Tükürük Bezi Organ Kültürleri Genetik Modifikasyon ve Rekombinasyon

Özet

Genetik bütünü içinde epitel hücreleri manipüle etmek için bir tekniktir Ex vivo kültürlü embriyonik fare submandibular bezler (SMGs) tarif edilir. Bu yöntem, epitel ve kendiliğinden adenoviral vektörlerin epitelyal esasları ayrılması ve enfeksiyon sonrası rekombinasyona mezenşimi SMG arasında doğuştan gelen bir yetenek yararlanır.

Özet

Morfolojilerinden Dallanma birçok organların gelişim sırasında meydana gelen, ve embriyonik fare submandibular bez (SMG) morfolojilerinden dallanma çalışma için klasik bir modeldir. ^- Sonuçta oral kavite ¹ içine, sırasıyla, tükürük üretirler ve değiştirmek / taşıma hizmet asinüs ve kanalların karmaşık dallı ağı, yol vermek, epitelyal tomurcuk ve kanal oluşumu adımları iteratif geliştirme SMG, bu süreci içerir ^3. Nasıl hücresel ve moleküler olaylar henüz tam olarak anlaşılamamıştır koordine olmasına rağmen epitel ilişkili bazal membran ve bu hücreler tarafından üretilen mezenşimi hücreler, büyüme faktörleri ve ekstraselüler matriks dahil mezenkimal bölmesi, yönlerini, dallanma mekanizması için kritik olan ⁴ . Moleküler mekanizmaların çalışmada epitelyal morfolojilerinden gelişmeler gelişim mekanizmalarına anlayışımızı sürüş ve olası Rejenere içgörü sağlarative tıp yaklaşımları. Bu tür çalışmalar tükrük epitelin genetik manipülasyonu için etkili yöntemlerin eksikliği nedeniyle sekteye edilmiştir. Şu anda, adenoviral transdüksiyon vivo ⁵ yetişkin bezlerinin epitel hücrelerini hedef için en etkili yöntem temsil eder. Ancak, embriyonik eksplantlar, yoğun mezenşimi ve epitel hücreleri çevreleyen bazal membran epitel hücreleri viral erişimi engellemektedir. Mezenşim çıkarılırsa, epitelyum adenovirüsler kullanılarak transfekte edilebilir ve epitel esaslar Matrigel ya da laminin-111 ^6,7 varlığında, morfojenezi dallanma devam edebilir. Mesenchyme serbest epitelyal yitiren organ büyüme de çözünür büyüme faktörleri ile ek takviyesi gerektirir ve bozulmamış bezleri ⁸ oluşuyor gibi tamamen dallanma morfolojilerinden özetlemek değil. Burada transfekte e epitel hücreleri ve kültür adenoviral iletimi kolaylaştıran bir yöntem tanımlamakilişkili mezenşimi ile pithelium. Embriyonik SMGs, mezenşimi çıkarılması ve bir GFP içeren adenovirüs ile epitel viral enfeksiyon mikrodisseksiyon ardından, epitel kendiliğinden sağlam SMG glandüler yapısı recapitulating ve morfonogenezi dallanma, bulaşmamış mezenşimi ile yeniden birleştirilmesi kastedilmektedir olduğunu göstermektedir. Genetiği değiştirilmiş epitel hücre popülasyonu kolayca floresan etiketli varsa adenoviral yapıları kullanılır, standart floresan mikroskobu yöntemleri kullanılarak izlenebilir. Burada açıklanan yöntem, şu anda doku rekombinasyon transgenik hayvanların üretimi gerektirmeyen bir kompleks 3B doku yapısı içinde, bir vahşi-tip ya da mutant vektör ile epitel hücrelerinin transfeksiyonu için en etkili ve ulaşılabilir bir yöntemdir.

Protokol

Protokol olarak Şekil 1 'de gösterilen dört ana adımı içerir. Tüm adımlar tam detaylı olarak açıklanmıştır. Adenovirüs yapı viral ve arıtma parçalanmış epitel esasların genetik iletiminde kullanım için organ toplama önce yapılmalıdır. Adenovirüsler ile çalışırken tüm standart BSL-2 güvenlik önlemlerine uyulmalıdır.

1. Fare Embriyonik Submandibular tükrük bezi (SMG) Hasat ve Mikrodisseksiyon

1. Embriyonik gün 13 de fare embriyo servikal dislokasyon ve hasat dizeleri (E13, 3-5 epitel tomurcukları) kurumsal IACUC tarafından onaylanan aşağıdaki prosedürleri takip CO ₂ narkoz kullanarak zamanlanmış gebe dişi farelerde (outbred zorlanma CD-1 veya ICR), Euthanize komitesi. Vajinal fişi keşif günü E0 olarak belirlenmiştir. Yarıkların sadece başlangıç ​​ile tek bir primer tomurcuk ve sap olduğunda Tükürük bezleri de E12 aşamada hasat ve kültüre edilebilirbaşlatmak için. Önce bu aşamaya SMGs burada belirtilenlerden daha farklı bir kültür koşulları gerektirir.
2. Fenol kırmızısı (Life Technologies) ve 100 U / ml penisilin ile desteklenmiş ve 100 mg / ml streptomisin (pen-strep eksik DMEM / Ham 's F12 Orta (F12) 25 ml ile dolu steril 10 cm doku kültür kaplarına embriyo dizeleri aktarın, Life Technologies).
3. Steril bir neşter (# 11 bıçak) ve forseps (# 5, Güzel Bilim Araçları 11252-20) kullanarak DMEM/F12 + kalem-strep 25 ml içeren ayrı 10 cm çanak içine Keselerden embriyolar çıkarın.
4. Sadece alt çene altında bir açılı kesim ile embriyo kafaları Sever.
5. Üst çene altındaki bir kesim kullanarak iletilen ışık tabanı (Nikon SMZ645 veya eşdeğeri) ile bir stereo mikroskop altında başları alt çene kemiklerini ayırın. Cam bir ilave parça üzerinde yerine doğrudan doğruya mikroskop baz cam bileşeni dokular yerleştirin.
6. DM, 3 ml içine alt altçeneleri toplayınEM/F12 + steril bir 35 mm doku kültürü çanak kalem strep.
7. Dil dilimin altında ama 0:00 pozisyonunda doğru bakacak şekilde diseksiyon mikroskop sahnede bir mandibula dilim yerleştirin.
8. Bir makaslama hareketi iki çarpı forseps bir tarafı kullanarak, kaldırmak ve mandibula dilim 1/3 alt ^rd atın.
9. Forseps ile makaslama kesme kullanarak dilim 90 sağa ° (sağ elini ise) ve çevirin, yarım dilim içine mandibula dilimin üst kısmı (dil kesmeden) kesti.
10. Peel aşırı uzak doku ve altında SMGs açığa çıkarın. Dil tabanının yakınında, her iki yandaki olacaktır.
11. Diliyle dokusu aşağı tutmak için forseps bir çift kullanarak, dilinden SMG uzak kızdırmak için diğer forseps kullanabilir. Diğer bezi için tekrarlayın.
12. Yeni bir steril 35 mm doku içine DMEM/F12 + kalem-strep 3 ml içine microdissected tükürük bezleri toplayınkültür çanak. Not: Bağlı küçük dilaltı bezi (1 tomurcuk) ile birlikte büyük submandibular bezler (3-5 epitel tomurcukları) 4. adıma atlama ve adımları 4.1, 4.3 performans ve 4.4 bozulmamış kültüre edilebilir, daha önce ^2,8 nitelendirdi.

2. Epitel yitiren organ Ayırma SMG

1. Sıra 5 (veya daha fazla) Hank'in dengeli tuz çözeltisi 200 ul (HBSS Ca eksik içeren bir cam tabanlı, 50 mm çaplı mikro çanağı (Mattek Corporation, P50G-1.5-14-F) içine tükürük bezleri ^{+ +} ve Mg ^{+ +,} Life Technologies) ihtiva eden% 0.4 (v / v) dispase (Life Technologies, Cat. no. 17105-041) ve 37 'de 15 dakika inkübe ° C.
2. Inkübasyondan sonra, steril bir 200 ul pipet kullanarak, dikkatli bezleri bozmadan dispase çözüm aspire. Hemen BSA (DMEM/F12-BSA, bir 0.22 um filtre ile önceden sterilize) dispase nötralize etmek için% 5 (w / v) içeren DMEM/F12 ortamı 200 ul ilave edin.
3. bir diseksiyon mikroskobu altında, ince ipuçları (# 5 Dumostar, Güzel Bilim Araçları 11295-20) ile forseps bir çift kullanarak, yavaşça epitel dokunmadığınızdan özen SMG epitel tomurcukları ve kanalların etrafında gevşetti mezenşimi ayırmak .
4. Pre-ıslak steril bir 200 ul pipet DMEM/F12-BSA medya ile ucu hafifçe DMEM/F12 200 ul + kalem-strep içeren yeni bir 50 mm çaplı mikro yemeğin içine epitel esasları üzerinden Pipeti. Pürüzsüz bir kenar ile yüksek kalitede 200 ul pipet kullanın.
5. Mezenşimi parçaları içeren çanak olarak, sublingual bezler ve herhangi bir müstakil submandibular bez tomurcukları da dahil olmak üzere herhangi bir non-mezenkimal doku atın.

3. Epitel Esaslar adenoviral enfeksiyonu

1. Elde edilen solüsyon bir titre 1x10 ⁸ -10 ⁹ PFUs böylece bir mikrosantrifüj tüpü içinde DMEM/F12 + kalem-Strep ilgi adenovirüs seyreltilmesi ile viral enfeksiyon medya 200 ul edin.başka virüsler için gereken optimum titresi değişebilir. Bu, sezyum klorür (CsCl)-saflaştırılmış optimum etkinlik alımı için viral preparatları kullanmak için önemlidir.
2. Beş epitel esasları içeren çanak ortamı çıkarın. Hızla her zaman esasları ıslak tutulması, enfeksiyon medyanın 200 ul ekleyin. Virüs taşıma ve kontamine pipet ipuçları atılmasının gerekli önlemleri alın. % 10 çamaşır suyu çözeltisi ile herhangi bir virüs bulaşmış yüzeyler dezenfekte edin.
3. Birbirine yapışmasını önlemek ve onları plakanın alt yerleşmek için izin vermek için forseps ile uzak birbirinden epitelyal esasları taşıyın. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca ortam içinde viral esaslar inkübe edin. Onlar birbirine yakın taşırsanız inkübasyon sırasında, esasları ayırın. Aşırı sallanan veya hareket bezlerinin bir araya gelme sağlayacaktır.
4. Inkübasyondan sonra, yavaşça viral içeren ortamı çıkarın ve uygun atın, r bozmaya özenudiments. DMEM/F12 + kalem strep 200 ul ekleyin. Bu yıkama en az iki kez daha tekrarlayın ve DMEM/F12 + kalem strep medyanın 200 ul ile değiştirin. Bunlar yıkar güçlü epitel bağlı olmayan herhangi bir virüs kaldırmak için ve mezenşimi enfeksiyonu önlemek için kritik öneme sahiptir.
5. DMEM/F12, 200 ml% 2 içeren epitelyal esaslar inkübe (v / v), 20 dakika boyunca Matrigel (BD Biosciences, 356.231). Biz, Matrigel içinde bu kısa inkübasyon ilk kültür periyodu boyunca mevcut yarıkların regresyon en aza indirir bulmak, ancak bu adım Matrigel maruz arzu edilmediği takdirde ile vazgeçilebilir.

Rekombine SMGs 4. Ex vivo Kültür

1. Bir dişli (küçük bir kesim) üstüne, bir ön-ıslak 200 ul pipet kullanarak her yitiren organ, bir defada tek bir koyun 13 mm, 0,1 mikron kültür ortamı 200 ul (üzerinde yüzen Nuclepore İz-Etch membran filtreden (Whatman) cam zeminli bir mikro plaka 5 esasları / filtre). Kültür besiyerişudur: DMEM/F12 + kalem-strep 50 ug / ml transferin ve 150 ug / ml askorbik asit, daha önce tarif ^2.8 içeren. Transferrin sağkalım uyardığı bilinmektedir ve tükürük bezi ve diğer organ eksplantları ⁹ morfolojilerinden dal. Askorbik asit ilavesi SMG dallanma uyardığı gösterilmiştir. ¹⁰ bu metabolik yolların (örneğin kollajen lif oluşumu sırasında ¹¹ prolin hidroksilasyon gibi) birçok hidroksilasyon reaksiyonlarında bir kofaktör olarak hareket etmek ve aynı zamanda bilinen diğer organ eksplantlar olarak fibronektin ve laminin üretimini uyarır ^12.
2. Her epitel yitiren organ ekledikten sonra mümkün olduğunca filtrenin üstüne kadar medya olarak çıkarın. Filtrenin üstünde çok fazla medya az medya esasları yerleştirme yapar iken, filtre batmaya neden olabilir ve çok daha kolay mezenşimin olabilir. Aşırı medya bir pipet ucu ile ya da uçları arasındaki medya bir pens ile ya da çıkarılabilir.
3. Sıra mezenşimi adet fro türetilmiştirüst ve / veya her epitel yitiren organ çevresindeki m 3-4 bezleri. Uzaklıkta esasları gelen mezenşimi hareketi önlemek için bezleri çevreleyen herhangi bir ekstra ortamları çıkarın. Daha bezlerinden kaynaklanan mezenşimin yararlı değildir, ancak daha az epitel yitiren organ büyümesi için zararlı olabilir.
4. İstendiğinde, 48 -72 saat boyunca 37 ° C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi (% 95 hava /% 5 _CO2) içinde rekombine SMGs inkübe edin.
5. Aydınlık ve / veya floresan 0 saat canlı bezlerinin görüntüleri (istenirse), rekombinasyon sonra 2 saat ve bir 4X veya 5X büyütme objektif kullanarak dijital kamera ile donatılmış bir, ters dik, ya da stereo mikroskopta bundan sonra her 24 saat Edinme görünümü tek bir çerçeve içinde tüm rekombine bezi yakalamak. Tükürük bezi Görüntüler ışık yolu (ki tam otomatik mikroskoplar üzerine yazdırmak mümkün değildir) yarısına kadar yerleştirilmiş aydınlık ayarı veya uygun faz halkasını kullanarak en iyi kontrast gösterir. Standart faz kontrast hayırgerekli t bezi kalın ve yana kontrast oluşturur.
6. Istenen zaman noktalarında, rekombine SMGs% 5 (w / v) sakaroz (daha iyisi hücreler tutarak iç hücre yapısını muhafaza ihtiva eden 1X PBS içinde% 2'lik paraformaldehid (PFA) yapılmış sabitleştirici solüsyonu ile 20 dakika boyunca sabit olabilir Bir isosmotic devlet). Sabitleştirici tamamen tespit sonrası çıkartılırsa,% 4 aksine PFA,% 2 PFA GFP sinyali önemli miktarda muhafaza edecektir. Bezler 4 karanlıkta 1X PBS içinde 1 hafta kadar süreyle saklanabilir ° C bütün montaj immünsitokimya ve konfokal görüntüleme yapılana kadar, önceden ^3,6,13-15 bildirdi. İdeal immünsitokimya ve görüntüleme en iyi kalitede görüntü elde etmek için fiksasyon kısa bir süre sonra yapılmalıdır. Bezler da Western blot analizi ile SDS-PAGE için RIPA tamponu içinde lize edilebilir.

Sonuçlar

Büyük deneysel adımların akış Şekil 1 'de özetlenmiştir. Bozulmamış bir SMG, izole edilmiş bir epitel yitiren organ, ve karşılık gelen mezenşim bir örneği, Şekil 2'de gösterilmiştir. Belirtilen zaman için ex vivo kültive, Şekil 3 'de gösterilmiştir zaman morfojenezi dallanma geçmesi devam rekombine SMGs, bir aydınlık görüntüler. Epitel GFP ifade eden, 48 saat süreyle yetiştirilir Rekombine bezi

Tartışmalar

Ex vivo epitelyal-mezenkimal rekombinasyon tekniği ilk kez 1981 ¹⁶ submandibular tükürük bezleri için yayınlandı. Bu protokol, biz bir rekombine bezinin kapsamında epitel hücre gen ekspresyonu işlemek için adenoviral infeksiyonun kullanarak, orijinal yöntem geliştirmektedir. Biz enfekte hücrelerin yüzdesi viral promotör özellikleri, viral titresi ve viral saflık bağlıdır ise epitel hücrelerinin yüzdesi, adenovirüs ile enfekte olduğunu göstermektedir. Biz bu verimli transdük...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar
Fenol kırmızısı olmadan DMEM / Ham 's F12 Orta	Yaşam Teknolojileri	21041-025
Penisilin ve Streptomisin	Yaşam Teknolojileri	15070-163	10X stok
Dispase	Yaşam Teknolojileri	17105-041	Tek kullanımlık alikotları dondurun at-20C
BSA	Sigma	A2934-100G	Fraksiyon V, düşük endotoksin
Adeno-X-GFP	BD Biosciences	8138-1	Yüksek titrede (1x10 10 pfu / ml) olmalı. CsCl saflaştırılmış virüs bu tahlil içinde virüsler kolon saflaştırılmış daha etkili olduğu görülmüştür.
% 16 paraformaldehit	Elektron Mikroskobu Bilimleri	15710	% 5 sakkaroz (w / v) ile PBS içinde% 2 ile seyreltildi
1X fosfat-tamponlu salin (PBS)	Yaşam Teknolojileri	70011-044	10X stok hazırlandı
Hank Dengeli Tuz Çözeltisi	Yaşam Teknolojileri	14175095	Hiçbir Kalsiyum, Magnezyum hayır, hayır Fenol Kırmızısı
Transferrin	Sigma	T8158	25 mg / ml DMEM/F12 ortamı içinde stok çözeltisi. Tek kullanımlık alikotları at-20C dondurun
L-Askorbik asit (C vitamini)	Sigma	A4403	DMEM/F12 media.Freeze tek kullanımlık alikotları 75 mg / ml stok çözelti-20C
			Tablo 1. Rekombinasyon protokol SMG için gerekli ayıraçlar listesi.
10 cm steril plastik tabaklar	Corning	430167	Non-doku kültür plakaları ile tedavi de kullanılabilir.
Iletilen ışık tabanı ile Stereo diseksiyon mikroskobu	Nikon	SMZ645	Herhangi bir stereo mikroskop kesme bir geçen ışık tabana sahip olduğu da kullanılabilir.
35 mm doku kültür tabaklarında	Şahin	353001	Non-doku kültür plakaları ile tedavi de kullanılabilir.
50 mm çaplı mikro yemekler	Mattek Corporation,	P50-G-1.5-14F
Nuclepore Parça-Etch membran filtreleri	Whatman	110405	13 mm çapında, 0.1 mm gözenek boyutu
Geniş açılı, flöresanlı bir mikroskop	Carl Zeiss, ABD	Axio Gözlemci Z1	Herhangi bir floresan mikroskop (dik, i) nverted veya mikroskop diseksiyon stereo bağlı bir dijital fotoğraf makinesi ile düşük büyütmede GFP ifade izlemek için kullanılabilir.
Konfokal mikroskop	Leica Microsystems	TCS SP5	Konfokal mikroskopi detaylı hücre yapıları görmek için gereklidir. Herhangi bir konfokal mikroskop kullanılır.
Zamanlı-Hamile dişi farelerde, gerginlik CD-1 veya ICR	Charles River Laboratuvarları		Embriyolar gün 13 (gün 0 olarak belirlenmiş fiş keşif gün) hasat edilir.
Neşter bıçağı # 11	Güzel Bilim Araçları	10011-00
Bisturi sapı # 3	Güzel Bilim Araçları	10003-12
Dumont # 5 forseps inox alaşım, 0.05mm X 0.02mm	Güzel Bilim Araçları	11252-20	Embriyolardan bezleri hasat için ideal
Dumont # 5 forseps dumostar alaşım, 0.05mm X 0.01mm	Güzel Bilim Araçları	11295-20	İnce ipuçları epitel mezenşim çıkarılması için gereklidir. Tungsten iğneler de kullanılabilir.
			Tablo 2. Ekipman rekombinasyon protokolü SMG kullanılır.