דור של תאים אנושיים מושרים pluripotent גזע מדם היקפי באמצעות STEMCCA lentiviral הווקטור

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הדור של iPSCs אדם ממ"ל של 3-4 דם היקפי באמצעות וקטור תכנות מחדש lentiviral אחת. תכנות מחדש של תאי דם זמינים ונגישים מבטיח להאיץ את הניצול של טכנולוגית iPSC ידי ההפיכה לנגישה לקהילת מחקר רחבה יותר.

Abstract

דרך ביטוי אקטופי של ארבעה גורמי שעתוק, Oct4, Klf4, Sox2 וcMyc, תאים אנושיים סומטיים ניתן להמיר למדינת pluripotent, יצירת תאים שנקראים מושרים pluripotent גזע (iPSCs) ^1-4. iPSCs מטופל ספציפי חסר הדאגות המוסריות האופפות תאי גזע עובריים (ESCs) ויעקפו דחייה חיסונית אפשרית. לפיכך, iPSCs שמשך תשומת לב רבה ללימודי מחל דוגמנות, ההקרנה של תרכובות תרופתיות, טיפולי משובים ^5.

הראנו הדור של iPSCs האדם transgene חינם מחולים עם מחלות ריאה שונות באמצעות קלטת אחת excisable polycistronic lentiviral תאי גזע (STEMCCA) קידוד יאמאנאקה גורמי ^6. קווי iPSC אלה נוצרו מfibroblasts עור, סוג התא הנפוץ ביותר המשמש לתכנות מחדש. בדרך כלל, קבלת fibroblasts דורשת עור ביופסיה ואחרי ההתרחבות של התאזה בתרבות לכמה קטעים. חשוב מכך, מספר הקבוצות דיווח תכנות מחדש של תאי דם היקפי אדם לiPSCs ^7-9. במחקר אחד, גרסה מושרה ט של וקטור STEMCCA הועסקה ^9, שנדרשת תאי הדם להידבק בו זמנית עם lentivirus constitutively פעיל קידוד טטרציקלין transactivator ההפוך. בניגוד לפיברובלסטים, תאי דם היקפיים ניתן לאסוף באמצעות נהלים פולשנית, צמצום אי הנוחות ומצוקתו של החולה באופן משמעותי. פרוטוקול פשוט ויעיל לתכנות מחדש של תאי דם באמצעות וקטור excisable אחת מכונן עשוי להאיץ את היישום של טכנולוגית iPSC על ידי שהופך אותו נגיש לקהילת מחקר רחבה יותר. יתר על כן, תכנות מחדש של תאי דם היקפיים מאפשר לדור של iPSCs מאנשים שביש להימנע מהם ביופסיות עור (כלומר. חריג הצטלקות) או עקב תנאי מחלה קיים preventiגישת ננוגרם לביופסיות אגרוף.

כאן אנו מדגימים פרוטוקול עבור הדור של iPSCs אדם מתאי דם היקפיים (mononuclear PBMCs) באמצעות וקטור lentiviral floxed-excisable אחת constitutively להביע 4 הגורמים. PBMCs נאסף טרי או מופשר הם התרחבו במשך 9 ימים כפי שתוארו ^10,11 בחומצה אסקורבית המכילה בינונית, SCF, IGF-1, IL-3 ו-EPO לפני שtransduced עם lentivirus STEMCCA. תאים אז מצופים על MEFs ומושבות ESC דמויים יכולות להיות דמיינו שבועות לאחר הדבקה. לבסוף, שיבוטים נבחרו הורחבו ונבדקו לביטוי של סמני pluripotency SSEA-4, טרה-1-60 וטרה-1-81. פרוטוקול זה הוא פשוט, הגיוני ועקבי ביותר, ומספק מתודולוגיה אמינה לדור של iPSCs אדם מ4 מ"ל נגיש של דם.

Protocol

1. בידוד והרחבת תאי mononuclear דם היקפיים (PBMCs)

יום 0

1. צייר 4 מ"ל של דם היקפי לתוך צינור BD Vacutainer CPT תא הכנה עם ציטרט הנתרן. הפכו צינור 8-10 פעמים וסרכזת ב1800 XG למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר. באופן אידיאלי, בשלב זה צריך להיעשות תוך 2 שעות של אוסף.
2. איסוף תאי mononuclear (MCS) על ידי pipetting המעייל באפים (שכבת תאים בין הקריש חוסם ופלזמה) לתוך צינור סטרילי 15 מיליליטר חרוטי צנטריפוגה. הבא נפח כולל עד 10 מ"ל עם תמיסת מלח סטרילית פוספט שנאגר-(PBS), היפוך כמה פעמים וצנטריפוגות XG ב 300 במשך 15 דקות.
3. Resuspend התאים ב10 מ"ל של PBS סטרילי ולבצע ספירת תאים. העברת 1 עד ⁶ 2x10 תאים לתוך צינור סטרילי 15 מיליליטר חרוטי צנטריפוגה וצנטריפוגה XG ב 300 למשך 10 דקות.
4. Resuspend התאים ב2 מ"ל של מדיום הרחבה (EM) (QBSF-60 בינוני תאי גזע המכיל 50 מיקרוגרם / המ"ל Ascoחומצת rbic, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml IL-3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml IGF-1, דקסאמתאזון 1 מיקרומטר ו 100 מיקרוגרם / המ"ל primocin או 1% עט / דלקת) ולהעביר ל אחד טוב של 12-צלחת היטב. דגירת התאים ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ חממה.
5. צנטריפוגה תאים שנותרו בגודל 300 x גרמתי למשך 10 דקות והקפאה ~ 2x10 ⁶ תאים / בקבוקון המכיל בFBS DMSO 10%.
6. כדי להפעיל את הפרוטוקול באמצעות PBMCs קפוא, להפשיר בקבוקון 1 של תאים לתוך 10 מ"ל של מדיום וצנטריפוגה QBSF ב 300 XG למשך 10 דקות. Resuspend התאים ב2 מ"ל של א"מ וגם להעביר לאחד מצלחת 12-כן. דגירת התאים ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ חממה.

יום 3 ויום 6

17. להעביר את התאים לצינור סטרילי 15 מיליליטר חרוטים ולשטוף היטב פעם אחת עם 1 מ"ל של מדיום QBSF-60 לתאי גזע לאיסוף תאי חסיד.
18. צנטריפוגה התאים XG ב 300 למשך 10 דקות.
19. Resuspend התאים ב2 מ"ל של EM ולהעביר לאחד טוב של 12היטב צלחת. דגירת התאים ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ חממה.

2. תמרה של PBMCs עם STEMCCA lentivirus

יום 9

1. להעביר את התאים לצינור סטרילי 15 מיליליטר חרוטים ולשטוף היטב פעם אחת עם 1 מ"ל של מדיום QBSF-60 לתאי גזע לאיסוף תאי חסיד.
2. צנטריפוגה התאים XG ב 300 למשך 10 דקות.
3. Resuspend התאים ב1 מ"ל של EM טרי המכיל 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של polybrene וSTEMCCA lentivirus (משרד פנים = 1 עד 10) והעברה לטיפוס אחד מוכר היטב של צלחת 12-כן. (הפרוטוקול המתאר ייצור של חלקיקי lentiviral ניתן למצוא בhttp://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/)
4. ספין הצלחת ב2250 סל"ד ב 25 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות.
5. אחרי ספין, הוסף מ"ל נוסף של 1 EM הטרי המכיל 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של polybrene עבור סכום כולל של 2 מ"ל של מדיום ודגירה את הצלחת ב37 מעלות צלזיוס,5% CO ₂ חממה.

יום 10

16. להעביר את התאים לצינור סטרילי 15 מיליליטר חרוטים ולשטוף היטב פעם אחת עם 1 מ"ל של מדיום QBSF-60 לתאי גזע לאיסוף תאי חסיד.
17. צנטריפוגה התאים XG ב 300 למשך 10 דקות.
18. Resuspend התאים ב2 מ"ל של א"מ וגם להעביר ל1 מתוך צלחת 12-כן. דגירת התאים ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ חממה.

3. ציפוי transduced תאים על MEFs

יום 11

1. מעייל הבארות של צלחת 6-fibroblasts היטב עם הצלחת המומת עכבר העוברי (MEFs) 0.1% וג'לטין ב2x10 ⁵ תאים / היטב במדיום MEF (IMDM המכיל, מיקרומטר 100 β-10% FBS, 1% חומצות ללא אמינו חיוניים mercaptoethanol, 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 מיקרוגרם / המ"ל primocin או 1% עט / דלקת). הכן 3 בארות לזיהום.

יום 12

2. להעביר את התאים לצינור סטרילי 15 מיליליטר חרוטים ולשטוף היטב פעם אחת עם 1 מ"ל של מדיום QBSF-60 לתאי גזע לאיסוף תאי חסיד.
3. Resuspend התאים ב3 מ"ל של מדיום MEF המכיל 10 ng / ml bFGF, וחומצה אסקורבית וגורמי גדילה באותם ריכוזים כמו בשימוש במדיום EM (חומצת 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​אסקורבית, 50 ng / ml SCF, 10 ng / ml IL -3, 2 U / ml EPO, 40 ng / ml IGF-1, 1 מיקרומטר דקסאמתאזון).
4. מיליליטר צלחת 1 מתוך תאים להיטב של צלחת 6-גם מכילה MEFs. הוסף 1.5 מ"ל של תקשורת עם MEF bFGF, חומצה אסקורבית, וגורמי גדילה בהיקף כולל של 2.5 מ"ל של תקשורת / כן.
5. ספין הצלחת ב 500 סל"ד ב 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. דגירה את הצלחת ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ חממה.

14 יום

6. תאי הזנה בכל יום אחר עם 2.5 מ"ל של תקשורת המכילה MEF 10 ng / ml bFGF וחומצה 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​אסקורבית (אין גורמי צמיחה). לשאוב ולסלק תאים צפים לכל עדכון.
7. הוסף MEFs נוסף לפי הצורך (בדרך כלל פעם בשבוע).

p "> ~ 20 יום

8. ברגע מושבות קטנות מופיעות, תאי הזנה יומיומית עם 2 מ"ל של מדיום (DMEM/F12 20% החלפה מכילה נוק סרום, חומצות אמינו לא חיוניות 1%, 100 β-mercaptoethanol מיקרומטר, 2 מ"מ L-גלוטמין בתאי גזע עובריים האנושיים (hESC) , 100 מיקרוגרם / המ"ל primocin או 1% עט / דלקת ו10 ng / ml bFGF).

4. קטיף והרחבה משובטים iPSC

~ יום 30-40

1. פיק כל מושבה בבארות בודדות של צלחת 12-היטב מראש seeded-עם MEFs מומת המכיל 1 מ"ל / היטב של מדיום hESC תוספת של 10 מיקרומטר של Stemolecule Y27632 (ROCK מעכב).
2. להאכיל את התאים יומיים לאחר מכן עם 1 מ"ל של מדיום hESC בלבד (ללא מעכב ROCK).

5. כתמי immunofluorescence לסמני pluripotency

1. צביעה בוצעה באמצעות "קיט ES Cell מרקר לדוגמה" ערכה מMillipore ובעקבות הפרוטוקול של היצרן.

6. כריתת integמדורג STEMCCA וקטור

1. כריתה של תכנות מחדש של קלטת מושגת ניצול transfection Cre-ires-Puro להביע וקטור הבא ובחירת Puromycin קצרה כמתואר ^6.

תוצאות

אנחנו מדגימים פרוטוקול פשוט ויעיל עבור הדור של iPSCs אדם מPBMCs באמצעות וקטור lentiviral אחת. איור 1 א מציג ייצוג סכמטי של הפרוטוקול. הדם נאסף לתוך צינור BD Vacutainer CPT תא הכנה עם ציטרט הנתרן, ולאחר צנטריפוגה, תאי mononuclear ניתן לאסוף מהממשק בין ג'ל פוליאסטר והפלזמה (אפי מעייל...

Discussion

אנחנו להלן מתארים את השימוש של וקטור lentiviral STEMCCA לייצר iPSCs אדם מתאי mononuclear בודד מכמה מיליליטרים של דם היקפי נאסף טרי. פרוטוקול יכול לשמש גם לתכנת מחדש PBMCs הקפוא (מתקבל ישירות מהמעייל באפים), פירוט של השלכות מעשיות משמעותיות כאשר ניצול תאי תורם נרכשו ממיקום מרוחק. לפני הג?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות (אופציונלי)
Tube BD Vacutainer CPT תא הכנה עם ציטרט הנתרן	BD Biosciences	362760
QBSF-60 בינוני תאי גזע	איכות ביולוגית	160-204-101
IMDM	Invitrogen	12440
DMEM/F12	Invitrogen	11330
FBS	אטלנטה ביולוגית	S10250
החלפת נוק סרום	Invitrogen	10828
Primocin	Invivogen	נמלי pm-2
עט / דלקת	Invitrogen	15140
L-גלוטמין	Invitrogen	25030
חומצות אמינו לא חיוניות	Invitrogen	11140
β-mercaptoethanol	Biomedicals MP	190242
חומצה אסקורבית	סיגמא	A4544
IGF-1	מו"פ מערכות	291-G1
IL-3	מו"פ מערכות	203-IL
SCF	מו"פ מערכות	255-SC
EPO	מו"פ מערכות	286-EP
דקסאמתאזון	סיגמא	D4902
Polybrene	סיגמא	H-9268
bFGF	מו"פ מערכות	233-FB
Stemolecule Y27632	Stemgent	04-0012
קיט לדוגמא מרקר תאי גזע עוברי	Millipore	SCR002