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Method Article
Ici, nous montrons un protocole simple et efficace pour la génération de l'homme iPSCs de 3-4 ml de sang périphérique en utilisant un vecteur lentiviral unique reprogrammation. La reprogrammation des cellules sanguines facilement disponibles promet d'accélérer l'utilisation des technologies de l'iPSC en la rendant accessible à une communauté plus large de la recherche.
Grâce à l'expression ectopique de quatre facteurs de transcription, Oct4, Klf4, Sox2 et cMyc, des cellules somatiques humaines peuvent être convertis en un état pluripotent, générant des dites cellules souches pluripotentes induites (CISP) 1-4. Spécifiques au patient iPSCs n'ont pas les préoccupations éthiques qui entourent les cellules souches embryonnaires (CSE) et permettrait de contourner possible rejet immunitaire. Ainsi, iPSCs ont attiré une attention considérable pour les études de modélisation des maladies, le dépistage de composés pharmacologiques et les thérapies régénératives 5.
Nous avons montré la génération de transgène sans iPSCs humains de patients atteints de maladies pulmonaires différents en utilisant un seul soumis à l'accise polycistronique lentiviral cassette de cellules souches (STEMCCA) codant pour les facteurs de Yamanaka 6. Ces lignes iPSC ont été générés par des fibroblastes de peau, le type cellulaire le plus couramment utilisé pour la reprogrammation. Normalement, l'obtention de fibroblastes nécessite une biopsie cutanée suivie d'une expansion de la cellules dans la culture de quelques passages. Surtout, un certain nombre de groupes ont rapporté la reprogrammation des cellules du sang périphérique en iPSCs 7-9. Dans une étude, une version inductible Tet du vecteur a été utilisé STEMCCA 9, qui exigeait que les globules d'être infectés simultanément par un lentivirus codant pour la forme constitutivement active inverse tétracycline transactivateur. En revanche pour les fibroblastes, les cellules sanguines périphériques peuvent être collectées via des procédures minimalement invasives, ce qui réduit considérablement l'inconfort et la détresse du patient. Un protocole simple et efficace pour la reprogrammation des cellules sanguines utilisant un vecteur unique constitutive soumis à l'accise peuvent accélérer l'application des technologies de l'iPSC en la rendant accessible à une communauté plus large de la recherche. En outre, une reprogrammation de cellules du sang périphérique permet de générer des iPSCs de personnes dans laquelle des biopsies de peau doit être évité (par exemple. Aberrante cicatrices) ou en raison de pathologies préexistantes preventiaccès ng de biopsies.
Ici nous démontrons un protocole pour la génération de iPSCs l'homme à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) en utilisant une seule floxé-soumis à l'accise vecteur lentiviral exprimant de manière constitutive les 4 facteurs. PBMC fraîchement récoltées ou décongelés sont développées pendant 9 jours, comme décrit dans l'acide ascorbique 10,11 milieu contenant, SCF, IGF-1, IL-3 et de l'EPO avant d'être transduites avec le lentivirus STEMCCA. Les cellules sont ensuite étalées sur des MEF et de l'ESC-comme les colonies peuvent être visualisés de deux semaines après l'infection. Enfin, les clones sélectionnés sont développés et testés pour l'expression des marqueurs de la pluripotence SSEA-4, Tra-1-60 et Tra-1-81. Ce protocole est simple, robuste et très logique, en fournissant une méthodologie fiable pour la génération de l'homme iPSCs facilement accessible à partir de 4 ml de sang.
1. L'isolement et l'expansion des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC)
JOUR 0
JOUR 3 JOUR 6 et
2. Transduction des PBMC par STEMCCA Lentivirus
JOUR 9
JOUR 10
3. Placage cellules transduites sur les MEF
JOUR 11
JOUR 12
JOUR 14
4. La cueillette et l'expansion de clones iPSC
~ JOUR 30 à 40
5. La coloration par immunofluorescence pour les marqueurs de pluripotence
6. Excision de Integnominale STEMCCA Vecteur
Nous démontrons un protocole simple et efficace pour la génération de l'homme iPSCs de PBMC en utilisant un vecteur lentiviral unique. Figure 1A montre une représentation schématique du protocole. Le sang est recueilli dans des tubes BD Vacutainer CPT Préparation des cellules avec du citrate de sodium, et, après centrifugation, les cellules mononucléaires peuvent être collectées à partir de l'interface entre le gel de polyester et le plasma (buffy coat) (figure 1B). L...
Nous décrivons ici l'utilisation du vecteur lentiviral STEMCCA de générer iPSCs humains à partir de cellules mononucléées isolées de quelques millilitres de sang périphérique fraîchement prélevé. Le protocole peut également être utilisé pour reprogrammer PBMC congelés (obtenu directement à partir de la couche leuco-plaquettaire), un détail d'importantes implications pratiques lors de l'utilisation des cellules du donneur acquises à partir d'un emplacement distant. Avant l'induction...
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Ces études ont été financées en partie par le NIH UO1HL107443-01 prix de GJM et GM.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires (optionnel) |
BD Vacutainer CPT Tube Préparation des cellules avec du citrate de sodium | BD Biosciences | 362760 | |
QBSF-60 moyen de cellules souches | Qualité biologique | 160-204-101 | |
IMDM | Invitrogen | 12440 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
FBS | Atlanta Biologicals | S10250 | |
Remplacement Knockout Sérum | Invitrogen | 10828 | |
Primocin | Invivogen | ant-h-2 | |
Pen / Strep | Invitrogen | 15140 | |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
Non-acides aminés essentiels | Invitrogen | 11140 | |
β-mercaptoéthanol | MP Biomédical | 190242 | |
Acide ascorbique | Sigma | A4544 | |
IGF-1 | R & D Systems | 291-G1 | |
IL-3 | R & D Systems | 203-IL | |
EFC | R & D Systems | 255-SC | |
OEB | R & D Systems | 286-EP | |
Dexaméthasone | Sigma | D4902 | |
Polybrène | Sigma | H-9268 | |
bFGF | R & D Systems | 233-FB | |
Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
Cellule ES Sample Kit Marker | Millipore | SCR002 |
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