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Method Article
Qui mostriamo un protocollo semplice ed efficace per la generazione di iPSCs umani da 3-4 ml di sangue periferico utilizzando un singolo vettore lentivirale riprogrammazione. La riprogrammazione delle cellule del sangue prontamente disponibili promette di accelerare l'utilizzo della tecnologia iPSC rendendola accessibile ad una comunità di ricerca più ampio.
Attraverso l'espressione ectopica di quattro fattori di trascrizione, Oct4, Klf4, Sox2 e cMyc, cellule somatiche umane possono essere convertiti in uno stato pluripotente, generando le cosiddette cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) 1-4. Paziente-specifici iPSCs mancano le preoccupazioni etiche che circondano le cellule staminali embrionali (ESC) e sarebbe possibile bypassare rigetto immunitario. Così, iPSCs hanno attirato molta attenzione per gli studi di modellazione delle malattie, la proiezione di composti farmacologici e terapie rigenerative 5.
Abbiamo dimostrato la generazione di iPSCs umani transgene-liberi da pazienti con malattie polmonari diverse utilizzando un unico soggetto ad accisa policistronica cassetta lentivirale Stem Cell (STEMCCA), che codifica i fattori Yamanaka 6. Queste linee IPSC sono stati generati da fibroblasti della pelle, il tipo cellulare più utilizzato per la riprogrammazione. Normalmente, ottenendo fibroblasti richiede una biopsia cutanea seguita da espansione della cellas in coltura per alcuni passaggi. Importante, una serie di gruppi hanno riportato la riprogrammazione di cellule del sangue periferico in iPSCs 7-9. In uno studio, una versione inducibile Tet del vettore STEMCCA stato impiegato 9, che ha richiesto le cellule del sangue per essere simultaneamente infettati con un lentivirus costitutivamente attivo codificante l'inverso transattivatore della tetraciclina. A differenza di fibroblasti, cellule del sangue periferico può essere smaltito attraverso procedure mini-invasive, riducendo notevolmente il disagio e la sofferenza del paziente. Un protocollo semplice ed efficace per la riprogrammazione delle cellule del sangue con un singolo vettore costitutivo soggetti ad accisa possono accelerare l'applicazione della tecnologia iPSC rendendola accessibile ad una comunità di ricerca più ampio. Inoltre, la riprogrammazione delle cellule del sangue periferico consente la generazione di iPSCs da individui in cui biopsie cutanee dovrebbero essere evitati (ad esempio. Aberrante cicatrici) oa causa di condizioni pre-esistenti malattie Preventiaccesso ng a biopsie.
Qui mostriamo un protocollo per la generazione di iPSCs umane da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) servendosi di un unico soggetto ad accisa floxed-vettori lentivirali costitutivamente esprimere i 4 fattori. PBMC freschi o scongelati vengono espanse per 9 giorni come descritto 10,11 in mezzo contenente acido ascorbico, SCF, IGF-1, IL-3 e EPO prima di essere trasdotte con il lentivirus STEMCCA. Le cellule vengono poi piastrate su MEF e ESC-colonie, come possono essere visualizzati due settimane dopo l'infezione. Infine, cloni selezionati sono espansi e testati per l'espressione dei marcatori pluripotenza SSEA-4, Tra-1-60 e Tra-1-81. Questo protocollo è semplice, robusto e altamente coerente, fornendo un metodo affidabile per la generazione di iPSCs umani facilmente accessibile da 4 ml di sangue.
1. Isolamento ed espansione delle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC)
GIORNO 0
GIORNO 3 e 6 ° GIORNO
2. Trasduzione di PBMC con STEMCCA Lentivirus
GIORNO 9
GIORNO 10
3. Placcatura cellule trasdotte sul MEF
GIORNO 11
GIORNO 12
GIORNO 14
4. Raccolta ed espansione di cloni iPSC
~ DAY 30-40
5. Colorazione di immunofluorescenza per Marcatori pluripotenza
6. Asportazione di Integnominale STEMCCA Vector
Dimostriamo un protocollo semplice ed efficace per la generazione di iPSCs da PBMC umane utilizzando un singolo vettore lentivirale. Figura 1A mostra una rappresentazione schematica del protocollo. Il sangue viene raccolto in una provetta BD Preparazione Vacutainer CPT cellulare con citrato di sodio e, dopo centrifugazione, le cellule mononucleate possono essere raccolte dall'interfaccia tra il gel di poliestere e il plasma (buffy coat) (Figura 1B). Le PBMC isolate vengono espanse i...
Abbiamo qui descrivere l'uso del vettore lentivirale STEMCCA per generare iPSCs umani da cellule mononucleate isolate da pochi ml di sangue periferico raccolto di recente. Il protocollo può essere utilizzato anche per riprogrammare congelati (PBMC ottenute direttamente dal buffy coat), un particolare di implicazioni pratiche quando utilizza cellule donatrici acquisiti da un luogo distante. Prima dell'induzione di riprogrammazione, PBMC isolate deve subire una fase critica di espansione che rende una popolazione...
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Questi studi sono stati finanziati in parte dal NIH UO1HL107443-01 Premio per GJM e GM.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti (opzionale) |
BD Vacutainer CPT Preparazione Tubo cellulare con citrato di sodio | BD Biosciences | 362760 | |
QBSF-60 cellule staminali Media | Di qualità biologica | 160-204-101 | |
IMDM | Invitrogen | 12440 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 11330 | |
FBS | Atlanta Biologicals | S10250 | |
Knockout sostituzione Siero | Invitrogen | 10828 | |
Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
Pen / Strep | Invitrogen | 15140 | |
L-Glutammina | Invitrogen | 25030 | |
Aminoacidi non essenziali | Invitrogen | 11140 | |
β-mercaptoetanolo | MP Biomedicals | 190242 | |
Acido ascorbico | Sigma | A4544 | |
IGF-1 | R & D Systems | 291-G1 | |
IL-3 | R & D Systems | 203-IL | |
SCF | R & D Systems | 255-SC | |
EPO | R & D Systems | 286-EP | |
Desametasone | Sigma | D4902 | |
Polibrene | Sigma | H-9268 | |
bFGF | R & D Systems | 233-FB | |
Stemolecule Y27632 | Stemgent | 04-0012 | |
ES cellulare Marker Kit campione | Millipore | SCR002 |
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