تعديل وإعادة التركيب الوراثي للاللعابية الثقافات الجهاز الغدة

Summary

وهناك تقنية لمعالجة وراثيا داخل الخلايا الظهارية كله خارج الجسم الجنينية الماوس مثقف الغدد تحت الفك السفلي (SMGs) باستخدام نقل الجينات الفيروسية. هذه الطريقة يستفيد من قدرة فطرية من SMG ظهارة واللحمة المتوسطة لإعادة تجميع تلقائيا بعد الانفصال وإصابة اساسيات الظهارية مع ناقلات الغدانية.

Abstract

المتفرعة التشكل يحدث خلال تطوير العديد من الأجهزة، وتحت الفك السفلي الماوس الجنينية الغدة (SMG) هو النموذج الكلاسيكي لدراسة التشكل المتفرعة. في SMG النامية، وهذه العملية تنطوي على خطوات متكررة من برعم الظهارية وتشكيل لاصق، لإعطاء نهاية المطاف إلى نشوء شبكة متفرعة معقدة من القنوات وعنيبات، التي تعمل على إنتاج وتعديل / نقل اللعاب، على التوالي، في تجويف الفم ^{1 - 3.} الغشاء القاعدي الظهارية المرتبطة وجوانب المقصورة الوسيطة، بما في ذلك خلايا اللحمة المتوسطة، وعوامل النمو المصفوفة خارج الخلية، التي تنتجها هذه الخلايا، حاسمة بالنسبة لآلية المتفرعة، على الرغم من كيفية تنسيق الأحداث الخلوية والجزيئية تبقى غير مفهومة ⁴ . دراسة الآليات الجزيئية القيادة السلف التشكل الظهارية فهمنا لآليات التنموية ورؤية ثاقبة regener ممكننهج الطب اطر النسبية. وتعطلت مثل هذه الدراسات نظرا لعدم وجود طرق فعالة للتلاعب الجيني للظهارة اللعابية. حاليا، يمثل تنبيغ الغدانية الأسلوب الأكثر فعالية لاستهداف الخلايا الظهارية في الغدد في الجسم الحي الكبار ^5. ومع ذلك، في إإكسبلنتس الجنينية، اللحمة المتوسطة كثيفة والغشاء القاعدي الخلايا الظهارية المحيطة يعوق الوصول الفيروسية للخلايا الظهارية. إذا تمت إزالة اللحمة المتوسطة، يمكن تقاس باستخدام الظهارة الفيروسات الغدية، واساسيات الظهارية يمكن استئناف المتفرعة التشكل في وجود أو Matrigel laminin 111 ^6،7. اللحمة المتوسطة خالية النمو رديم الظهارية يتطلب أيضا مكملات إضافية مع عوامل النمو للذوبان ولا ألخص بشكل كامل التشكل المتفرعة كما يحدث في الغدد سليمة ^8. نحن هنا وصف الأسلوب الذي يسهل تنبيغ الغدانية من الخلايا الظهارية وثقافة بالنقل هpithelium مع اللحمة المتوسطة المرتبطة بها. بعد تسليخ مجهري للSMGs الجنينية، إزالة اللحمة المتوسطة، والعدوى الفيروسية من ظهارة مع اتش GFP التي تحتوي على، وتبين لنا أن يعيد توحيد ظهارة تلقائيا، مع اللحمة المتوسطة غير مصاب، تلخص سليمة هيكل غدي SMG والمتفرعة التشكل. ويمكن للسكان المعدلة وراثيا الخلايا الظهارية رصدها بسهولة باستخدام معيار أساليب مضان المجهري، إذا fluorescently-الموسومة تستخدم بنيات الغدانية. طريقة إعادة التركيب الأنسجة الموصوفة هنا هو حاليا الأسلوب الأكثر فعالية ويمكن الوصول إليها عن ترنسفكأيشن من الخلايا الظهارية مع ناقل البرية من نوع أو متحولة ضمن بناء الأنسجة 3D المعقدة التي لا تتطلب جيل من الحيوانات المعدلة وراثيا.

Protocol

ويتضمن البروتوكول أربع خطوات رئيسية، كما هو مبين في الشكل 1. يتم وصف كل الخطوات بالتفصيل الكامل. يجب أن يتم تنفيذ البناء وتنقية الفيروسية اتش في وقت سابق للحصاد الجهاز للاستخدام في تنبيغ الوراثية من اساسيات تشريح الظهارية. يجب اتباع جميع احتياطات السلامة القياسية BSL-2 عند التعامل مع الفيروسات الغدية.

1. الغدة تحت الفك الماوس الجنينية (SMG) حصاد وتسليخ مجهري

1. الموت ببطء التوقيت-إناث الفئران الحوامل (سلالة الأباعد CD-1 أو ICR) باستخدام CO ₂ الخدر، تليها خلع عنق الرحم وخيوط حصاد أجنة الفئران الجنينية في يوم 13 (E13، 3-5 براعم الظهارية) الإجراءات التالية التي وافقت عليها IACUC المؤسسية اللجنة. تم تعيينه يوم اكتشاف المكونات المهبلية كما E0. ويمكن أيضا أن تحصد الغدد اللعابية ومثقف في مرحلة E12 عندما يكون هناك برعم واحد الابتدائية وساق مع الشقوق بدأت للتولبدء. SMGs قبل هذه المرحلة تتطلب ظروف مختلفة عن تلك الثقافة وأشارت هنا.
2. نقل السلاسل الجنين في معقمة 10 أطباق سم زراعة الأنسجة مليئة 25 مل من متوسطة F12 DMEM / هام ل(F12) تفتقر الحمراء الفينول (لايف تكنولوجيز) وتستكمل مع 100 U / البنسلين مل، و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين (القلم بكتيريا، الحياة تكنولوجيز).
3. باستخدام مشرط معقم (# 11 ريش) وملقط (# 5، أدوات العلوم الجميلة، 11252-20)، إزالة الأجنة من الحويصلات في طبق منفصل 10 سم تحتوي على 25 مل من DMEM/F12 + القلم بكتيريا.
4. قطع رؤوس الجنين مع قطع الزاوية أسفل الفك السفلي.
5. عزل أقل mandibles من رؤساء تحت المجهر ستيريو مع وجود قاعدة تشريح الضوء المرسل (نيكون SMZ645 أو ما يعادلها) باستخدام قطع تحت الفك العلوي. وضع الأنسجة على رأس قطعة اضافية من الزجاج وليس مباشرة على الزجاج المكون لقاعدة المجهر.
6. جمع أقل mandibles إلى 3 مل من DMEM/F12 + القلم بكتيريا في طبق العقيمة 35 ملم زراعة الأنسجة.
7. وضع شريحة الفك السفلي على المسرح المجهر تشريح بحيث اللسان على الجزء السفلي من شريحة ولكن يشير نحو موقف الساعة 12:00.
8. استخدام جانب واحد من اثنين من ملقط عبرت في حركة سكيسورينغ، وإزالة وتجاهل ^{الثالثة} أقل 1/3 من شريحة الفك السفلي.
9. تحويل شريحة 90 درجة إلى اليمين (اليد اليمنى إذا) و، وذلك باستخدام قطع سكيسورينغ مع ملقط، وقطع الجزء العلوي من شريحة الفك السفلي (بدون قطع اللسان) في منتصف الطريق إلى شريحة.
10. قشر الأنسجة الزائدة بعيدا وإزالته لفضح SMGs تحتها. وسوف يكون هناك واحد على كل جانب بالقرب من قاعدة اللسان.
11. باستخدام زوج واحد من الملقط باستمرار إلى الأنسجة عن طريق اللسان، استخدم ملقط أخرى لندف SMG بعيدا عن اللسان. تكرار للغدة أخرى.
12. جمع الغدد اللعابية في microdissected 3 مل من DMEM/F12 + القلم بكتيريا جديدة في الأنسجة المعقمة 35 ملمثقافة الطبق. ملاحظة: يمكن زرعها أكبر الغدد تحت الفك السفلي (3-5 براعم الظهارية) جنبا إلى جنب مع الغدة تحت اللسان إتصال أصغر (1 برعم) على حالها من خلال تخطي إلى الخطوة 4 وتنفيذ الخطوات 4.1، 4.3، و 4.4، كما هو موضح سابقا ^2،8.

2. SMG طلائي فصل رديم

1. المكان 5 (أو أكثر) الغدد اللعابية في زجاجة ذات قاع، 50 مم القطر microwell طبق (ماتيك شركة، P50G-1.5-14-F) تحتوي على 200 ميكرولتر من محلول هانك الملح المتوازن (HBSS تفتقر كا ^{+ +} أو Mg ^{+ +،} تقنيات الحياة) التي تحتوي على 0.4٪ (V / V) dispase (تقنيات الحياة، القط. رقم 17105-041) واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 ° C.
2. بعد الحضانة، وذلك باستخدام ماصة معقمة 200 ميكرولتر تلميح، نضح بعناية الحل من دون إزعاج dispase الغدد. إضافة 200 ميكرولتر من الفور DMEM/F12 وسائل الإعلام التي تحتوي على 5٪ (W / V) BSA (DMEM/F12-BSA، قبل تعقيمها 0،22 ميكرون مع فلتر) لتحييد dispase.
<لى> تحت المجهر تشريح، وذلك باستخدام زوج من ملقط مع نصائح غرامة (# 5 Dumostar، أدوات العلوم الجميلة، 11295-20)، فصل بلطف اللحمة المتوسطة خففت من جميع أنحاء براعم SMG الظهارية والقنوات، مع الحرص على ترك سليمة ظهارة .
3. قبل الرطب وعقيمة 200 ميكرولتر ماصة الحافة مع وسائل الإعلام وDMEM/F12-BSA ماصة بلطف من اساسيات الظهارية في طبق جديد 50 مم القطر microwell تحتوي على 200 ميكرولتر من DMEM/F12 + القلم بكتيريا. استخدام عالية الجودة تلميح ماصة ميكرولتر 200 مع حافة ناعمة.
4. في الصحن الذي يحتوي على قطع اللحمة المتوسطة، ونبذ أي نوع من الأنسجة غير الوسيطة بما في ذلك الغدد تحت اللسان وأي فصل براعم الغدة تحت الفك.

3. الغدانية العدوى من الأساسيات طلائي

1. جعل وسائل الإعلام 200 ميكرولتر من عدوى فيروسية إضعاف اتش الاهتمام DMEM/F12 + بكتيريا من ركلة جزاء في أنبوب microcentrifuge بحيث عيار من الحل الناتج هو 1x10 ⁸ -10 ⁹ PFUs. القد عيار الأمثل المطلوب لفيروسات مختلفة تختلف. من المهم أن استخدام كلوريد السيزيوم (CSCL)-تنقية الاستعدادات لكفاءة امتصاص الفيروسية الأمثل.
2. إزالة وسائل الإعلام من الطبق يحتوي على اساسيات 5 الظهارية. بسرعة إضافة 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام العدوى، والحفاظ على اساسيات الرطب في جميع الأوقات. اتخاذ الاحتياطات اللازمة عند التعامل مع الفيروس والتخلص من نصائح الماصة الملوثة. تطهير الأسطح أي ملوثة بالفيروس مع حل التبييض 10٪.
3. نقل اساسيات الظهارية بعيدا عن بعضها البعض مع ملقط لمنعهم من الالتصاق معا، والسماح لهم لتسوية في الجزء السفلي من اللوحة. احتضان اساسيات في وسائل الإعلام الفيروسية ل1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. خلال الحضانة، فصل اساسيات، إذا انتقلوا قريبة من بعضها البعض. سوف هزاز المفرط أو حركة يسمح للغدد لتتجمع معا.
4. بعد الحضانة، وإزالة بلطف وسائل الإعلام التي تحتوي على فيروسات والتخلص بشكل مناسب، مع الحرص على عدم تعطيل Rudiments. أضف 200 ميكرولتر من DMEM/F12 + القلم بكتيريا. تكرار غسل هذا على الأقل مرتين أخريين واستبدال مع 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام DMEM/F12 القلم بكتيريا +. هذه يغسل حاسمة لإزالة أي فيروس التي لم يتم بقوة لتولي الظهارة ومنع العدوى من اللحمة المتوسطة.
5. احتضان اساسيات الظهارية مع 200 مل من DMEM/F12 تحتوي على 2٪ (V / V) Matrigel (BD العلوم البيولوجية، 356231) لمدة 20 دقيقة. نجد أن هذه الحضانة قصيرة في Matrigel يقلل من الانحدار من الشقوق الموجودة الثقافة خلال الفترة الأولية، ولكن يمكن الاستغناء هذه الخطوة مع المطلوب إذا لم يتم التعرض لMatrigel.

4. فيفو السابقين من الثقافة SMGs معاد

1. وضع كل رديم، في وقت واحد، وذلك باستخدام ما قبل الرطب تلميح ماصة ميكرولتر 200، على رأس (قطع صغيرة) حقق 13 مم، 0.1 ميكرومتر Nuclepore المسار، إحفر غشاء (WHATMAN) تطفو أكثر من 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام الثقافة ( 5 اساسيات / فلتر) في لوحة microwell الزجاجي. ثقافة وسائل الإعلامهو: DMEM/F12 + القلم بكتيريا يحتوي على 50 ميكروغرام / مل و 150 ترانسفيرين حمض الاسكوربيك ميكروغرام / لتر، كما هو موضح سابقا ^2،8. ومن المعروف ترانسفيرين لتحفيز البقاء والمتفرعة من التشكل الغدد اللعابية والجهاز إإكسبلنتس أخرى ^9. وقد تبين من حامض الاسكوربيك بالإضافة إلى تحفيز SMG المتفرعة ¹⁰ ومن المعروف أن يكون بمثابة العامل المساعد في التفاعلات الهيدروكسيل العديد من المسارات الأيضية (مثل الهيدروكسيل البرولين خلال تشكيل الكولاجين الألياف ¹¹⁾ وتحفز أيضا إنتاج فبرونيكتين وlaminin في إإكسبلنتس جهاز آخر ^12.
2. إزالة الكثير من وسائل الإعلام على رأس مرشح ممكن بعد إضافة كل رديم الظهارية. قد الكثير من وسائل الإعلام على رأس تصفية تسبب تصفية لإغراق، في حين أن أقل وسائل الاعلام يجعل وضع اساسيات واللحمة المتوسطة أسهل بكثير. يمكن إزالة الزائدة وسائل الإعلام سواء مع طرف ماصة أو باستخدام ملقط لقبضة وسائل الإعلام بين النصائح.
3. قطع اللحمة المتوسطة المكان جيئة وذهابا المستمدة03:57 م الغدد على رأس و / أو حول كل رديم الظهارية. إزالة أي وسائط الإضافية التي تقوم بتطويق الغدد لتجنب حركة اللحمة المتوسطة بعيدا عن اساسيات. اللحمة المتوسطة المستمدة من أكثر الغدد ليست مفيدة ولكن أقل يمكن أن يكون ضارا لنمو رديم الظهارية.
4. احتضان SMGs معاد في حاضنة مرطب (95٪ الهواء / 5٪ CO ₂₎ في C ° 37 لمدة 48 -72 ساعة، كما هو مطلوب.
5. الحصول على brightfield و / أو الصور الفلورسنت الغدد الحية في ساعة 0 (الرغبة)، 2 ساعة بعد إعادة التركيب وبعد ذلك على مدار 24 ساعة كل على ضوء المجهر المقلوب، وتستقيم، أو ستيريو مزودة كاميرا رقمية باستخدام التكبير 4X الهدف أو 5X ل التقاط الغدة بأكملها معاد في إطار واحد وجهة نظر. صور من الغدة اللعابية عرض أفضل النقيض باستخدام الإعداد brightfield أو الحلبة المرحلة المناسبة وضعت الطريقة في جزء مسار الضوء (وهو أمر غير ممكن على كامل الآلي المجاهر). معيار المقابل المرحلة ليسر اللازمة منذ الغدة سميكا ويخلق التباين.
6. في نقطة زمنية المطلوب، يمكن أن تكون ثابتة SMGs معاد لمدة 20 دقيقة مع الحل مثبت مصنوع من بارافورمالدهيد 2٪ (PFA) في برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 5٪ (W / V) السكروز (للحفاظ على بنية الخلية الداخلية أفضل عن طريق الحفاظ على الخلايا في دولة متسق الضغط التناضحي). على عكس PFA 4٪ سوف، PFA 2٪ الحفاظ على كمية كبيرة من الإشارة GFP إذا تمت إزالة تماما بعد التثبيت مثبت. ويمكن تخزين الغدد لمدة تصل إلى 1 أسبوع في برنامج تلفزيوني 1X في الظلام في 4 درجات مئوية حتى يتم تنفيذ كامل جبل كيمياء سيتولوجية مناعية والتصوير مبائر، كما ورد سابقا ^3،6،13-15. من الناحية المثالية، ينبغي أن يتم تنفيذ كيمياء سيتولوجية مناعية والتصوير قريبا بعد التثبيت للحصول على صور ذات نوعية أفضل. ويمكن أيضا أن الغدد lysed في العازلة RIPA لSDS-PAGE تليها الغربية النشاف تحليل.

النتائج

ويرد تدفق الخطوات التجريبية الرئيسية في الشكل 1. وتظهر مثال لSMG سليمة، وهي معزولة رديم الظهارية، واللحمة المتوسطة المناظر له في الشكل 2. صور من Brightfield SMGs معاد، التي لا تزال تخضع المتفرعة التشكل عندما تظهر مثقف فيفو السابقين لصحيفة المشار إليها، ...

Discussion

نشرت لأول مرة خارج الجسم تقنية إعادة التركيب الظهارية الوسيطة-الغدد اللعابية تحت الفك السفلي لعام 1981 ^16. في هذا البروتوكول، ونحن على توسيع الأسلوب الأصلي، وذلك باستخدام عدوى الفيروسة الغدانية للتلاعب الظهارية التعبير الجيني الخلية في سياق غدة معاد. علينا ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الكاشف	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
DMEM / هام لF12 متوسطة دون الحمراء الفينول	الحياة تكنولوجيز	21041-025
البنسلين والستربتوميسين	الحياة تكنولوجيز	15070-163	10X الأسهم
Dispase	الحياة تكنولوجيز	17105-041	تجميد مأخوذة استخدام مرة واحدة في 20C-
BSA	سيجما	A2934-100G	V كسر، الذيفان الداخلي منخفضة
الغدة X-GFP	BD العلوم البيولوجية	8138-1	يجب أن يكون عيار عالية (1x10 10 PFU / مل). CSCL الفيروسات تنقية أكثر فعالية من العمود تنقية الفيروسات في هذا الاختبار.
16٪ لامتصاص العرق	العلوم المجهر الإلكتروني	15710	المخفف إلى 2٪ في برنامج تلفزيوني مع السكروز 5٪ (W / V)
1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)	الحياة تكنولوجيز	70011-044	أعدت من المخزون 10X
هانك محلول الملح المتوازن	الحياة تكنولوجيز	14175095	لا الكالسيوم، المغنيسيوم لا، لا الفينول الأحمر
ترانسفيرين	سيجما	T8158	25 ملغ / مل محلول المخزون في DMEM/F12 سائل الإعلام. تجميد تستخدم مرة واحدة مأخوذة في 20C-
L-حمض الأسكوربيك (فيتامين C)	سيجما	A4403	75 ملغ / مل محلول المخزون في DMEM/F12 مأخوذة تستخدم مرة واحدة في media.Freeze-20C
			الجدول 1. قائمة الكواشف اللازمة لSMG بروتوكول إعادة التركيب.
10 سم أطباق بلاستيكية معقمة	كورنينج	430167	ويمكن أيضا لوحات غير زراعة الأنسجة المعاملة استخدامها.
ستيريو المجهر تشريح مع قاعدة الضوء المرسل	نيكون	SMZ645	ويمكن استخدام أي تشريح ستيريو المجهر يحتوي على قاعدة الضوء المرسل.
35 مم زراعة الأنسجة أطباق	صقر	353001	ويمكن أيضا لوحات غير زراعة الأنسجة المعاملة استخدامها.
50 مم قطر الأطباق microwell	شركة ماتيك	P50-G-1.5-14F
مرشحات Nuclepore غشاء المسار، إحفر	WHATMAN	110405	13 مم، 0.1 مم حجم المسام
Widefield مضان المجهر	كارل زايس، الولايات المتحدة الأمريكية	المراقب محوري Z1	أي المجهر مضان (تستقيم، طويمكن استخدام nverted أو ستيريو المجهر تشريح) لمراقبة التعبير GFP في تضخم منخفضة مع كاميرا رقمية المرفقة.
مبائر المجهر	لايكا مايكروسيستمز	TCS SP5	المجهر مبائر من الضروري أن نرى هياكل الخلية تفصيلا. ويمكن استخدام أي المجهر متحد البؤر.
التوقيت-إناث الفئران الحوامل، سلالة CD-1 أو ICR	مختبرات نهر تشارلز		ويتم حصاد الأجنة في يوم 13 (يوم من اكتشاف مع المكونات تسمى اليوم 0).
مشرط شفرة رقم 11	أدوات العلوم الجميلة	10011-00
مشرط مقبض # 3	أدوات العلوم الجميلة	10003-12
دومون # 5 سبائك INOX ملقط، 0.05mm 0.02mm X	أدوات العلوم الجميلة	11252-20	مثالية للحصاد الغدد من أجنة
دومون # 5 سبائك dumostar ملقط، 0.05mm 0.01mm X	أدوات العلوم الجميلة	11295-20	مطلوب نصائح لإزالة غرامة اللحمة المتوسطة من ظهارة. ويمكن أيضا أن تستخدم الإبر التنغستن.
			الجدول 2. المعدات المستخدمة في بروتوكول إس إم جي إعادة التركيب.