Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Burada tek bir lentiviral yeniden programlanması vektörü kullanılarak periferal kan 3-4 ml insan iPSCs üretimi için basit ve etkili bir protokol göstermektedir. Hazır kan hücrelerinin yeniden programlanması daha geniş bir araştırma toplum için erişilebilir kılarak IPSC teknoloji kullanımı hızlandırmak için vaat ediyor.
Dört transkripsiyon faktörleri, Oct4, Klf4 ve ektopik ekspresyonu ile, Sox2 ve cMyc, insan somatik hücre sözde indüklenmiş pluripotent kök hücreleri (iPSCs) 1-4 üreten, bir pluripotent durum için dönüştürülebilir. Hastaya özel iPSCs embriyonik kök hücreler (EKH) çevreleyen ve olası immün red baypas edecek etik kaygılar yoksundur. Böylece, iPSCs hastalığı modelleme çalışmaları, farmakolojik bileşikler tarama ve rejeneratif tedaviler 5 için oldukça dikkat çekmiştir.
Bu Yamanaka faktörler 6 kodlayan bir tek vergilendirilebilir polisistronik lentiviral Kök Hücre Kaseti (STEMCCA) kullanılarak farklı akciğer hastalıkları olan hastalardan alınan transgeni içermeyen insan iPSCs üretimi göstermiştir. Bu IPSC çizgiler deri fibroblastları, yeniden programlanması için en yaygın olarak kullanılan hücre tipinden elde edildi. Normal olarak, fibroblastlar elde hücrenin genişlemesi punch biyopsi ardından bir cilt gerektirirBirkaç pasajlar için kültür s. Önemli olarak, grup halinde iPSCs 7-9, insan periferik kan hücrelerinin yeniden programlanması bildirilmiştir. Bir çalışmada, STEMCCA vektörünün bir Tet indüklenebilir versiyon kan hücreleri eşzamanlı olarak ters tetrasiklin Transaktivatörü kodlayan bir yapısal olarak aktif lentivirüs ile enfekte edilmesi için gerekli olan, 9 kullanılmıştır. Fibroblastlar tersine, periferik kan hücrelerinin büyük ölçüde hastanın rahatsızlık ve sıkıntı azaltarak, minimal invazif yoluyla toplanabilir. Kurucu bir tek vergiye tabi vektör kullanarak kan hücreleri yeniden programlama için basit ve etkili bir protokol daha geniş bir araştırma toplum için erişilebilir kılarak IPSC teknolojisi uygulama hızlandırabilir. Bundan başka, periferal kan hücrelerinin yeniden programlanması deri biyopsileri kaçınılmalıdır (örn. Anormal yara) ya da bağlı olarak önceden var olan hastalık durumlannın preventi için gereken bireyler dan iPSCs üretilmesine olanak tanırpunch biyopsi için ng erişim.
Burada yapısal 4 faktörleri ifade eden bir tek floxed-vergiye tabi lentiviral vektörü kullanılarak periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) insan iPSCs üretimi için bir protokol göstermektedir. Yeni toplanmış ve çözülmüş olan PBMC STEMCCA lentivirüs ile transdük önce olduğu gibi ortam içeren askorbik asit, 10,11 tarif 9 gün, SCF, IGF-1, IL-3 ve EPO için genişletilir. Hücreler daha sonra MEFS üzerine kaplanır ve ESC gibi koloniler iki hafta sonra enfeksiyon canlandırılabilir. Son olarak, seçilen klonlar genişletildi ve pluripotency işaretleri SSEA-4, Tra-1-60 ve Tra-1-81 ekspresyonu açısından test edilmiştir. Bu protokol kan kolayca erişilebilir 4 ml insan iPSCs üretimi için güvenilir bir yöntem sağlayan, basit, güçlü ve son derece tutarlıdır.
1. Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) izolasyonu ve Genişletme
GÜN 0
GÜN 3 ve 6. GÜN
2. STEMCCA Lentivirus ile PBMC'ler ve İletimi
GÜN 9
10. GÜN
3. Kaplama MEFS üzerine Hücreleri transdüklü
GÜN 11
GÜN 12
GÜN 14
4. Toplama ve IPSC Klonların Genişletme
~ GÜN 30 - 40
5. Pluripotency Markers için İmmünofloresan Boyama
6. INTEG eksizyonunominal STEMCCA Vektör
Tek bir lentiviral vektörü kullanılarak, insan PBMC'leri iPSCs üretimi için basit ve etkili bir protokol göstermektedir. Şekil 1A protokol şematik bir temsilini gösterir. Kan BD Vacutainer CPT Hücre Hazırlanması Tüp sodyum sitrat ile toplanır ve santrifüj sonrasında, mononükleer hücreler polyester jel ve plazma (buffy coat) (Şekil 1B) arasındaki arayüz alınabilir. İzole PBMC'ler sonra 9 gün boyunca kültürü yayılmaktadır. Şekil 2 hü...
Burada, yeni toplanmış periferik kan birkaç mililitre izole edilen mononükleer hücreler insan iPSCs oluşturmak için STEMCCA lentiviral vektörünün kullanımı açıklanmaktadır. Protokol ayrıca uzak bir yerde alınan verici hücreleri kullanılarak, dondurulmuş zaman PBMC'ler (buffy coat doğrudan elde), önemli pratik etkileri bir ayrıntı yeniden programlanması için de kullanılabilir. Yeniden programlama indüksiyonundan önce izole PBMC'ler nükleer reprogramming daha makul hücrelerin sağlı...
Çıkar çatışması ilan etti.
Bu çalışmalar GJM ve GM NIH UO1HL107443-01 Ödülü tarafından finanse edildi.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reaktif Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar (isteğe bağlı) |
BD Vacutainer CPT Hücre Hazırlanması Tüp sodyum sitrat | BD Biosciences | 362760 | |
QBSF-60 Kök Hücre Orta | Kalite Biyolojik | 160-204-101 | |
IMDM | Invitrogen | 12440 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
FBS | Atlanta Biyolojik | S10250 | |
Nakavt Serum Değiştirme | Invitrogen | 10828 | |
Primocin | Invivogen | ant-am-2 | |
Kalem / Strep | Invitrogen | 15140 | |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
Temel Olmayan Amino Asitler | Invitrogen | 11140 | |
β-merkaptoetanol | MP Biomedicals | 190242 | |
Askorbik asit | Sigma | A4544 | |
IGF-1 | R & D Systems | 291-G1 | |
IL-3 | R & D Systems | 203-IL | |
SCF | R & D Systems | 255-SC | |
EPO | R & D Systems | 286-EP | |
Deksametazon | Sigma | D4902 | |
Polybrene | Sigma | H-9268 | |
bFGF | R & D Systems | 233-FB | |
Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
ES Hücre Marker Numune Seti | Millipore | SCR002 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır