Поколение человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из периферической крови с помощью STEMCCA Lentiviral векторного

Резюме

Здесь мы покажем простой и эффективный протокол для генерации ИПСК человека с 3-4 мл периферической крови с помощью одной лентивирусов вектор перепрограммирования. Перепрограммирование доступны клеток крови обещает ускорить использование ИПСК технологий, сделав их доступными для более широкого научного сообщества.

Аннотация

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)^1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies⁵.

We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors⁶. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs^7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed⁹, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.

Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described^10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

протокол

1. Выделение и расширение мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК)

День 0

1. Нарисуйте 4 мл периферической крови в BD Vacutainer CPT сотовых Подготовка труб с цитрат натрия. Обратить трубки 8 до 10 раз и центрифуге при 1800 мкг в течение 30 мин при комнатной температуре. В идеале, этот шаг должен быть сделано в течение 2 часов после сбора.
2. Сбор мононуклеарных клеток (ТК) с помощью пипетки Баффи пальто (слой клеток между гелем барьер и плазма) в стерильный 15 мл коническую трубку центрифуги. Принесите общим объемом до 10 мл стерильной фосфатно-солевом буфере (PBS), переверните несколько раз, и центрифуги при 300 х г в течение 15 мин.
3. Ресуспендируют клеток в 10 мл стерильной PBS и выполнять клеток. Передача от 1 до 2х10 ⁶ клеток в стерильную 15 мл коническую трубку центрифуги и центрифугируют при 300 х г в течение 10 мин.
4. Ресуспендируют клеток в 2 мл расширение среды (EM) (QBSF-60 Stem Cell среде, содержащей 50 мкг / мл AscoRBIC кислота, 50 нг / мл SCF, 10 нг / мл IL-3, 2 ед / мл EPO, 40 нг / мл IGF-1, 1 Дексаметазон мкМ и 100 мкг / мл primocin или 1% Pen / Strep) и передать одну лунку в 12-луночный планшет. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO ₂ инкубаторе.
5. Центрифуга оставшиеся клетки при 300 х г в течение 10 мин и заморозить ~ 2x10 ⁶ клеток / флакон в FBS, содержащей 10% ДМСО.
6. Чтобы начать протокол, используя замороженные РВМС, оттаивать 1 флакон клеток в 10 мл QBSF среднего и центрифуги при 300 х г в течение 10 мин. Ресуспендируют клеток в 2 мл ЭМ и трансфер в одну лунку в 12-луночный планшет. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO ₂ инкубаторе.

ДЕНЬ 3 и 6 день

17. Передача клетки в стерильный 15 мл коническую трубку и промыть хорошо, как только с 1 мл QBSF-60 Stem Cell Средний собирать прилипшие клетки.
18. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 10 мин.
19. Ресуспендируют клеток в 2 мл ЭМ и трансфер в одну лунку в 12-Луночный планшет. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO ₂ инкубаторе.

2. Transduction МНПК с STEMCCA лентивирус

День 9

1. Передача клетки в стерильный 15 мл коническую трубку и промыть хорошо, как только с 1 мл QBSF-60 Stem Cell Средний собирать прилипшие клетки.
2. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 10 мин.
3. Ресуспендируют клеток в 1 мл свежей EM, содержащий 5 мкг / мл полибрен и STEMCCA лентивирус (MOI = 1 до 10) и трансфер в одну лунку в 12-луночный планшет. (Протокол описания производства лентивирусные частиц можно найти на http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/ )
4. Побочные пластины на 2250 оборотов в минуту при 25 ° C в течение 90 мин.
5. После спина, добавить дополнительно 1 мл свежего EM , содержащий 5 мкг / мл полибрен на общую сумму 2 мл среды и инкубировать пластины в 37 ° C,5% СО ₂ инкубатора.

ДЕНЬ 10

16. Передача клетки в стерильный 15 мл коническую трубку и промыть хорошо, как только с 1 мл QBSF-60 Stem Cell Средний собирать прилипшие клетки.
17. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 10 мин.
18. Ресуспендируют клеток в 2 мл ЭМ и передавать на 1 лунку в 12-луночный планшет. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO ₂ инкубаторе.

3. Покрытие трансдуцированных клеток на MEFs

ДЕНЬ 11

1. Пальто скважины 6-луночный планшет с 0,1% желатина и пластины инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) на 2x10 ⁵ клеток / лунку в MEF среды (IMDM, содержащей 10% FBS, 1% Non-незаменимые аминокислоты, 100 мкМ β- меркаптоэтанол, 2 мМ L-глутамина, 100 мкг / мл primocin или 1% Pen / Strep). Подготовка 3 скважины на инфекцию.

ДЕНЬ 12

2. Передача клетки в стерильный 15 мл коническую трубку и промыть хорошо, как только с 1 мл QBSF-60 Stem Cell Средний собирать прилипшие клетки.
3. Ресуспендируют клеток в 3 мл MEF среде, содержащей 10 нг / мл шФРФ, а также аскорбиновая кислота и факторов роста в тех же концентрациях, используемых в EM среды (50 мкг / мл аскорбиновой кислоты, 50 нг / мл SCF, 10 нг / мл IL -3, 2 ед / мл EPO, 40 нг / мл IGF-1, 1 мкМ дексаметазон).
4. Plate 1 мл клеток на лунку 6-луночный планшет, содержащий MEFs. Добавить 1,5 мл MEF сред с шФРФ, аскорбиновая кислота, и факторы роста на общую сумму в 2,5 мл среды / лунку.
5. Побочные пластины на 500 оборотов в минуту при 25 ° С в течение 30 мин. Инкубировать при 37 ° C, 5% CO ₂ инкубаторе.

ДЕНЬ 14

6. Поток клеток каждый день с 2,5 мл среды MEF, содержащий 10 нг / мл шФРФ и 50 мкг / мл Аскорбиновая кислота (без факторов роста). Аспирируйте и выбросить плавающие клетки с каждого канала.
7. Добавить дополнительные MEFs по мере необходимости (обычно раз в неделю).

р "> ~ 20 день

8. Как только появляются небольшие колонии, корма клетки ежедневно с 2 мл человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), средний (DMEM/F12, содержащей 20% сыворотки Knockout замена, 1% Non-незаменимые аминокислоты, 100 мкМ β-меркаптоэтанол, 2 мМ L-глутамина , 100 мкг / мл primocin или 1% Pen / Strep и 10 нг / мл шФРФ).

4. Комплектование и расширение ИПСК клонов

~ 30-й день - 40

1. Возьмите каждую колонию в отдельных скважинах из 12-луночный планшет предварительно высевали с инактивированной MEFs, содержащий 1 мл / лунку чЭСК средний плюс 10 мкМ Stemolecule Y27632 (ROCK ингибитор).
2. Поток клетки далее ежедневно по 1 мл чЭСК только среду (без ингибиторов ROCK).

5. Иммунофлуоресцентного окрашивания для маркеров плюрипотентности

1. Окрашивание производится с помощью комплекта "ES сотовых Маркер Sample Kit" от Millipore и следуя протоколу производителя.

6. Иссечение INTEGНоминальная STEMCCA векторного

1. Иссечение перепрограммирования кассеты достигается использованием Cre-IRES-Puro выразить вектор после трансфекции и небольшая подборка Пуромицин, как описано ^6.

Результаты

Мы демонстрируем простой и эффективный протокол для генерации ИПСК человека от МПК с использованием одного лентивирусов вектор. Рисунок 1А показывает схематическое представление протокола. Кровь собирали в BD Vacutainer CPT сотовых Подготовка труб с цитрат натрия, и после центрифуг...

Обсуждение

Мы здесь описывать использование вектора STEMCCA лентивирусов для получения ИПСК человека из мононуклеарных клеток, выделенных из нескольких миллилитров свежесобранных периферической крови. Протокол также может быть использован для перепрограммирования замороженные РВМС (полученные ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
BD Vacutainer CPT сотовых Подготовка труб с цитрат натрия	BD Biosciences	362760
QBSF-60 Stem Cell Средний	Качество Биологические	160-204-101
IMDM	Invitrogen	12440
DMEM/F12	Invitrogen	11330
FBS	Атланта биологические	S10250
Нокаут Сыворотка замена	Invitrogen	10828
Primocin	Invivogen	Муравей-ПМ-2
Pen / Strep	Invitrogen	15140
L-Глютамин	Invitrogen	25030
Номера для незаменимых аминокислот	Invitrogen	11140
β-меркаптоэтанола	MP Biomedicals	190242
Аскорбиновая кислота	Сигма	A4544
IGF-1	R & D Systems	291-G1
IL-3	R & D Systems	203-IL
SCF	R & D Systems	255-SC
EPO	R & D Systems	286-EP
Дексаметазон	Сигма	D4902
Полибрен	Сигма	H-9268
шФРФ	R & D Systems	233-FB
Stemolecule Y27632	Stemgent	04-0012
ES сотовых Маркер Sample Kit	Millipore	SCR002