Генетическая модификация и рекомбинации слюнных желез органной культуры

Резюме

Техника генетически манипулировать эпителиальных клеток в целом Бывших естественных условиях Культурной эмбриональных подчелюстной железы мыши (SMG) с помощью вирусного переноса генов описано. Этот метод использует врожденные способности SMG эпителия и мезенхимы спонтанно рекомбинировать после разделения и инфекции эпителиальных зачатков с аденовирусных векторов.

Аннотация

Branching morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the study of branching morphogenesis. In the developing SMG, this process involves iterative steps of epithelial bud and duct formation, to ultimately give rise to a complex branched network of acini and ducts, which serve to produce and modify/transport the saliva, respectively, into the oral cavity^1-3. The epithelial-associated basement membrane and aspects of the mesenchymal compartment, including the mesenchyme cells, growth factors and the extracellular matrix, produced by these cells, are critical to the branching mechanism, although how the cellular and molecular events are coordinated remains poorly understood ⁴. The study of the molecular mechanisms driving epithelial morphogenesis advances our understanding of developmental mechanisms and provides insight into possible regenerative medicine approaches. Such studies have been hampered due to the lack of effective methods for genetic manipulation of the salivary epithelium. Currently, adenoviral transduction represents the most effective method for targeting epithelial cells in adult glands in vivo⁵. However, in embryonic explants, dense mesenchyme and the basement membrane surrounding the epithelial cells impedes viral access to the epithelial cells. If the mesenchyme is removed, the epithelium can be transfected using adenoviruses, and epithelial rudiments can resume branching morphogenesis in the presence of Matrigel or laminin-111^6,7. Mesenchyme-free epithelial rudiment growth also requires additional supplementation with soluble growth factors and does not fully recapitulate branching morphogenesis as it occurs in intact glands⁸. Here we describe a technique which facilitates adenoviral transduction of epithelial cells and culture of the transfected epithelium with associated mesenchyme. Following microdissection of the embryonic SMGs, removal of the mesenchyme, and viral infection of the epithelium with a GFP-containing adenovirus, we show that the epithelium spontaneously recombines with uninfected mesenchyme, recapitulating intact SMG glandular structure and branching morphogenesis. The genetically modified epithelial cell population can be easily monitored using standard fluorescence microscopy methods, if fluorescently-tagged adenoviral constructs are used. The tissue recombination method described here is currently the most effective and accessible method for transfection of epithelial cells with a wild-type or mutant vector within a complex 3D tissue construct that does not require generation of transgenic animals.

протокол

Протокол содержит четыре основных шага, как показано на рисунке 1. Все действия описаны во всех подробностях. Строительство аденовирус и вирусных очистки должны быть выполнены до начала извлечения органов для использования в генетической трансдукции расчлененный эпителиальные зачатки. Все стандартные BSL-2 Меры предосторожности следует соблюдать при работе с аденовирусов.

1. Мышиных эмбриональных подчелюстной железы (SMG) Сбор и Microdissection

1. Усыпить тайм-беременным самкам мышей (беспородных штамм CD-1 или ICR) с использованием CO ₂ наркоза, а затем путем смещения шейных позвонков и урожай строк эмбрионов мыши на эмбриональный день 13 (E13, 3-5 эпителия почек) следующих процедур, утвержденных институциональных IACUC комитет. В день открытия вагинальный плагин предназначен как E0. Слюнных желез также может быть собран и культивировали при E12 стадии, когда есть один основной бутон и стебель с трещинами только начинаетсяинициировать. SMGs до этой стадии требуют различных условий культуры, чем указано здесь.
2. Перенос эмбрионов строк в стерильные 10 см культуре тканей блюда заполнены 25 мл DMEM / Хэма "с F12 Medium (F12) отсутствие фенола красного (Life Technologies) с добавлением 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (ручка-стрептококк, Life Technologies).
3. Используя стерильный скальпель (# 11 лезвий) и щипцы (# 5, Fine Инструменты наук, 11252-20), удалить эмбрионы из мешков в отдельное блюдо 10 см, содержащий 25 мл DMEM/F12 + ручка-стрептококк.
4. Север эмбриона головы с угловой разрез чуть ниже нижней челюсти.
5. Изолировать нижней челюсти с головы под стерео рассекает микроскопом с передаваемой базы света (Nikon SMZ645 или эквивалент) с помощью разреза ниже верхней челюсти. Поместите тканей на вершине лишний кусок стекла, а не непосредственно на стекло компонентов микроскопа базы.
6. Сбор нижней челюсти в 3 мл DMEM/F12 + ручка-стрептококковая в стерильный 35 мм блюдо культуры ткани.
7. Поместите кусочек нижней челюсти рассекая на столике микроскопа так, что язык находится на нижней части среза, но направлен в сторону от 12:00 часов.
8. Используя одну сторону из двух скрещенных щипцами в движение ножницами, удалить и уничтожить ниже ^1/3 от нижней челюсти срез.
9. Поверните срез на 90 ° вправо (если правша) и, пользуясь ножницами разрез с помощью пинцета, вырезать верхнюю часть нижней челюсти срез (без разрезания языка) на полпути в срез.
10. Очистите от избыточной ткани и удалить его, чтобы разоблачить пистолетов-пулеметов под ним. Там будет один на каждой стороне у основания языка.
11. Используя одну пару щипцов, чтобы удерживать ткань языка, использовать другие щипцы, чтобы дразнить SMG от языка. Повторите эти действия для других желез.
12. Сбор микродиссекции слюнных желез в 3 мл DMEM/F12 + ручка-стрептококковая в новом стерильном 35 мм тканейкультуры блюдо. Примечание: чем больше подчелюстных желез (3-5 эпителиальные почки) вместе с подключенной меньше сублингвального железы (1 почка) можно культивировать нетронутыми, пропуская к шагу 4 и выполняя шаги 4.1, 4.3, и 4.4, как описано выше ^2,8.

2. SMG Эпителиальные Разделение Рудимент

1. Место 5 (или более) слюнные железы в стакан дном, диаметром 50 мм микролуночные блюдо (Маттек Corporation, P50G-1.5-14-F), содержащие 200 мкл сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS не хватает Ca ^{+ +} и Mg ^{+ +,} Life Technologies), содержащей 0,4% (V / V) диспазы (Life Technologies, кот. нет. 17105-041) и инкубировать в течение 15 мин при 37 ° C.
2. После инкубации, используя стерильные 200 мкл кончика пипетки, тщательно аспирации из диспазы решение, не нарушая желез. Сразу добавить 200 мкл DMEM/F12 средах, содержащих 5% (вес / объем) BSA (DMEM/F12-BSA, предварительно стерилизованные с 0,22 мкм), чтобы нейтрализовать диспазы.
3. Под рассекает микроскопом, с помощью пары щипцов с тонкими советы (# 5 Dumostar, Fine Инструменты наук, 11295-20), аккуратно отделить ослабил мезенхимы со всего SMG эпителия почек и каналов, заботясь, чтобы оставить нетронутыми эпителия .
4. Предварительно мокрой стерильные 200 мкл кончика пипетки с DMEM/F12-BSA СМИ и осторожно пипеткой из эпителиальных зачатков в новом диаметром 50 мм микролуночные блюда, содержащие 200 мкл DMEM/F12 + ручка-стрептококк. Используйте высококачественный 200 мкл кончика пипетки с гладким краем.
5. В блюдо, которое содержит мезенхимы частей, отказаться от любого не-мезенхимальных тканей, включая подъязычных желез и любой отдельный подчелюстной железы почки.

3. Аденовирусной инфекции эпителиальных зачатков

1. Сделать 200 мкл вирусной инфекции СМИ путем разбавления аденовирус интерес к DMEM/F12 + ручка-стрептококковая в микроцентрифуге трубку так, что титр полученного раствора составляет 1x10 ⁸ -10 ⁹ Pfus.оптимальных титр, необходимых для различных вирусов могут отличаться. Важно использовать хлорид цезия (CsCl)-очищенных вирусных препаратов для оптимальной эффективности поглощения.
2. Удалите носитель из блюдо, содержащее пять эпителиальные зачатки. Быстро добавить 200 мкл инфекции СМИ, сохраняя рудименты мокрого во все времена. Принять необходимые меры предосторожности при обращении с вирусом и утилизации загрязненного советы пипетки. Лечить любого вируса загрязненными поверхностями с 10% раствором хлорной извести.
3. Переместить эпителиальные зачатки далеко друг от друга с помощью пинцета, чтобы предотвратить их слипание и позволит им оседать на дно тарелки. Инкубируйте зачатки вирусной средствах массовой информации в течение 1 часа при комнатной температуре. Во время инкубации, отделить зачатки, если они движутся близко друг к другу. Чрезмерное качалке или движения позволит желез слипаются.
4. После инкубации аккуратно удалить вирусные содержащих средства массовой информации и отказаться соответственно, заботясь, чтобы не нарушить гudiments. Добавить 200 мкл DMEM/F12 + ручка-стрептококк. Повторите это мыть по крайней мере, еще два раза и заменить 200 мкл DMEM/F12 + ручка-стрептококковая СМИ. Эти моет являются критическими удалять любой вирус, который не сильно привязаны к эпителия и, чтобы предотвратить инфекцию мезенхимы.
5. Инкубируйте эпителиальных зачатков 200 мл DMEM/F12, содержащий 2% (V / V) Matrigel (BD Biosciences, 356231) в течение 20 мин. Мы считаем, что этот короткий инкубационный в Matrigel сводит к минимуму регресс существующих трещин в начальный период культурой, но этот шаг может не производиться при воздействии Matrigel не требуется.

4. EX VIVO культуры рекомбинированные SMGs

1. Место каждого зачатка, по одному за раз, используя предварительного увлажнения 200 мкл кончика пипетки, на вершине зубчатый (небольшой разрез) 13 мм, 0,1 мкм Nuclepore трек-Etch мембранный фильтр (ватман) плавают более 200 мкл культуральной среды ( 5 зачатки / фильтр) в стеклянным дном пластины микролуночные. Медиакультурыявляется: DMEM/F12 + ручка-острый, содержащей 50 мкг / мл трансферрина и 150 мкг / мл аскорбиновой кислоты, как описано выше ^2,8. Трансферрин как известно, стимулирует выживание и морфогенеза ветвления слюнных желез и других эксплантов органа ^9. Добавление аскорбиновой кислоты было показано, чтобы стимулировать ветвление SMG ^10. Известно, что он действует в качестве кофактора во многих реакциях гидроксилирования метаболических путей (например, гидроксилирование пролина в формировании коллагеновых волокон ^11), а также стимулирует фибронектин и ламинин производства в других эксплантов органа ^12.
2. Удалить столько средств массовой информации в верхней части фильтра, как после добавления каждого эпителиального зачатка. Слишком много средств массовой информации в верхней части фильтра может привести фильтра тонуть, а меньше средств массовой информации делает размещение зачатки и мезенхимы гораздо проще. Избыточные средства массовой информации могут быть удалены либо с кончика пипетки или с помощью щипцов для захвата средств массовой информации между советами.
3. Место части мезенхимы, полученных сюдам 3:57 железы на верхней и / или вокруг каждого эпителиального зачатка. Извлеките все дополнительные средства массовой информации, которые окружающие железы, чтобы избежать движения мезенхимы от рудиментов. Мезенхимы выведены из более желез не выгодно, но менее может быть вредно для роста эпителиальных зачатков.
4. Инкубируйте рекомбинированные пистолетов-пулеметов в увлажненном инкубаторе (95% воздуха / 5% CO ₂₎ при 37 ° С в течение 48 -72 часов, как хотелось бы.
5. Приобретать светлого и / или флуоресцентных изображений живых железы в 0 часов (по желанию), 2 часа после рекомбинации и каждые 24 часа после этого на перевернутую, в вертикальном положении, или стерео световой микроскоп снабжен цифровой камеры с использованием 4х или 5-кратным увеличением целью захватить весь рекомбинированные железы в одном кадре зрения. Изображения слюнных желез показать лучший контраст либо с помощью установки светлого или соответствующего кольца фазы помещен часть пути на свет путем (что невозможно на полностью автоматизированных микроскопов). Стандартный фазового контраста нетт необходимо, поскольку железы толстая и создает контраст.
6. В нужное время точки, рекомбинированные пистолетов-пулеметов может быть исправлена ​​в течение 20 минут с фиксирующим раствором, приготовленным из 2% параформальдегида (PFA) в 1X PBS, содержащем 5% (вес / объем) сахарозы (чтобы лучше сохранить внутреннюю клеточную структуру, сохраняя клетки isosmotic состоянии). В отличие от 4% PFA, PFA 2% позволит сохранить значительное количество сигнал GFP, если фиксатор полностью удаляется после фиксации. Железы можно хранить до 1 недели в 1X PBS в темноте при 4 ° С до целого иммуноцитохимия крепления и конфокальной микроскопии осуществляется, как сообщалось ранее ^3,6,13-15. В идеале, иммуноцитохимия и изображения должны быть выполнены вскоре после фиксации для получения наилучшего качества изображения. Железы могут быть также лизировали в буфере RIPA для SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттинга анализа.

Результаты

Поток из основных экспериментальных шагов указаны на рисунке 1. Пример нетронутыми SMG, изолированных эпителиальных зачатков, и соответствующий мезенхимы показано на рисунке 2. Светлое изображение рекомбинированных пистолетов-пулеметов, которые продолжают подвергат...

Обсуждение

Экс естественных эпителиальных мезенхимальных рекомбинации техника была впервые опубликована в подчелюстной слюнной железы в 1981 ^16. В этом протоколе, мы расширяем на оригинальный метод, с помощью аденовирусной инфекции манипулировать эпителиальные клетки экспрессии генов...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
DMEM / Хэма "с F12 среде без фенола красного	Life Technologies	21041-025
Пенициллина и стрептомицина	Life Technologies	15070-163	10X складе
Диспазы	Life Technologies	17105-041	Замораживание одной порции использования на-20C
BSA	Сигма	A2934-100G	Доля V, низкий эндотоксина
Adeno-X-GFP	BD Biosciences	8138-1	Должен быть высокий титр (1x10 10 БОЕ / мл). CsCl очищенного вируса являются более эффективными, чем столбцов очищенных вирусов в этом анализе.
16% параформальдегид	Электрон наук микроскопии	15710	Разводненная прибыль на 2% в PBS с 5% сахарозы (вес / объем)
1X фосфат-солевым буфером (PBS)	Life Technologies	70011-044	Получают из 10х складе
Сбалансированный солевой Хэнка решение	Life Technologies	14175095	нет кальция, магния нет, не Фенол красный
Трансферрин	Сигма	T8158	25 мг / мл маточного раствора в DMEM/F12 СМИ. Замораживание одноразовые аликвоты при-20C
L-аскорбиновая кислота (витамин С)	Сигма	A4403	75 мг / мл маточного раствора в DMEM/F12 media.Freeze одноразовые аликвоты при-20C
			Таблица 1. Список реагенты для SMG рекомбинации протокол.
10 см стерильная посуда пластиковая	Гранулирование	430167	Номера для культуры тканей обработанных пластин также может быть использован.
Stereo рассекает микроскопом в проходящем свете базу	Nikon	SMZ645	Любой стерео рассекает микроскоп может быть использован, который имеет проходящем свете базу.
35 мм блюд культуре ткани	Сокол	353001	Номера для культуры тканей обработанных пластин также может быть использован.
Диаметром 50 мм микролуночные блюд	Маттек корпорации	P50-G-1.5-14F
Nuclepore трек-Etch мембранные фильтры	Ватман	110405	Диаметром 13 мм, 0,1 мм, размер пор
Широкоугольные флуоресцентного микроскопа	Carl Zeiss, США	Axio наблюдателей Z1	Любой флуоресцентного микроскопа (в вертикальном положении, яnverted или стерео рассекает микроскопом) может быть использован для мониторинга GFP выражение при небольшом увеличении с приложенной цифровой камеры.
Конфокальной микроскопии	Leica Microsystems	TCS SP5	Конфокальной микроскопии необходимо, чтобы увидеть подробную клеточных структур. Любой конфокальной микроскопии может быть использована.
Временный беременных самок мышей, штамм CD-1 или ICR	Charles River Labs		Эмбрионы собирали в день 13 (с днем ​​плагин открытия обозначен как день 0).
Лезвие скальпеля № 11	Средства изобразительных наук	10011-00
Скальпель ручкой № 3	Средства изобразительных наук	10003-12
Дюмон # 5 пинцет из нержавеющей стали сплава, 0,05 X 0,02 мм	Средства изобразительных наук	11252-20	Идеально подходит для уборки желез из эмбрионов
Дюмон # 5 щипцы dumostar сплав, 0,05 X 0,01 мм	Средства изобразительных наук	11295-20	Изобразительное советы, необходимые для удаления мезенхимы из эпителия. Вольфрам иглы также может быть использован.
			Таблица 2. Оборудование, используемое в SMG рекомбинации протокол.