Genetic Modification und Rekombination von Speicheldrüsen Organkulturen

Zusammenfassung

Eine Technik, genetisch zu manipulieren Epithelzellen innerhalb der gesamten Ex vivo Kultivierten embryonalen Maus submandibularis (SMGs) mit viralen Gentransfer beschrieben. Diese Methode nutzt die angeborene Fähigkeit der SMG Epithel und Mesenchym spontan nach der Trennung und Infektion von Epithelzellen Rudimente mit adenoviralen Vektoren rekombinieren.

Zusammenfassung

Branching Morphogenese tritt während der Entwicklung vieler Organe und die embryonale Maus submandibularis (SMG) ist ein klassisches Modell für die Untersuchung der Verzweigung Morphogenese. In der sich entwickelnden SMG beinhaltet dieses Verfahren iterativen Schritten von epithelialen Knospe und Kanal Formation, um letztendlich Anlass zu einem komplexen verzweigtes Netzwerk von Acini und Leitungen, die zu erzeugen und zu modifizieren / transportieren den Speichel bzw. in die Mundhöhle ¹ dienen ^{- 3.} Das Epithel-assoziierten Basalmembran und Aspekte der mesenchymalen Abteil, einschließlich der Mesenchymzellen, Wachstumsfaktoren und der extrazellulären Matrix, die von diesen Zellen produziert werden, sind für die Verzweigungsmechanismus, obwohl, wie die zellulären und molekularen Ereignisse koordiniert bleibt kaum verstanden ⁴ . Die Untersuchung der molekularen Mechanismen, die epithelialen Morphogenese unser Verständnis von Entwicklungsstörungen Mechanismen und bietet einen Einblick in mögliche Regenerationtive Medizin Ansätze. Solche Studien wurden aufgrund des Mangels an effektiven Methoden zur genetischen Manipulation der Speicheldrüse Epithel behindert. Derzeit stellt adenovirale Transduktion die effektivste Methode für die Ausrichtung Epithelzellen in der Erwachsenenbildung Drüsen in vivo ^5. Doch in embryonalen Explantate behindert dichten Mesenchym und die Basalmembran umgibt die Epithelzellen viralen Zugang zu den Epithelzellen. Wenn die Mesenchym entfernt wird, kann das Epithel transfiziert mit Adenoviren werden, und wieder aufgenommen werden kann epithelialen Rudimente Verzweigungsmittel Morphogenese in Gegenwart von Matrigel oder Laminin-111 ^6,7. Mesenchym-free epithelialen Rudiment Wachstum erfordert auch zusätzliche Nahrungsergänzung mit löslichen Wachstumsfaktoren und nicht vollständig rekapitulieren Verzweigung Morphogenese, wie es in intakten Drüsen ⁸ auftritt. Hier beschreiben wir eine Technik, die adenovirale Transduktion von Epithelzellen und Kultur der transfizierten e erleichtertpithelium mit zugehörigen Mesenchym. Nach Mikrodissektion der embryonalen Maschinenpistolen, Entfernung des Mesenchym und Virusinfektion des Epithels mit einem GFP-haltigen Adenovirus zeigen wir, dass das Epithel sich spontan rekombiniert mit nichtinfizierten Mesenchym rekapituliert intakten SMG glandulären Strukturen und Verzweigungsmittel Morphogenese. Die gentechnisch veränderten epithelialen Zell-Population kann leicht überwacht werden unter Verwendung von Standard Fluoreszenzmikroskopie Methoden, wenn Fluoreszenz-markierten adenovirale Konstrukte verwendet werden. Das Gewebe Rekombination hier beschriebene Verfahren ist derzeit das wirksamste und zugänglich Verfahren zur Transfektion von epithelialen Zellen mit einem Wildtyp-oder mutierten Vektor innerhalb eines komplexen 3D Gewebekonstrukt, das keine Erzeugung transgener Tiere.

Protokoll

Das Protokoll enthält vier wesentliche Schritte, wie in Abbildung 1 dargestellt. Alle Schritte werden ausführlich beschrieben. Adenovirus Konstruktion und viralen Reinigung sollte vor der Organraub zur Verwendung in der genetischen Transduktion seziert epithelialen Rudimente durchgeführt werden. Alle Standard-BSL-2 Vorsichtsmaßnahmen sollten bei der Arbeit mit Adenoviren werden.

Ein. Maus Embryonale submandibularis (SMG) Ernte und Mikrodissektion

1. Einschläfern timed-schwangeren weiblichen Mäusen (Auszuchtstamm CD-1-oder ICR) mit CO ₂ Narkose, durch Genickbruch und Ernte Saiten Maus-Embryonen am embryonalen Tag 13 (E13, 3-5 Epithelknospen) folgenden Verfahren durch den institutionellen IACUC zugelassen, gefolgt Ausschuss. Der Tag der vaginalen Plug Entdeckung wird als E0 bezeichnet. Speicheldrüsen können auch geerntet und auf dem E12 Bühne kultiviert werden, wenn es eine einzige primäre Knospe und Stiel mit Klüften gerade erst anfangenzu initiieren. SMGs vor diesem Zeitpunkt erfordern unterschiedliche Kulturbedingungen als die hier angegebenen.
2. Übertragen Embryos Strings in sterile 10 cm Zellkulturschalen mit 25 ml DMEM / Ham 's F12 Medium (F12) fehlen Phenolrot (Life Technologies) und ergänzt mit 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin (Pen-Strep gefüllt, Life Technologies).
3. Mit einem sterilen Skalpell (# 11 Klingen) und Pinzette (# 5, Fine Science Tools, 11252-20), entfernen Sie die Embryonen aus den Säcken in einem separaten 10 cm Schale mit 25 ml DMEM/F12 + Pen-Strep.
4. Sever die Embryos Köpfe mit einer abgewinkelten kurz unterhalb des Unterkiefers.
5. Isolieren Sie die unteren Kiefer aus den Köpfen unter einem Stereomikroskop Seziermikroskop mit einem Durchlicht Basis (Nikon SMZ645 oder gleichwertig) mit einem Schnitt unterhalb des Oberkiefers. Legen Sie die Gewebe auf der Oberseite eine zusätzliche Stück Glas anstatt direkt auf dem Glas Bestandteil des Mikroskops.
6. Sammeln Sie die unteren Kiefer in 3 ml DMEM/F12 + Pen-Strep in einem sterilen 35 mm Gewebekulturschale.
7. Platzieren eines Unterkiefers Scheibe auf dem Präpariermikroskop Stufe, so dass die Zunge auf der Unterseite der Scheibe ist, aber in Richtung der 12:00-Uhr-Position zeigt.
8. Mit einer Seite von zwei gekreuzten Pinzette in einem scissoring Bewegung, entfernen und entsorgen Sie die untere 1/3 ^rd des Unterkiefers Scheibe.
9. Drehen der Scheibe um 90 ° nach rechts (wenn rechtshändige) und, unter Verwendung eines scissoring Schnitt mit der Zange, schneiden den oberen Teil des Unterkiefers Scheibe (ohne Schneiden der Zunge) zur Hälfte in die Scheibe.
10. Ziehen Sie die überschüssige Gewebe entfernt und entfernen Sie die Maschinenpistolen unter aussetzen. Es wird eine an jeder Seite in der Nähe der Basis der Zunge liegen.
11. Mit einem Paar Pinzette halten das Gewebe durch die Zunge, verwenden Sie die anderen Pinzette, um die SMG necken weg von der Zunge. Wiederholen Sie dies für die anderen Drüse.
12. Sammeln Sie die mikrodissezierten Speicheldrüsen in 3 ml DMEM/F12 + Pen-Strep in eine neue sterile 35 mm Gewebe-Kulturschale. Hinweis: Die größeren submandibularis (3-5 Epithelknospen) zusammen mit dem angeschlossenen kleineren sublingualis (1 Knospe) kultiviert werden können intakt durch Überspringen zu Schritt 4 und Durchführen der Schritte 4,1, 4,3 und 4,4, wie zuvor beschrieben ^2,8.

2. SMG Epithelial Rudiment Separation

1. Platz 5 (oder mehr) Speicheldrüsen in einen Glasboden, Durchmesser 50 mm Mikrotiter Schale (MatTek Corporation, P50G-1.5-14-F) mit 200 ul balanced salt Hank-Lösung (HBSS fehlt Ca ^{+ +} oder Mg ^{+ +,} Life Technologies) mit 0,4% (v / v) Dispase (Life Technologies, cat. Nr. 17105-041) und Inkubation für 15 min bei 37 ° C.
2. Nach der Inkubation mit einem sterilen 200 ul Pipettenspitze vorsichtig absaugen das Dispase-Lösung, ohne die Drüsen. Sofort im 200 ul DMEM/F12 Medium mit 5% (w / v) BSA (DMEM/F12-BSA, mit einer 0,22 um Filter vorsterilisierten), um die Dispase neutralisieren.
3. Unter einem Binokular mit einer Pinzette mit feinen Spitzen (# 5 Dumostar, Fine Science Tools, 11295-20), sanft trennen den gelösten Mesenchym aus der ganzen SMG Epithelknospen und Kanäle, wobei darauf zu verlassen, das Epithel intakt .
4. Pre-wet eine sterile 200 ul Pipettenspitze mit DMEM/F12-BSA Medien und vorsichtig pipettieren Sie die Epithelzellen Rudimente in eine neue 50 mm Durchmesser Mikrowell Schale mit 200 ul DMEM/F12 + Pen-Strep. Verwenden Sie ein hochwertiges 200 ul Pipettenspitze mit einem glatten Rand.
5. In der Schale, die Mesenchym Stücke enthält, verwerfen alle nicht-mesenchymale Gewebe einschließlich der sublingualen Drüsen und alle freistehenden submandibularis Knospen.

3. Adenoviralen Infektion Epithelial Rudiments

1. Make 200 ul Virusinfektion Medien durch Verdünnen des Adenovirus von Interesse in DMEM/F12 + Pen-Strep und in ein Mikrozentrifugenröhrchen, so dass der Titer der resultierenden Lösung 1x10 ⁸ -10 ⁹ PFUs ist. Dieoptimale Titer für verschiedene Viren erforderlich kann variieren. Es ist wichtig, Cäsiumchlorid (CsCl)-gereinigte virale Zubereitungen zur optimalen Aufnahme Effizienz zu verwenden.
2. Entfernen Sie die Medien aus der Schüssel mit den fünf epithelialen Rudimente. Schnelles Hinzufügen von 200 ul der Infektion Medien, halten die Rudimente nassen zu allen Zeiten. Die notwendigen Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit dem Virus und Entsorgung kontaminierter Pipettenspitzen. Desinfizieren Sie alle Virus-kontaminierten Oberflächen mit 10% Bleichlösung.
3. Verschieben Sie die Epithelzellen Rudimente weit voneinander entfernt mit einer Pinzette, um sie nicht zusammenkleben und ihnen zu ermöglichen, um die Unterseite der Platte zu begleichen. Inkubieren Rudimente in viralen Medien für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Während der Inkubation, trennen Sie die Ansätze, wenn sie nahe beieinander bewegen. Übermäßige rocking oder Bewegung ermöglicht die Drüsen zu verklumpen.
4. Nach der Inkubation, entfernen die viralen-haltigen Medien und entsorgen entsprechend, kümmert sich nicht um die r störenudiments. Fügen Sie 200 ul DMEM/F12 + Pen-Strep. Wiederholen Sie diesen wash mindestens zwei weitere Male und ersetzen mit 200 ul DMEM/F12 + Pen-Strep Medien. Diese Waschmittel sind kritisch für alle Viren, die nicht stark mit den Epithelien befestigt zu entfernen und um die Infektion der Mesenchym verhindern.
5. Inkubieren epithelialen Rudimente mit 200 ml DMEM/F12, enthaltend 2% (v / v) Matrigel (BD Biosciences, 356.231) für 20 min. Wir finden, dass diese kurze Inkubation in Matrigel die Regression von vorhandenen Klüften minimiert während der anfänglichen Züchtungsperiode, aber dieser Schritt kann entfallen, wenn die Exposition gegenüber Matrigel nicht erwünscht verzichtet werden.

4. Ex vivo Kultur rekombinierte SMGs

1. Legen Sie jedes Rudiment, ein zu einer Zeit, mit einem Pre-wet 200 ul Pipettenspitze auf einem gekerbten (klein geschnitten) 13 mm, 0,1 um Nuclepore Track-Etch Membranfilter (Whatman) schwimmt über 200 ul von Kulturmedien ( 5 Rudimente / Filter) in einem Glasboden-Mikrotiterplatte. Die Kulturmedienist: DMEM/F12 + Pen-Strep die 50 ug / ml Transferrin und 150 ug / ml Ascorbinsäure, wie zuvor ^2,8 beschrieben. Transferrin ist bekannt, dass das Überleben zu stimulieren und Verzweigung Morphogenese der Speicheldrüse und andere Organe Explantate ^9. Zusatz von Ascorbinsäure wurde gezeigt, stimulieren SMG Verzweigung. ^10. Es ist bekannt, dass als Cofaktor in vielen Hydroxylierungsreaktionen von Stoffwechselwegen (wie Prolin Hydroxylierung während Kollagen Faserbildung ¹¹⁾ wirken und stimuliert auch Fibronectin und Laminin Produktion in anderen Organexplantaten ^12.
2. Entfernen Sie so viel Medien auf der Oberseite des Filters wie möglich nach Zugabe jeder Epithelzellen Rudiment. Too much media auf der Oberseite des Filters kann der Filter zu sinken, während weniger Medien macht Platzierung der Rudimente und Mesenchym viel einfacher. Excess Medien können entweder mit einer Pipettenspitze oder mit einer Pinzette, um die Medien zwischen den Spitzen greifen entfernt werden.
3. Ort Mesenchym Stücke stammen from drei vor vier Drüsen auf der Oberseite und / oder um jeden epithelialen Rudiment. Nehmen Sie etwaige zusätzliche Medien, die rund um die Drüsen auf die Bewegung des Mesenchym weg von den Grundlagen zu vermeiden. Mesenchym stammt aus mehr Drüsen ist nicht förderlich, aber weniger kann sich nachteilig auf epithelialen Rudiment Wachstum.
4. Inkubieren rekombinierten SMGs in einem befeuchteten Inkubator (95% Luft / 5% CO ₂₎ bei 37 ° C für 48 -72 h, wie gewünscht.
5. Erwerben Hellfeld und / oder fluoreszierende Bilder von Live-Drüsen bei 0 h (falls gewünscht), 2 Stunden nach Rekombination und alle 24 Stunden danach auf einer invertierten, aufrecht, oder Stereo-Lichtmikroskop mit einer Digitalkamera mit einem 4x oder 5x Vergrößerung Ziel ausgestattet erfassen die gesamte rekombinierten Drüse in einem einzelnen Frame Ansicht. Bilder der Speicheldrüse zeigen die besten Kontrast entweder mit dem Hellfeld Einstellung oder die entsprechende Phase Ring platziert einen Teil des Weges in den Strahlengang (das ist nicht voll automatisierte Mikroskope möglich). Standard Phasenkontrast keinet notwendig, da die Drüse ist dick und schafft Kontrast.
6. An den gewünschten Zeitpunkten, können rekombinierte SMGs für 20 Minuten mit Fixiermittel Lösung von 2% Paraformaldehyd (PFA) in 1X PBS, enthaltend 5% (w / v) Saccharose (besser zu erhalten internen zellulären Struktur, indem die Zellen in gemacht festgesetzt ein isosmotische Zustand). Anders als 4% PFA, 2% PFA wird bewahren eine signifikante Menge des GFP-Signals, wenn das Fixiermittel vollständig nach der Fixierung entfernt wird. Drüsen können für bis zu speichernden 1 Woche in 1X PBS im Dunkeln bei 4 ° C bis whole mount Immunzytochemie und konfokale Bildgebung durchgeführt, wie zuvor berichtet ^3,6,13-15. Idealerweise sollte Immunzytochemie und Bildgebung bald nach Fixierung durchgeführt werden, um die beste Bildqualität zu erhalten. Drüsen kann auch in RIPA-Puffer für SDS-PAGE durch Western-Blotting-Analyse verfolgt, lysiert werden.

Ergebnisse

Die Strömung der großen experimentellen Schritte ist in 1 skizziert. Ein Beispiel eines intakten SMG, einem isolierten Epithelzellen Rudiment, und seine entsprechende Mesenchym sind in Abbildung 2 gezeigt. Hellfeld Bilder von rekombinierten Maschinenpistolen, die zu unterziehen Verzweigungsmittel Morphogenese bei kultivierten ex vivo für die angegebenen Zeiten, in Abbildung 3 dargestellt fort. Rekombinierte Drüsen für 48 hr exprimieren epi...

Diskussion

Die ex vivo epitheliale-mesenchymale Rekombination Technik wurde erstmals für submandibular Speicheldrüsen im Jahr 1981 ¹⁶ veröffentlicht. Bei diesem Protokoll, wir auf die ursprüngliche Methode erweitern, unter Verwendung adenoviraler Infektion Epithelzelle Genexpression im Kontext eines rekombinierten Drüse manipulieren. Wir zeigen, dass ein Prozentsatz der Epithelzellen mit dem Adenovirus infiziert sind, während der Prozentsatz an Zellen, die infiziert sind, hängt von den Eigenschaften des ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenz	Firma	Catalog Number	Kommentare
DMEM / Ham 's F12 Medium ohne Phenolrot	Life Technologies	21041-025
Penicillin und Streptomycin	Life Technologies	15070-163	10X Lager
Dispase	Life Technologies	17105-041	Frieren Sie den einmaligen Gebrauch Aliquots bei-20C
BSA	Sigma	A2934-100G	Fraction V, niedrige Endotoxin
Adeno-X-GFP	BD Biosciences	8138-1	Sollte hohe Titer (1x10 10 pfu / ml) betragen. CsCl gereinigten Viren sind wirksamer als säulengereinigt Viren in diesem Assay.
16% Paraformaldehyd	Electron Microscopy Sciences	15710	Verdünnt auf 2% in PBS mit 5% Sucrose (w / v)
1X Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS)	Life Technologies	70011-044	Hergestellt aus 10X Lager
Hanks Balanced Salt Solution	Life Technologies	14175095	kein Calcium, kein Magnesium, kein Phenol Red
Transferrin	Sigma	T8158	25 mg / ml Stammlösung in DMEM/F12 Medien. Frieren Einweg-Aliquots bei-20C
L-Ascorbinsäure (Vitamin C)	Sigma	A4403	75 mg / ml Stammlösung in DMEM/F12 media.Freeze Einweg-Aliquots bei-20C
			Tabelle 1. Liste der Reagenzien für SMG Rekombination Protokoll erforderlich.
10 cm sterile Plastikschalen	Corning	430167	Nicht-Gewebekultur-behandelten Platten können ebenfalls verwendet werden.
Stereo Binokular mit Durchlichtbasis	Nikon	SMZ645	Jede Stereo Präpariermikroskop können verwendet, das eine Durchlichtbasis werden.
35 mm-Gewebekulturschalen	Falke	353001	Nicht-Gewebekultur-behandelten Platten können ebenfalls verwendet werden.
50 mm Durchmesser Mikrowell Gerichten	MatTek Konzern	P50-G-1.5-14F
Nuclepore Track-Etch Membranfilter	Whatman	110405	13 mm Durchmesser, 0,1 mm Porengröße
Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop	Carl Zeiss, USA	Axio Observer Z1	Jede Fluoreszenzmikroskop (aufrecht, inverted oder Stereo Präpariermikroskop) kann zum GFP-Expression bei geringer Vergrößerung überwachen mit angeschlossenem digitalen Kamera werden.
Konfokalmikroskop	Leica Microsystems	TCS SP5	Konfokale Mikroskopie ist notwendig, um detaillierte Zellstrukturen zu sehen. Jede Konfokalmikroskop können verwendet werden.
Timed-schwangeren weiblichen Mäusen, Stamm CD-1-oder ICR	Charles River Labs		Embryonen werden am Tag 13 (mit Tag der Plug Entdeckung als Tag 0 bezeichnet) geerntet.
Skalpellklingen Nr. 11	Fine Science Tools	10011-00
Skalpellgriff # 3	Fine Science Tools	10003-12
Dumont Nr. 5 Zangen inox-Legierung, 0,05 X 0,02 mm	Fine Science Tools	11252-20	Ideal für die Ernte Drüsen aus Embryonen
Dumont Nr. 5 Zangen dumostar Legierung, 0,05 X 0,01 mm	Fine Science Tools	11295-20	Feine Spitzen zum Entfernen von Mesenchym aus Epithel erforderlich. Wolframnadeln können ebenfalls verwendet werden.
			Tabelle 2. Ausrüstung in SMG Rekombination Protokoll verwendet.