Génération de l'homme cellules souches pluripotentes induites à partir de sang périphérique en utilisant le vecteur lentiviral STEMCCA

Résumé

Ici, nous montrons un protocole simple et efficace pour la génération de l'homme iPSCs de 3-4 ml de sang périphérique en utilisant un vecteur lentiviral unique reprogrammation. La reprogrammation des cellules sanguines facilement disponibles promet d'accélérer l'utilisation des technologies de l'iPSC en la rendant accessible à une communauté plus large de la recherche.

Résumé

Grâce à l'expression ectopique de quatre facteurs de transcription, Oct4, Klf4, Sox2 et cMyc, des cellules somatiques humaines peuvent être convertis en un état ​​pluripotent, générant des dites cellules souches pluripotentes induites (CISP) ^1-4. Spécifiques au patient iPSCs n'ont pas les préoccupations éthiques qui entourent les cellules souches embryonnaires (CSE) et permettrait de contourner possible rejet immunitaire. Ainsi, iPSCs ont attiré une attention considérable pour les études de modélisation des maladies, le dépistage de composés pharmacologiques et les thérapies régénératives ^5.

Nous avons montré la génération de transgène sans iPSCs humains de patients atteints de maladies pulmonaires différents en utilisant un seul soumis à l'accise polycistronique lentiviral cassette de cellules souches (STEMCCA) codant pour les facteurs de Yamanaka ^6. Ces lignes iPSC ont été générés par des fibroblastes de peau, le type cellulaire le plus couramment utilisé pour la reprogrammation. Normalement, l'obtention de fibroblastes nécessite une biopsie cutanée suivie d'une expansion de la cellules dans la culture de quelques passages. Surtout, un certain nombre de groupes ont rapporté la reprogrammation des cellules du sang périphérique en iPSCs ^7-9. Dans une étude, une version inductible Tet du vecteur a été utilisé STEMCCA ^9, qui exigeait que les globules d'être infectés simultanément par un lentivirus codant pour la forme constitutivement active inverse tétracycline transactivateur. En revanche pour les fibroblastes, les cellules sanguines périphériques peuvent être collectées via des procédures minimalement invasives, ce qui réduit considérablement l'inconfort et la détresse du patient. Un protocole simple et efficace pour la reprogrammation des cellules sanguines utilisant un vecteur unique constitutive soumis à l'accise peuvent accélérer l'application des technologies de l'iPSC en la rendant accessible à une communauté plus large de la recherche. En outre, une reprogrammation de cellules du sang périphérique permet de générer des iPSCs de personnes dans laquelle des biopsies de peau doit être évité (par exemple. Aberrante cicatrices) ou en raison de pathologies préexistantes preventiaccès ng de biopsies.

Ici nous démontrons un protocole pour la génération de iPSCs l'homme à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) en utilisant une seule floxé-soumis à l'accise vecteur lentiviral exprimant de manière constitutive les 4 facteurs. PBMC fraîchement récoltées ou décongelés sont développées pendant 9 jours, comme décrit dans l'acide ascorbique ^10,11 milieu contenant, SCF, IGF-1, IL-3 et de l'EPO avant d'être transduites avec le lentivirus STEMCCA. Les cellules sont ensuite étalées sur des MEF et de l'ESC-comme les colonies peuvent être visualisés de deux semaines après l'infection. Enfin, les clones sélectionnés sont développés et testés pour l'expression des marqueurs de la pluripotence SSEA-4, Tra-1-60 et Tra-1-81. Ce protocole est simple, robuste et très logique, en fournissant une méthodologie fiable pour la génération de l'homme iPSCs facilement accessible à partir de 4 ml de sang.

Protocole

1. L'isolement et l'expansion des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC)

JOUR 0

1. Dessin 4 ml de sang périphérique dans un tube BD Vacutainer CPT Préparation des cellules avec du citrate de sodium. Inverser le tube 8 à 10 fois et centrifuger à 1800 xg pendant 30 min à température ambiante. Idéalement, cette étape doit être effectuée dans les 2 heures de la collecte.
2. Recueillir les cellules mononucléaires (MC) à la pipette la couche leuco-plaquettaire (couche de cellules entre la barrière de gel et plasma) dans un tube de 15 centrifugation stérile ml conique. Amener le volume total de 10 ml avec stérile saline tamponnée au phosphate (PBS), inverser plusieurs fois et centrifuger à 300 xg pendant 15 min.
3. Reprendre les cellules dans 10 ml de PBS stérile et effectuer le nombre de cellules. Transfert 1 à 2x10 ⁶ cellules dans un tube de 15 ml stérile conique à centrifugation et centrifuger à 300 xg pendant 10 min.
4. Reprendre les cellules dans 2 ml de milieu d'expansion (EM) (QBSF-60 moyen de cellules souches contenant 50 pg / ml AscoAcide RBIC, 50 ng / ml EFC, 10 ng / ml d'IL-3, 2 U / ml OEB, 40 ng / ml d'IGF-1, 1 uM de dexaméthasone et 100 pg / ml ou 1% primocin Pen / Strep) et transfert à l' un puits d'une plaque 12-puits. Incuber les cellules dans un 37 ° C, 5% CO ₂ incubateur.
5. Centrifuger les cellules restantes à 300 x g pendant 10 min et gel ~ 2x10 ⁶ cellules / flacon dans FBS contenant 10% de DMSO.
6. Pour commencer le protocole en utilisant des PBMC congelés, décongeler 1 flacon de cellules dans 10 ml de milieu QBSF et centrifuger à 300 xg pendant 10 min. Reprendre les cellules dans 2 ml d'EM et de transférer à un puits d'une plaque de 12 puits. Incuber les cellules dans un 37 ° C, 5% CO ₂ incubateur.

JOUR 3 JOUR 6 et

17. Transférer les cellules à une stérile 15 ml tube conique et laver le bien une fois avec 1 ml de QBSF-60 moyen de cellules souches pour recueillir des cellules adhérentes.
18. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 10 min.
19. Reprendre les cellules dans 2 ml d'EM et de transférer à un bien d'un 12Plaque à puits. Incuber les cellules dans un 37 ° C, 5% CO ₂ incubateur.

2. Transduction des PBMC par STEMCCA Lentivirus

JOUR 9

1. Transférer les cellules à une stérile 15 ml tube conique et laver le bien une fois avec 1 ml de QBSF-60 moyen de cellules souches pour recueillir des cellules adhérentes.
2. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 10 min.
3. Reprendre les cellules dans 1 ml de EM frais contenant 5 ug / ml de polybrène et STEMCCA lentivirus (MOI = 1 à 10) et le transfert à un puits d'une plaque de 12 puits. (Le protocole décrivant la production de particules lentivirales peut être trouvé à http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/ )
4. Faites tourner la plaque à 2.250 tours par minute à 25 ° C pendant 90 min.
5. Après essorage, ajoutez un supplément de 1 ml de EM frais contenant 5 ug / ml de polybrène pour un total de 2 ml de milieu et incuber la plaque à 37 ° C,5% de CO ₂ incubateur.

JOUR 10

16. Transférer les cellules à une stérile 15 ml tube conique et laver le bien une fois avec 1 ml de QBSF-60 moyen de cellules souches pour recueillir des cellules adhérentes.
17. Centrifuger les cellules à 300 xg pendant 10 min.
18. Reprendre les cellules dans 2 ml de EM et de transférer à 1 puits d'une plaque de 12 puits. Incuber les cellules dans un 37 ° C, 5% CO ₂ incubateur.

3. Placage cellules transduites sur les MEF

JOUR 11

1. Enduire les puits d'une plaque à 6 puits avec 0,1% de gélatine et de fibroblastes de souris inactivées plaque embryonnaires (MEF) à 2x10 ⁵ cellules / puits dans du milieu MEF (IMDM contenant 10% de FBS, 1% non-acides aminés essentiels, 100 uM β- mercaptoéthanol, 2 mM de L-glutamine, 100 pg / ml ou 1% primocin Pen / Strep). Préparer 3 puits par l'infection.

JOUR 12

2. Transférer les cellules à une stérile 15 ml tube conique et lavez-le bien une fois avec 1 ml de QBSF-60 moyen de cellules souches pour recueillir des cellules adhérentes.
3. Remettre en suspension les cellules dans 3 ml de milieu contenant MEF 10 ng / ml de bFGF, et l'acide ascorbique et de facteurs de croissance à des concentrations identiques à ceux utilisés dans les EM moyenne (50 Acide ascorbique pg / ml, 50 ng / ml EFC, 10 ng / ml d'IL -3, 2 U / ml OEB, 40 ng / ml d'IGF-1, 1 uM de dexaméthasone).
4. Plaque 1 ml de cellules par puits d'une plaque à 6 puits contenant MEF. Ajouter 1,5 ml de bFGF MEF médias, acide ascorbique, et des facteurs de croissance, pour un total de 2,5 ml de milieu / puits.
5. Faites tourner la plaque à 500 rpm à 25 ° C pendant 30 min. Incuber la plaque à 37 ° C, 5% de CO ₂ incubateur.

JOUR 14

6. Cellules d'alimentation tous les deux jours avec 2,5 ml de milieu contenant du MEF 10 ng / ml de bFGF et 50 Acide ascorbique pg / ml (pas de facteurs de croissance). Aspirer et jeter les cellules flottantes avec chaque repas.
7. Ajouter MEF supplémentaire si nécessaire (généralement une fois par semaine).

p "> ~ JOUR 20

8. Une fois de petites colonies apparaissent, les cellules d'alimentation quotidienne avec 2 ml de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) moyen (DMEM/F12 remplacement contenant 20% de sérum Knockout, 1% non-acides aminés essentiels, 100 uM β-mercaptoéthanol, 2 mM de L-glutamine , 100 pg / ml ou 1% primocin Pen / Strep et 10 ng / ml de bFGF).

4. La cueillette et l'expansion de clones iPSC

~ JOUR 30 à 40

1. Choisissez chaque colonie dans les puits individuels d'une plaque de 12 puits pré-ensemencé avec inactivé MEF contenant 1 ml / puits de milieu de CSEh plus 10 uM de Stemolecule Y27632 (ROCK inhibiteur).
2. Nourrir les cellules quotidiennement par la suite avec 1 ml de milieu de CSEh uniquement (pas d'inhibiteur de ROCK).

5. La coloration par immunofluorescence pour les marqueurs de pluripotence

1. La coloration a été réalisée en utilisant le kit «Cell ES Exemple de marqueur Kit" de Millipore et suivant le protocole du fabricant.

6. Excision de Integnominale STEMCCA Vecteur

1. Excision de reprogrammation cassette est réalisé en utilisant une transfection Cre-IRES-Puro vecteur exprimant la suite et la sélection puromycine brève comme décrit ^6.

Résultats

Nous démontrons un protocole simple et efficace pour la génération de l'homme iPSCs de PBMC en utilisant un vecteur lentiviral unique. Figure 1A montre une représentation schématique du protocole. Le sang est recueilli dans des tubes BD Vacutainer CPT Préparation des cellules avec du citrate de sodium, et, après centrifugation, les cellules mononucléaires peuvent être collectées à partir de l'interface entre le gel de polyester et le plasma (buffy coat) (figure 1B). L...

Discussion

Nous décrivons ici l'utilisation du vecteur lentiviral STEMCCA de générer iPSCs humains à partir de cellules mononucléées isolées de quelques millilitres de sang périphérique fraîchement prélevé. Le protocole peut également être utilisé pour reprogrammer PBMC congelés (obtenu directement à partir de la couche leuco-plaquettaire), un détail d'importantes implications pratiques lors de l'utilisation des cellules du donneur acquises à partir d'un emplacement distant. Avant l'induction...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
BD Vacutainer CPT Tube Préparation des cellules avec du citrate de sodium	BD Biosciences	362760
QBSF-60 moyen de cellules souches	Qualité biologique	160-204-101
IMDM	Invitrogen	12440
DMEM/F12	Invitrogen	11330
FBS	Atlanta Biologicals	S10250
Remplacement Knockout Sérum	Invitrogen	10828
Primocin	Invivogen	ant-h-2
Pen / Strep	Invitrogen	15140
L-Glutamine	Invitrogen	25030
Non-acides aminés essentiels	Invitrogen	11140
β-mercaptoéthanol	MP Biomédical	190242
Acide ascorbique	Sigma	A4544
IGF-1	R & D Systems	291-G1
IL-3	R & D Systems	203-IL
EFC	R & D Systems	255-SC
OEB	R & D Systems	286-EP
Dexaméthasone	Sigma	D4902
Polybrène	Sigma	H-9268
bFGF	R & D Systems	233-FB
Stemolecule Y27632	Stemgent	04-0012
Cellule ES Sample Kit Marker	Millipore	SCR002