STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

요약

여기 하나의 lentiviral 재활 벡터를 사용하여 말초 혈 3-4 ML에서 인간 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 보여줍니다. 즉시 사용할 수 혈액 세포의 재 프로그래밍하면 폭 넓은 연구 공동체에 액세스하여 iPSC 기술의 활용을 촉진 것을 약속드립니다.

초록

네 전사 인자, Oct4, Klf4의 이소성 표현을 통해 Sox2와 cMyc는 인간의 체세포의 세포는 소위 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs) ^1-4 발생 만능 상태로 변환 할 수 있습니다. 환자 별 iPSCs는 배아 줄기 세포 (ESCs)를 둘러싸고 가능한 면역 거부를 무시할 것이다 윤리적 문제를 부족합니다. 따라서, iPSCs는 질병 모델링 연구, 약리 화합물의 심사 및 재생 치료 ^5에 대한 상당한 주목을 받고있다.

우리는 야마나카의 요인 ⁶ 인코딩 한 excisable polycistronic lentiviral의 줄기 세포 카세트 (STEMCCA)를 사용하여 서로 다른 폐 질환 환자에서 transgene 무료 인간 iPSCs의 생성을 보여 주었다. 이 iPSC 라인은 피부 섬유 아세포, 재 프로그램에 사용되는 가장 일반적인 세​​포 유형에서 생성되었습니다. 일반적으로 섬유 아세포를 취득하면 세포의 확장에 의한 펀치 생검은 다음 피부가 필요합니다몇 구절에 대한 문화에 s입니다. 중요한 것은 그룹의 수는 iPSCs ^7-9으로 인간의 말초 혈액 세포의 재 프로그래밍을보고했습니다. 한 연구에서, STEMCCA 벡터의 Tet의 inducible 버전은 혈액 세포가 동시에 반대 테트라 사이클린 transactivator 인코딩 constitutively 활성화 lentivirus에 감염 될 필요하는 ⁹ 고용되었다. 섬유 아세포는 대조적으로, 말초 혈 세포는 크게 환자의 불편 함과 고통을 감소 최소한 침략 절차를 통해 수령하실 수 있습니다. 제정 한 excisable 벡터를 사용하여 혈액 세포를 재 프로그램에 대한 간단하고 효과적인 프로토콜은 광범위한 연구 공동체에 액세스하여 iPSC 기술의 응용을 촉진 할 수 있습니다. 또한, 주변 혈액 세포의 재 프로그래밍 피부 biopsies을 피할 수 (예. 탈선은 흉터) 또는 인해 기존의 질병 상태 preventi에해야하는 개인의 iPSCs의 생성을 허용펀치 biopsies에 NG 액세스 할 수 있습니다.

여기 constitutively 4 요소를 표현하는 하나의 floxed - excisable lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈 mononuclear 세포 (PBMCs)에서 인간 iPSCs의 생성을위한 프로토콜을 보여줍니다. 갓 수집하거나 해동 PBMCs은 STEMCCA의 lentivirus와 transduced되기 전에 같은 매체를 포함하는 아스코르브 산에 ^{10,11 설명} 구일, SCF, IGF-1, IL-3와 EPO에 대해 확장됩니다. 셀은 다음 MEFs에 도금되어 있으며 ESC와 같은 식민지 두 주 감염 후 시각화 할 수 있습니다. 마지막으로, 선택한 클론을 확장하고 pluripotency 마커 SSEA-4, Tra-1-60 Tra-1-81 표현으로 테스트됩니다. 이 프로토콜은 혈액의 쉽게 접근 할 4 ML에서 인간 iPSCs의 생성을위한 신뢰할 수있는 방법론을 제공, 간단한 튼튼하고 매우 일치합니다.

프로토콜

1. 말초 혈 Mononuclear 세포 (PBMCs)의 절연 및 확장

DAY 0

1. 나트륨 시트르산과 BD Vacutainer CPT 셀 준비 튜브에 말초 혈 4 ML을 그립니다. 관에게 8-10 번 반전하고 실온에서 30 분에 1,800 XG에 원심 분리기. 이상적으로,이 단계는 컬렉션의 2 시간 이내에 완료해야합니다.
2. 멸균 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브에 버피 코트 (겔 장벽과 플라즈마 사이의 세포 층)을 pipetting하여 mononuclear 세포 (MCS)를 수집합니다. 15 분 300 XG에 여러 시간과 원심 분리기 반전, 멸균 인산 버퍼 생리 (PBS)로 10 ML에 총 볼륨을 가져와.
3. 멸균 PBS의 10 ML에있는 세포를 Resuspend과 셀 카운트를 수행합니다. 10 분 300 XG에서 멸균 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브와 원심 분리기로 1 2x10 ⁶ 세포를 전송합니다.
4. 확장 매체 2 ML (EM) (에서 세포를 Resuspend 50 μg / ML Asco을 포함 QBSF-60 줄기 세포 중rbic 산성, 50 NG / ML SCF, 10 NG / ML IL-3, 2 U / ML EPO는 40 NG / ML IGF-1, 1 μM의 Dexamethasone 및 100 μg / ML primocin 또는 1 %의 펜 / 패 혈성)과에 이전 일 잘 12 잘 접시의. 5% CO ₂ 인큐베이터, 37 ° C에서 세포를 배양.
5. 300 x에 남아있는 세포를 원심 분리기 10 % DMSO를 포함하는 FBS에서 10 분, 동결 ~ 2x10 ⁶ 셀 / 유리 병에 g.
6. 냉동 PBMCs를 사용하여 프로토콜을 시작하려면 10 분 300 XG에 QBSF 매체와 원심 분리기 10 ML로 세포의 1 병을 해동. EM 2 ML에있는 세포를 Resuspend과 12 잘 판 중 하나를 잘에 전송할 수 있습니다. 5% CO ₂ 인큐베이터, 37 ° C에서 세포를 배양.

DAY 3 DAY 6

17. 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송하고 자기편 세포를 수집하는 QBSF-60 줄기 세포 중의 1 ML과 함께 한 번 잘 씻어.
18. 10 분 300 XG에서 세포를 원심 분리기.
19. EM 2 ML에있는 세포를 Resuspend하고 12의 잘 하나 전송- 잘 판. 5% CO ₂ 인큐베이터, 37 ° C에서 세포를 배양.

2. STEMCCA Lentivirus과 PBMCs의 전달

9 일

1. 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송하고 자기편 세포를 수집하는 QBSF-60 줄기 세포 중의 1 ML과 함께 한 번 잘 씻어.
2. 10 분 300 XG에서 세포를 원심 분리기.
3. 5 μg / polybrene 및 STEMCCA lentivirus의 ML을 포함하는 신선한 EM의 1 ML에있는 세포를 Resuspend (전부다 = 1 10)과 12 잘 접시의 잘 하나 전송됩니다. (lentiviral 입자의 생산을 설명하는 프로토콜은에서 찾을 수 있습니다 http://www.bumc.bu.edu/stemcells/protocols/ )
4. 90 분에 25 ° C에서 2,250 rpm으로 판을 봐.
5. 스핀 후, 신선한 EM의 추가 한 ML을 추가 매체 2 ML의 총 5 μg / polybrene의 ML을 포함하고 37 ° C에서 판을 품다,5% CO ₂ 인큐베이터.

10 일

16. 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송하고 자기편 세포를 수집하는 QBSF-60 줄기 세포 중의 1 ML과 함께 한 번 잘 씻어.
17. 10 분 300 XG에서 세포를 원심 분리기.
18. EM 2 ML에있는 세포를 Resuspend과 12 잘 접시의 한 우물 전송할 수 있습니다. 5% CO ₂ 인큐베이터, 37 ° C에서 세포를 배양.

3. 도금은 MEFs에 셀을 Transduced

DAY 11

1. 코트 2x10 ⁵ 세포에서 0.1 % 젤라틴과 판 inactivated 마우스 배아 섬유 아세포 (MEFs)와 / 잘 MEF 매체 (IMDM 10 % FBS, 1 % 비 필수 아미노산을 포함, 100 μM의 β-에서 6 잘 접시의 우물 메르 캅토 에탄올, 2 MM L-글루타민, 100 μg / ML primocin 또는 1 %의 펜 / 패 혈성). 감염 당 3 우물을 준비합니다.

하루에 12

2. 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송 그리고 자기편 세포를 수집하는 QBSF-60 줄기 세포 중의 1 ML과 함께 한 번 잘 씻는다.
3. 10 NG / ML bFGF와 아스코르브 산 및 EM에 사용되는 것과 동일한 농도의 성장 요소를 포함하는 MEF 매체의 3 ML에있는 세포를 Resuspend 중간 (50 μg / ML 아스코르브 산, 50 NG / ML SCF, 10 NG / ML IL -3, 2 U / ML EPO, 40 NG / ML IGF-1, 1 μM Dexamethasone).
4. 플레이트 (1) 세포의 ML 당 잘 MEFs를 포함하는 6 잘 접시의. / 잘 매체의 2.​​5 ML의 총 bFGF, 아스코르브 산, 및 성장 요인과 MEF 미디어의 1.5 ML를 추가합니다.
5. 25 500 rpm으로 판을 돌려 ° C를 30 분에. 37 ° C, 5 % CO ₂ 인큐베이터에서 판을 품다.

DAY 14

6. 10 NG / ML bFGF와 50 μg / ML 아스코르브 산 (NO 성장 요소)를 포함 MEF 미디어 2.5 ML로 피드 전지는 매일. 기음과 각 피드와 부동 셀을 폐기합니다.
7. 로 (보통 일주일에 한 번) 필요한 추가 MEFs을 추가합니다.

P "> ~ DAY 20

8. 일단 작은 식민지 피드 세포는 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 매체 (DMEM/F12가 포함 된 20 %의 넉 아웃 세럼 교체, 1 % 비 필수 아미노산, 100 μM의 β-메르 캅토 에탄올, 2 MM L-글루타민 2 ML과 매일 표시 , 100 μg / ML primocin 또는 1 %의 펜 / 패 혈성, 10 NG / ML bFGF).

4. 따기 및 iPSC 클론의 확장

~ DAY 30-40

1. 12 잘 판 inactivated MEFs가 / 잘 hESC 매체 1 ML 플러스 Stemolecule Y27632 (ROCK 저해제) 10 μM을 포함하는으로 미리 놓는의 개별 우물에 각 식민지를 선택합니다.
2. 만 hESC 매체 (NO ROCK 억제제) 1 ML과 이후 매일 세포를 피드.

5. Pluripotency 마커에 대한 Immunofluorescence 착색

1. 착색은 Millipore에서 키트 'ES 세포 마커 샘플 키트 "를 사용하고 제조업체의 프로토콜에 따라 수행되었다.

6. Integ의 절단정격 STEMCCA 벡터

1. 카세트를 재 프로그램의 절단은 Cre-IRES-Puro 표현 벡터에 따라 transfection 및 ^6에 설명 된대로 간단한 Puromycin 선택을 활용 이루어집니다.

결과

우리는 하나의 lentiviral 벡터를 사용하여 PBMCs에서 인간 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜을 보여줍니다. 그림 1A는 프로토콜의 개략도를 보여줍니다. 피가 BD Vacutainer CPT 셀 준비 튜브 나트륨 구연산과로 수집하고 있으며, 원심 분리 후, mononuclear 세포는 폴리 에스터 젤과 플라즈마 (버피 코트) (그림 1b) 사이의 인터페이스에서 수령하실 수 있습니다. 절연 PBMCs ...

토론

우리는 여기에서 갓 수집 말초 혈의 몇 밀리리터 격리 mononuclear 세포에서 인간 iPSCs를 생성하는 STEMCCA lentiviral 벡터의 사용을 설명합니다. 프로토콜은 먼 위치에서 획득 한 기증자 세포를 활용하면 냉동 PBMCs (버피 코트에서 직접 취득), 상당한 실질적인 의미의 상세를 재설정하는 데 사용할 수 있습니다. 재 프로그램의 유도하기 전에, 절연 PBMCs는 핵 재활 더받을 수있는 세포의 건강한 proliferating 인...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트 (선택 사항)
BD Vacutainer CPT 셀 준비 튜브 나트륨 구연산과	BD Biosciences	362760
QBSF-60 줄기 세포 중	품질 생물	160-204-101
IMDM	Invitrogen	12,440
DMEM/F12	Invitrogen	11,330
FBS	애틀랜타 체액	S10250
넉 아웃 세럼 교체	Invitrogen	10,828
Primocin	Invivogen	개미-PM-2
펜 / 패 혈성	Invitrogen	15,140
L-글루타민	Invitrogen	25,030
비 필수 아미노산	Invitrogen	11,140
β-메르 캅토 에탄올	MP의 Biomedicals	190242
아스 코르 비 산	시그마	A4544
IGF-1	R & D 시스템	291-G1
IL-3	R & D 시스템	203-IL
SCF	R & D 시스템	255-SC
EPO	R & D 시스템	286-EP
Dexamethasone	시그마	D4902
Polybrene	시그마	H-9268
bFGF	R & D 시스템	233-FB
Stemolecule Y27632	Stemgent	04-0012
ES 세포 마커 샘플 키트	Millipore	SCR002