Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Zusammenfassung

Hier zeigen wir, ein einfaches und effektives Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs 3-4 ml peripheres Blut unter Verwendung eines einzigen lentiviralen Vektors Umprogrammierung. Reprogrammierung von leicht verfügbaren Blutkörperchen verspricht die Nutzung von iPS-Technologie, indem sie Zugang zu einem breiteren Forschungsgemeinschaft beschleunigen.

Zusammenfassung

Durch die ektopische Expression von vier Transkriptionsfaktoren, Oct4, Klf4, Sox2 und cMyc können menschliche Körperzellen zu einer pluripotenten Zustand umgewandelt werden, erzeugen so genannte induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) ^1-4. Patienten-spezifischen iPS fehlen die ethischen Bedenken, die embryonalen Stammzellen (ESC) umgeben und möglich wäre Immunabwehr zu umgehen. So haben iPSCs große Aufmerksamkeit für die Krankheit Modeling-Studien, das Screening von pharmakologischen Verbindungen und regenerative Therapien ⁵ angezogen.

Wir haben die Erzeugung von Transgen-freien menschlichen iPS von Patienten mit unterschiedlichen Lungenerkrankungen mit einer einzigen verbrauchsteuerpflichtiger polycistronischen lentiviralen Stem Cell Kassette (STEMCCA) Codieren der Yamanaka Faktoren ⁶ gezeigt. Diese Linien wurden iPSC aus Hautfibroblasten, die häufigste Zelltyp zum Umprogrammieren verwendet erzeugt. Normalerweise erfordert ein Erhalten Fibroblasten Haut Stanzbiopsie gefolgt durch Expansion der Zelles in der Kultur für ein paar Passagen. Wichtigerweise haben eine Anzahl von Gruppen die Umprogrammierung von menschlichen peripheren Blutzellen in IPSCs ^7-9 berichtet. In einer Studie wurde eine induzierbare Tet Version des STEMCCA Vektor ⁹ verwendet, welche erforderlich ist, um die Blutzellen gleichzeitig mit einem konstitutiv aktiven Lentivirus Codieren des Reverse Tetracyclin-Transaktivator-infiziert. Im Gegensatz zu Fibroblasten, kann peripheren Blutzellen mittels minimal-invasive Verfahren gesammelt werden, stark reduziert die Beschwerden und Leiden des Patienten. Eine einfache und effektive Protokoll zur Reprogrammierung Blutkörperchen Verwendung eines konstitutiven einzigen verbrauchsteuerpflichtiger Vektor kann die Anwendung von iPS-Technologie, indem sie Zugang zu einem breiteren Forschungsgemeinschaft beschleunigen. Darüber hinaus Umprogrammierung der Zellen des peripheren Blutes ermöglicht die Erzeugung von iPS von Einzelpersonen in der Hautbiopsien vermieden werden (dh. Aberrante Narbenbildung) oder sollten aufgrund bereits bestehenden Krankheitszuständen preventing Zugang zu Stanzbiopsien.

Hier zeigen wir, ein Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) unter Verwendung eines einzigen floxed-verbrauchsteuerpflichtigen Lentivirusvektor konstitutiv exprimieren die 4 Faktoren. Frisch gesammelten oder aufgetaute PBMCs werden für 9 Tage wie beschrieben in Medium enthaltenden ^10,11 Ascorbinsäure, SCF, IGF-1, IL-3 und EPO bevor es mit dem STEMCCA Lentivirus transduziert erweitert. Die Zellen werden dann auf MEFs ausplattiert und ESC-ähnliche Kolonien visualisiert werden kann 2 Wochen nach der Infektion. Schließlich werden selektierten Klone expandiert und auf die Expression der Marker Pluripotenz SSEA-4, Tra-1-60 und Tra-1-81. Dieses Protokoll ist einfach, robust und sehr konsistente, eine zuverlässige Methode zur Herstellung von menschlichen IPSCs aus leicht zugänglichen 4 ml Blut.

Protokoll

Ein. Isolation und Expansion von peripheren Blut mononukleären Zellen (PBMCs)

DAY 0

1. Zeichnen 4 ml peripheres Blut in einen BD Vacutainer CPT Zellpräparation Tube mit Natriumcitrat. Das Röhrchen 8 bis 10 Mal und zentrifugieren bei 1.800 xg für 30 min bei Raumtemperatur. Idealerweise sollte dieser Schritt innerhalb von 2 h der Entnahme erfolgen.
2. Sammeln Sie die mononukleären Zellen (MCs) durch Pipettieren der Buffy-Coat (Zellschicht zwischen Gelbarriere und Plasma) in ein steriles 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen. Bringt Gesamtvolumen auf 10 ml mit sterilem Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), Invertzucker mehrmals und Zentrifuge bei 300 × g für 15 min.
3. Die Zellen in 10 ml sterilem PBS und führen Zellzahl. Übertragen 1 bis 2x10 ⁶ Zellen in einen sterilen konischen 15 ml Zentrifugenröhrchen eingewogen und bei 300 g zentrifugiert für 10 min.
4. Die Zellen in 2 ml der Expansion Medium (EM) (QBSF-60 Stem Cell Medium, das 50 ug / ml AscoRBIC Acid, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml IL-3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml IGF-1, 1 nM Dexamethason und 100 ug / ml primocin oder 1% Pen / Strep) und zu übertragen eine Vertiefung einer 12-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 ° C, 5% CO _2-Inkubator.
5. Zentrifuge restlichen Zellen bei 300 x g für 10 min und gefriergetrocknet ~ 2x10 ⁶ Zellen / Fläschchen in FBS, das 10% DMSO.
6. Um das Protokoll mit gefrorenen PBMCs beginnen, aufzutauen 1 Fläschchen von Zellen in 10 ml QBSF mittel-und Zentrifuge bei 300 xg für 10 min. Die Zellen in 2 ml EM und Transfer in ein Well einer 12-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 ° C, 5% CO _2-Inkubator.

Tag 3 und Tag 6

17. Übertragen der Zellen an ein steriles 15 ml konischen Röhrchen und wäscht die auch einmal mit 1 ml QBSF-60 Stem Cell Medium um anhaftende Zellen zu sammeln.
18. Zentrifugation der Zellen bei 300 g für 10 min.
19. Die Zellen in 2 ml EM und Übertragung auf eine Vertiefung einer 12-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 ° C, 5% CO _2-Inkubator.

2. Transduktion von PBMCs mit STEMCCA Lentivirus

TAG 9

1. Übertragen der Zellen an ein steriles 15 ml konischen Röhrchen und wäscht die auch einmal mit 1 ml QBSF-60 Stem Cell Medium um anhaftende Zellen zu sammeln.
2. Zentrifugation der Zellen bei 300 g für 10 min.
3. Die Zellen in 1 ml frischem EM enthaltend 5 ug / ml Polybren und STEMCCA Lentivirus (MOI = 1 bis 10) aufnehmen und in eine Vertiefung einer 12-Well-Platte. (Das Protokoll beschreibt die Produktion von lentiviralen Partikeln finden Sie unter http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/ )
4. Spin die Platte bei 2250 UpM bei 25 ° C für 90 min.
5. Nach Spin, eine zusätzliche 1 ml frisches EM enthaltend 5 ug / ml Polybren für insgesamt 2 ml Medium und Inkubation der Platte bei 37 ° C,5% CO _2-Inkubator.

TAG 10

16. Übertragen der Zellen an ein steriles 15 ml konischen Röhrchen und wäscht die auch einmal mit 1 ml QBSF-60 Stem Cell Medium um anhaftende Zellen zu sammeln.
17. Zentrifugation der Zellen bei 300 g für 10 min.
18. Die Zellen in 2 ml EM und Transfer zum 1 Well einer 12-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 ° C, 5% CO _2-Inkubator.

3. Plating transduzierten Zellen auf MEFs

TAG 11

1. Bestreichen Sie die Wells einer 6-Well-Platte mit 0,1% Gelatine und Platte inaktivierte embryonale Maus-Fibroblasten (MEF) bei 2x10 ⁵ Zellen / Well in MEF Medium (IMDM mit 10% FBS, 1% Non-Essential Amino Acids, 100 uM β- Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin, 100 ug / ml primocin oder 1% Pen / Strep). Bereiten 3 Wells pro Infektion.

TAG 12

2. Übertragen der Zellen an ein steriles 15 ml konischen Röhrchen und die gut waschen einmal mit 1 ml QBSF-60 Stem Cell Medium, um anhaftende Zellen zu sammeln.
3. Die Zellen in 3 ml Medium, das MEF 10 ng / ml bFGF und Ascorbinsäure und Wachstumsfaktoren in den gleichen Konzentrationen wie im EM genutzte Medium (50 ug / ml Ascorbinsäure, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml IL -3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml IGF-1, 1 uM Dexamethason).
4. Plate 1 ml der Zellen pro Well einer 6-Well-Platte mit MEFs. 1,5 ml Medium mit bFGF MEF, Ascorbinsäure, und Wachstumsfaktoren für insgesamt 2,5 ml Medium / Vertiefung.
5. Spin die Platte bei 500 UpM bei 25 ° C für 30 min. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C, 5% CO _2-Inkubator.

TAG 14

6. Feed-Zellen jeden zweiten Tag mit 2,5 ml MEF Medien mit 10 ng / ml bFGF und 50 ug / ml Ascorbinsäure (keine Wachstumsfaktoren). Absaugen und entsorgen schwimmenden Zellen mit jedem Feed.
7. Fügen Sie zusätzliche MEFs nach Bedarf (in der Regel einmal pro Woche).

p "> ~ DAY 20

8. Sobald kleine Kolonien erscheinen, Futtermittel-Zellen täglich mit 2 ml humanen embryonalen Stammzellen (hES) mittel (DMEM/F12 mit 20% Knockout Serum Replacement, 1% Non-Essential Amino Acids, 100 uM β-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin , 100 ug / ml primocin oder 1% Pen / Strep und 10 ng / ml bFGF).

4. Kommissionier-und Ausbau der iPSC Clones

~ DAY 30 bis 40

1. Wählen Sie jede Kolonie in einzelnen Vertiefungen einer 12-Well-Platte mit inaktivierten MEFs mit 1 ml / Well hESC Medium plus 10 uM Stemolecule Y27632 (ROCK-Inhibitor) voreingestellt ausgesät.
2. Führen Zellen danach täglich mit 1 ml hESC Medium nur (keine ROCK-Inhibitor).

5. Immunfluoreszenzfärbung für Pluripotenz Markers

1. Färbung erfolgte mit dem Kit "ES Cell Marker Sample Kit" von Millipore und nach dem Protokoll des Herstellers.

6. Exzision Integrated STEMCCA Vector

1. Excision der Reprogrammierung Kassette erreicht Verwendung eines Cre-IRES-Puro Expressionsvektor nach Transfektion und kurze Puromycin Selektion als ⁶ beschrieben.

Ergebnisse

Wir demonstrieren eine einfache und effektive Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs aus PBMCs unter Verwendung eines einzigen lentiviralen Vektor. 1A zeigt eine schematische Darstellung des Protokolls. Das Blut wird in einen BD Vacutainer CPT Zellpräparation Tube mit Natriumcitrat gesammelt, und nach Zentrifugation, mononukleären Zellen können von der Schnittstelle zwischen dem Polyester Gel und dem Plasma (buffy coat) (1B) gesammelt werden. Die isolierten PBMCs werde...

Diskussion

Wir beschreiben hier die Verwendung des STEMCCA Lentivirusvektor die menschliche IPSCs aus mononukleären Zellen von einigen ml frisch gesammelten peripheren Blut isoliert erzeugen. Das Protokoll kann auch verwendet werden, um gefrorene PBMCs (direkt aus dem Buffy-Coat) erhalten ein Detail erhebliche praktische Auswirkungen umzuprogrammieren bei der Nutzung Spenderzellen von einem entfernten Standort erworben werden. Vor der Induktion von Umprogrammierung muss isolierten PBMCs durchlaufen eine kritische Expansionsstufe,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube mit Natriumcitrat	BD Biosciences	362760
QBSF-60 Stem Cell Medium	Quality Biological	160-204-101
IMDM	Invitrogen	12440
DMEM/F12	Invitrogen	11330
FBS	Atlanta Biologicals	S10250
Knockout Serum Replacement	Invitrogen	10828
Primocin	Invivogen	ant-pm-2
Pen / Strep	Invitrogen	15140
L-Glutamin	Invitrogen	25030
Non-Essential Amino Acids	Invitrogen	11140
β-Mercaptoethanol	MP Biomedicals	190242
Ascorbinsäure	Sigma	A4544
IGF-1	R & D Systems	291-G1
IL-3	R & D Systems	203-IL
SCF	R & D Systems	255-SC
EPO	R & D Systems	286-EP
Dexamethasone	Sigma	D4902
Polybrene	Sigma	H-9268
bFGF	R & D Systems	233-FB
Stemolecule Y27632	Stemgent	04-0012
ES Cell Marker Sample Kit	Millipore	SCR002