), invertido várias vezes e centrifugar a 300 xg durante 15 min.
3. Ressuspender as células em 10 ml de PBS estéril e efectuar a contagem de células. Transferir 1 a 2x10 ⁶ células para um tubo estéril de 15 ml de centrífuga cónico e centrifugar a 300 xg durante 10 min.
4. Ressuspender as células em 2 ml de meio de expansão (EM) (QBSF-60 Medium Stem Cell contendo 50 ug / ml AscoÁcido rbic, 50 ng / ml de SCF, 10 ng / ml de IL-3, de 2 U / mL de EPO, 40 ng / ml de IGF-1, 1 uM de dexametasona e 100 ug / ml ou 1 primocin% Pen / Strep) e transferir para um poço de uma placa de 12 poços. Incubar as células em uma de 37 ° C, 5% CO ₂ incubadora.
5. Centrifugar células restantes a 300 x g durante 10 min e liof ~ 2x10 ⁶ células / frasco em FBS contendo DMSO a 10%.
6. Para iniciar o protocolo utilizando PBMCs congelados, descongelar uma ampola de células para 10 ml de meio QBSF e centrifugar a 300 xg durante 10 min. Ressuspender as células em 2 ml de EM e transferir para um poço de uma placa de 12 poços. Incubar as células em uma de 37 ° C, 5% CO ₂ incubadora.

Dia 3 eo dia 6

17. Transferir as células para um tubo estéril de 15 ml e lava-cónica do poço uma vez com 1 ml de QBSF-60 Medium Stem Cell para recolher as células aderentes.
18. Centrifugar as células a 300 xg durante 10 min.
19. Ressuspender as células em 2 ml de EM e transferir para um poço de um 12Bem-placa. Incubar as células em uma de 37 ° C, 5% CO ₂ incubadora.

2. Transdução de PBMCs com STEMCCA Lentivirus

DIA 9

1. Transferir as células para um tubo estéril de 15 ml e lava-cónica do poço uma vez com 1 ml de QBSF-60 Medium Stem Cell para recolher as células aderentes.
2. Centrifugar as células a 300 xg durante 10 min.
3. Ressuspender as células em 1 ml de EM fresco contendo 5 ug / ml de polibreno e lentivírus STEMCCA (MOI = 1 a 10) e transferência para uma cavidade de uma placa de 12 poços. (O protocolo descreve a produção de partículas de lentivirais podem ser encontradas em http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/ )
4. Girar a placa a 2250 rpm a 25 ° C durante 90 min.
5. Depois de girar, adicionar um adicional de 1 ml EM frescos contendo 5 ug / ml de polibreno durante um total de 2 ml de meio e incubar a placa a 37 ° C,5% de CO ₂ incubadora.

DIA 10

16. Transferir as células para um tubo estéril de 15 ml e lava-cónica do poço uma vez com 1 ml de QBSF-60 Medium Stem Cell para recolher as células aderentes.
17. Centrifugar as células a 300 xg durante 10 min.
18. Ressuspender as células em 2 ml de EM e transferir para um poço de uma placa de 12 poços. Incubar as células em uma de 37 ° C, 5% CO ₂ incubadora.

3. Plating células transduzidas para MEFs

DIA 11

1. Revestir os poços de uma placa de 6 poços com 0,1% de gelatina e de fibroblastos de ratinho inactivado placa embrionárias (MEFs) a 2x10 ⁵ células / poço em meio de MEF (IMDM contendo 10% de FBS, 1% de não-aminoácidos essenciais, 100 uM β- -mercaptoetanol, 2 mM de L-glutamina, 100 ug / ml ou 1 primocin% Pen / Strep). Prepare três poços por infecção.

DIA 12

2. Transferir as células para um tubo estéril de 15 mL cónico e lavar o bem uma vez com 1 ml de QBSF-60 Medium Stem Cell para recolher as células aderentes.
3. Ressuspender as células em 3 ml de MEF meio contendo 10 ng / ml de bFGF, e Ácido Ascórbico e factores de crescimento, nas mesmas concentrações utilizadas como meio de EM (50 Ácido Ascórbico ug / ml, 50 ng / ml de SCF, 10 ng / ml IL -3, 2 U / mL de EPO, 40 ng / ml de IGF-1, 1 uM de dexametasona).
4. Placa 1 ml de células por cavidade de uma placa de 6 poços contendo MEFs. Adicionar 1,5 ml de meio MEF com bFGF, ácido ascórbico, e factores de crescimento para um total de 2,5 ml de meio / poço.
5. Girar a placa a 500 rpm a 25 ° C durante 30 min. Incubar a placa num 37 ° C, 5% CO ₂ incubadora.

DIA 14

6. Células de alimentação a cada dois dias com 2,5 ml de meio de MEF contendo 10 ng / ml de bFGF e 50 Ácido Ascórbico ug / ml (sem factores de crescimento). Aspirar e descartar células flutuantes com cada refeição.
7. Adicionar MEFs adicional conforme necessário (normalmente uma vez por semana).

p "> DIA ~ 20

8. Uma vez que as colónias aparecem pequenas, as células de alimentação diária com 2 ml de células estaminais embrionárias humanas (CTEh) meio (DMEM/F12 substituição Knockout contendo 20% de soro, 1% de não-aminoácidos essenciais, 100 uM β-mercaptoetanol, 2 mM de L-Glutamina , 100 ug / ml ou 1 primocin% Pen / Strep e 10 ng / ml de bFGF).

4. Picking e Expansão da iPSC Clones

~ DIA 30-40

1. Escolha cada colónia em poços individuais de uma placa de 12 poços pré-semeadas com MEFs inactivada contendo 1 ml / poço de meio hESC mais 10 uM de Stemolecule Y27632 (ROCK inibidor).
2. Alimentar as células depois diariamente com 1 ml de meio hESC apenas (sem inibidor ROCK).

5. Imunofluorescência para Marcadores pluripotência

1. A coloração foi realizada utilizando o kit "ES celular Kit Amostra Marker" da Millipore e seguindo o protocolo do fabricante.

6. Excisão de IntegPopulares STEMCCA Vector

1. Excisão de reprogramação cassete é conseguido utilizando uma Cre-IRES-Puro transfecção vetor expressando seguindo e seleção Puromicina breve como descrito ^6.

Resultados

Nós demonstramos um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs humanos a partir de PBMCs, utilizando um vector lentiviral única. Figura 1A mostra uma representação esquemática do protocolo. O sangue é recolhido para um tubo CPT Vacutainer BD Preparação celular com citrato de sódio, e após a centrifugação, as células mononucleares pode ser recolhida a partir da interface entre o gel de poliéster e o plasma (buffy coat) (Figura 1B). As PBMCs isoladas são então ex...

Discussão

Descrevemos aqui a utilização do vector lentiviral STEMCCA para gerar iPSCs humanos a partir de células mononucleares isoladas de alguns mililitros de solução recentemente colhido sangue periférico. O protocolo pode também ser usado para reprogramar PBMCs congelados (obtido directamente a partir de buffy coat), um detalhe de implicações práticas quando se utilizam células de dador adquiridas a partir de um local distante. Antes da indução de reprogramação, PBMCs isoladas deve ser submetida a um passo de e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
BD Vacutainer CPT Tubo preparação celular com citrato de sódio	BD Biosciences	362760
QBSF-60 Médio Stem Cell	Qualidade Biológica	160-204-101
IMDM	Invitrogen	12440
DMEM/F12	Invitrogen	11330
FBS	Atlanta Biologicals	S10250
Substituição Knockout Serum	Invitrogen	10828
Primocin	Invivogen	ant-pm-2
Pen / Strep	Invitrogen	15140
L-Glutamina	Invitrogen	25030
Não-essenciais Aminoácidos	Invitrogen	11140
β-mercaptoetanol	Biomedicals MP	190242
Ácido ascórbico	Sigma	A4544
IGF-1	R & D Systems	291-G1
IL-3	R & D Systems	203-IL
SCF	R & D Systems	255-SC
EPO	R & D Systems	286-PE
Dexametasona	Sigma	D4902
Polybrene	Sigma	H-9268
bFGF	R & D Systems	233-FB
Stemolecule Y27632	Stemgent	04-0012
ES celular Kit Amostra Marcador	Millipore	SCR002