Modification génétique et la recombinaison des cultures d'organes salivaires Gland

Résumé

Une technique pour manipuler génétiquement les cellules épithéliales au sein de l'ensemble Ex vivo Embryonnaires de souris en culture glandes sous-maxillaires (SMG) en utilisant le transfert de gènes viraux est décrite. Cette méthode tire parti de la capacité innée de SMG épithélium et le mésenchyme spontanément recombiner après la séparation et l'infection des rudiments épithéliales avec des vecteurs adénoviraux.

Résumé

Morphogenèse de ramification se produit pendant le développement de nombreux organes, et la glande sous-maxillaire embryonnaire de souris (SMG) est un modèle classique pour l'étude de la morphogenèse de ramification. Dans la GSM développement, ce processus itératif implique des mesures de bourgeon épithélial et conduit la formation, en fin de compte à donner naissance à un réseau ramifié de complexe acini et des canaux, qui servent à produire et à modifier / transport de la salive, respectivement, dans la cavité buccale ^{1 - 3.} La membrane basale épithéliale associée et les aspects du compartiment mésenchymateux, y compris les cellules mésenchymateuses, facteurs de croissance et la matrice extracellulaire, produites par ces cellules, sont essentiels pour le mécanisme de branchement, bien que la façon dont les événements cellulaires et moléculaires sont coordonnés reste mal comprise ⁴ . L'étude des mécanismes moléculaires de conduite avancées morphogenèse épithéliale notre compréhension des mécanismes du développement et donne un aperçu possible régénérerapproches de médecine Ative. Ces études ont été entravées par le manque de méthodes efficaces pour la manipulation génétique de l'épithélium salivaire. À l'heure actuelle, la transduction adénovirale représente la méthode la plus efficace pour cibler les cellules épithéliales des glandes adultes in vivo ^5. Toutefois, dans des explants embryonnaires, mésenchyme dense et la membrane basale entourant les cellules épithéliales entrave l'accès virale dans les cellules épithéliales. Si le mésenchyme est supprimée, l'épithélium peuvent être transfectées en utilisant des adénovirus, et rudiments épithéliales peut reprendre la morphogenèse de ramification en présence de Matrigel ou la laminine-111 ^6,7. Mésenchyme croissance sans rudiment épithélial nécessite également un supplément additionnel de facteurs de croissance solubles et n'est pas totalement récapituler morphogenèse de ramification comme cela se produit dans les glandes intactes ^8. Nous décrivons ici une technique qui facilite la transduction adénovirale des cellules épithéliales et de la culture de l'e transfectéespithelium avec mésenchyme associé. Après microdissection des PM embryonnaires, l'enlèvement du mésenchyme, et l'infection virale de l'épithélium avec un adénovirus GFP contenant, nous montrons que l'épithélium se recombine spontanément avec mésenchyme non infecté, récapitulant intacte la structure SMG glandulaire et morphogenèse de ramification. La population de cellules génétiquement modifiées épithéliale peut être facilement contrôlé en utilisant les méthodes classiques de microscopie par fluorescence, si étiquetées par fluorescence constructions adénovirales sont utilisés. Le procédé de recombinaison tissu décrit ici est actuellement la méthode la plus efficace et accessible pour la transfection de cellules épithéliales avec un vecteur de type sauvage ou mutant dans une construction complexe tissu 3D qui ne nécessite pas la production d'animaux transgéniques.

Protocole

Le protocole comporte quatre grandes étapes, comme le montre la figure 1. Toutes les étapes sont décrites en détail. Construction d'adénovirus et de purification virale doit être effectuée avant la collecte d'organes destiné à être utilisé dans la transduction génétique des ébauches découpées épithéliales. Toutes les précautions de sécurité standard BSL-2 doivent être suivies lorsque l'on travaille avec des adénovirus.

1. Embryonnaires de souris glande sous-maxillaire (SMG) Récolte et Microdissection

1. Euthanasier timed-souris femelles enceintes (souche consanguine CD-1 ou ICR) utilisant le CO ₂ narcose, suivie par dislocation cervicale et les chaînes de récolte des embryons de souris au jour embryonnaire 13 (E13, 3-5 bourgeons épithéliaux) les procédures suivantes, approuvées par le IACUC institutionnelle comité. La journée de découverte bouchon vaginal est désigné comme E0. Glandes salivaires peuvent également être récoltées et cultivées à l'étape E12 quand il ya un seul bourgeon principal et la tige avec des fentes débutantà lancer. SMG avant ce stade nécessitent des conditions de culture différentes de celles indiquées ici.
2. Transfert chaînes embryon dans stériles boîtes de 10 cm de culture de tissus remplis avec 25 ml de DMEM / Ham 's Medium F12 (F12) manque le rouge de phénol (Life Technologies) et additionné de 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine (pen-strep, Life Technologies).
3. L'aide d'un scalpel stérile (# 11 lames) et une pince (# 5, Outils Fine Science, 11252-20), retirer les embryons des sacs séparés dans une boîte de 10 cm contenant 25 ml de DMEM/F12 + stylo-streptococcique.
4. Couper les têtes d'embryons avec une coupe en biais juste en dessous de la mâchoire inférieure.
5. Isoler les mandibules inférieures des têtes sous un microscope à dissection stéréo avec une base de lumière transmise (Nikon SMZ645 ou équivalent) à l'aide d'un coupe-dessous de la mâchoire supérieure. Placez les tissus au-dessus d'une pièce supplémentaire de verre plutôt que directement sur le composant en verre de la base du microscope.
6. Recueillir les mandibules inférieures dans 3 ml de DMEM/F12 + stylo-strep dans un stérile boîte de 35 mm de culture tissulaire.
7. Déposer une tranche de la mandibule sur la platine du microscope disséquant sorte que la languette se trouve en bas de la tranche, mais est orienté vers la position 12:00 heures.
8. Utilisation d'un côté de deux pinces croisées dans un mouvement de ciseaux, retirez et jetez le ^troisième 1/3 inférieur de la tranche mandibule.
9. Mettez la tranche de 90 ° vers la droite (si droitier) et, à l'aide d'un ciseau coupe avec la pince, couper la partie supérieure de la tranche mandibule (sans couper la langue) à mi-chemin dans la tranche.
10. Pelez l'excès de tissu et retirez-le de suite pour exposer les mitraillettes dessous. Il y aura une de chaque côté à proximité de la base de la langue.
11. En utilisant une paire de pinces pour maintenir le tissu par la langue, utilisez la pince pour taquiner les autres SMG loin de la langue. Répétez l'opération pour l'autre glande.
12. Recueillir les glandes salivaires microdisséqués dans 3 ml de DMEM/F12 + stylo-strep dans un nouveau tissu stérile 35 mmboîte de culture. Remarque: les glandes sous-maxillaires plus grands (3-5 bourgeons épithéliaux) le long de la glande sublinguale connecté petite (1 bouton) peuvent être cultivées intactes en accédant directement à l'étape 4 et l'exécution des étapes 4.1, 4.3, et 4.4, comme décrit précédemment ^2,8.

2. SMG séparation Rudiment épithéliale

1. Lieu 5 (ou plus) des glandes salivaires dans un fond de verre, 50 mm de diamètre micropuits plat (MatTek Corporation, P50G-1.5-14-F) contenant 200 ul de solution saline équilibrée de Hank (HBSS dépourvu de Ca ^{+ +,} Mg ^{+ +,} Life Technologies) contenant 0,4% (v / v) dispase (Life Technologies, cat. no. 17105-041) et incuber pendant 15 min à 37 ° C.
2. Après l'incubation, à l'aide d'une pipette stérile 200 pi, aspirer délicatement la solution dispase sans perturber les glandes. Immédiatement ajouter 200 ul de milieu contenant DMEM/F12 5% (p / v) de BSA (DMEM/F12-BSA, pré-stérilisé avec un filtre 0,22 pm) pour neutraliser la dispase.
3. Sous la loupe binoculaire, à l'aide d'une pince à pointes fines (# 5 Dumostar, Outils Fine Science, 11295-20), séparez doucement le mésenchyme desserré autour des bourgeons SMG épithéliales et les conduits, en prenant soin de laisser l'épithélium intact .
4. Pré-humide et stérile pointe de la pipette 200 ul avec DMEM/F12-BSA médias et pipeter doucement sur les rudiments épithéliales dans un nouveau diamètre de 50 mm micropuits plat contenant 200 pi de DMEM/F12 + stylo-streptococcique. Utilisez une haute qualité 200 ul pointe de la pipette avec un bord lisse.
5. Dans le plat qui contient les pièces mésenchyme, jeter tout tissu non-mésenchymateuse, y compris les glandes sublinguales et les bourgeons détachés des glandes sous-maxillaires.

3. L'infection adénovirale de Rudiments épithéliales

1. Faire 200 ul de médias infection virale en diluant l'adénovirus d'intérêt en DMEM/F12 + stylo-streptococcique dans un microtube de sorte que le titre de la solution résultante est de 1x10 ⁸ -10 ⁹ PFU. Latitre optimal requis pour les différents virus peuvent varier. Il est important d'utiliser du chlorure de césium (CsCl)-purifiée préparations virales de l'efficacité d'absorption optimale.
2. Retirez le support de la boite contenant les cinq rudiments épithéliales. Rapidement ajouter 200 ul des médias infection, en gardant les rudiments humide en tout temps. Prendre les précautions nécessaires lors de la manipulation du virus et l'élimination des embouts de pipettes contaminées. Désinfectez toutes les surfaces contaminées par des virus avec une solution javellisée à 10%.
3. Déplacez les rudiments épithéliales loin les uns des autres avec des pinces pour les empêcher de coller ensemble et de leur permettre de se déposer au fond de la plaque. Incuber rudiments dans les médias viraux pendant 1 heure à température ambiante. Pendant l'incubation, séparer les rudiments, si elles se déplacent côte à côte. Balancement excessif ou mouvement permettra aux glandes à s'agglutiner.
4. Après incubation, retirer délicatement les médias virale contenant et le jeter de façon appropriée, en prenant soin de ne pas perturber le rudiments. Ajouter 200 ul de DMEM/F12 + stylo-streptococcique. Répéter ce lavage au moins deux fois plus et remplacez-le par 200 pi de DMEM/F12 + stylo-strep médias. Ces lavages sont essentielles pour éliminer tout virus qui n'est pas très attaché à l'épithélium et à prévenir l'infection du mésenchyme.
5. Incuber rudiments épithéliales avec 200 ml de DMEM/F12 contenant 2% (v / v) Matrigel (BD Biosciences, 356 231) pendant 20 min. Nous constatons que cette incubation courte Matrigel minimise la régression des fentes existantes pendant la période de culture initiale, mais cette étape peut être supprimée si l'exposition à Matrigel n'est pas souhaitée.

4. Culture ex vivo de mitraillettes recombinés

1. Placez chaque rudiment, un à la fois, en utilisant un pré-mouillage pointe de la pipette 200 ul, au sommet d'une encoche (petite coupure) 13 mm, 0,1 um Nuclepore membrane Track-Etch filtre (Whatman) flottant sur 200 pi de milieu de culture ( 5 / rudiments de filtre) dans une plaque de microtitration à fond de verre. Les milieux de cultureest la suivante: DMEM/F12 + stylo-strep contenant 50 ug / ml de transferrine et 150 l'acide ascorbique pg / ml, comme décrit précédemment ^2,8. La transferrine est connue pour stimuler la survie et la morphogenèse de ramification des glandes salivaires et des explants d'organes autres ^9. L'addition d'acide ascorbique a été montré pour stimuler la ramification SMG. ¹⁰ Il est connu pour agir comme cofacteur dans de nombreuses réactions d'hydroxylation de voies métaboliques (telles que l'hydroxylation de proline au cours de la formation de fibres de collagène ¹¹⁾ et stimule également la production de fibronectine et la laminine dans des explants d'autres organes ^12.
2. Retirez les médias comme beaucoup sur le dessus du filtre que possible après l'ajout de chaque rudiment épithélial. Trop de médias sur le dessus du filtre peut entraîner le filtre à couler, tandis que les moins médias rend le placement des rudiments et mésenchyme beaucoup plus facile. Les supports en excès peut être éliminé soit avec une pointe de pipette ou en utilisant une pince pour saisir le matériau entre les pointes.
3. Placer les morceaux mésenchymateuses dérivées vientm trois à quatre glandes sur le dessus et / ou autour de chaque ébauche épithéliale. Retirez tous les supports supplémentaires qui entourent les glandes pour éviter tout mouvement du mésenchyme loin des rudiments. Mésenchyme provenant de plus de glandes n'est pas bénéfique, mais moins peut être préjudiciable à la croissance rudiment épithélial.
4. Incuber SMGs recombinés dans un incubateur humidifié (95% d'air / 5% CO ₂₎ à 37 ° C pendant 48 -72 heures, comme vous le souhaitez.
5. Acquérir clair et / ou des images fluorescentes de glandes direct à 0 h (si désiré), 2 h après recombinaison et chaque h 24 par la suite sur un microscope optique inversé, debout, ou en stéréo équipé d'un appareil photo numérique en utilisant un objectif de grossissement 4x ou 5x à capturer toute la glande recombiné dans une seule trame de vue. Images de la glande salivaire montrer le meilleur contraste en utilisant soit le paramètre fond clair ou l'anneau de phase approprié placé à mi-chemin dans la voie de la lumière (ce qui n'est pas possible sur les microscopes entièrement automatisés). Contraste de phase standard n'estnécessaire t depuis la glande est épais et crée un contraste.
6. À la fois des points désirés, SMGs recombinés peuvent être fixées pendant 20 minutes avec la solution de fixation en paraformaldéhyde 2% (PFA) dans du PBS 1X contenant 5% (p / v) de saccharose (pour mieux préserver la structure cellulaire interne en maintenant les cellules en un état isosmotique). Contrairement à 4% PFA, 2% PFA conservera une quantité importante du signal de la GFP, si le fixateur est complètement retiré après fixation. Glandes peuvent être stockées pendant 1 semaine dans du PBS 1X dans l'obscurité à 4 ° C jusqu'à ce que l'ensemble de montage immunocytochimie et microscopie confocale est effectuée, comme indiqué précédemment ^3,6,13-15. Idéalement, immunocytochimie et d'imagerie doit être réalisée rapidement après la fixation d'obtenir des images de meilleure qualité. Glandes peuvent également être lysées dans un tampon RIPA pour SDS-PAGE suivie d'une analyse Western blot.

Résultats

Le flux des principales étapes expérimentales est présentée dans la figure 1. Un exemple d'une SMG intacte, un rudiment isolé épithéliale, et son mésenchyme correspondant sont présentés dans la figure 2. Images en fond clair de mitraillettes recombinés, qui continuent à subir morphogenèse de ramification lorsque cultivées ex vivo pendant les temps indiqués, sont présentés dans la figure 3. Glandes recombinés cultivées pendant 48 heures é...

Discussion

La technique ex vivo recombinaison épithélio-mésenchymateuse a d'abord été publié pour glandes salivaires sous-maxillaires en 1981 ^16. Dans ce protocole, on élargir la méthode d'origine, en utilisant une infection adénovirale de manipuler l'expression des gènes de cellules épithéliales dans le cadre d'une glande recombiné. Nous montrons que le pourcentage des cellules épithéliales infectées par l'adénovirus, alors que le pourcentage de cellules qui sont infectées...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM / Ham 's F12 moyen sans rouge de phénol	Life Technologies	21041-025
La pénicilline et la streptomycine	Life Technologies	15070-163	Actions 10X
Dispase	Life Technologies	17105-041	Congelez aliquotes à usage unique à -20 ° C
BSA	Sigma	A2934-100G	Fraction V, l'endotoxine bas
Adeno-X-GFP	BD Biosciences	8138-1	Devrait être un titre élevé (1x10 10 pfu / ml). CsCl virus purifiés sont plus efficaces que la colonne virus purifié dans ce test.
Paraformaldéhyde 16%	Sciences microscopie électronique	15710	Dilué à 2% dans du PBS avec du sucrose 5% (p / v)
1X tampon phosphate salin (PBS)	Life Technologies	70011-044	Préparé en stock 10X
Hank Balanced Salt Solution	Life Technologies	14175095	pas de calcium, de magnésium non, non rouge de phénol
Transferrine	Sigma	T8158	25 mg / ml de solution mère dans du DMEM/F12 médias. Congeler à usage unique aliquotes à -20 ° C
Acide L-ascorbique (vitamine C)	Sigma	A4403	75 mg / ml de solution mère dans du DMEM/F12 media.Freeze à usage unique aliquotes à -20 ° C
			Tableau 1. Liste des réactifs nécessaires pour SMG protocole de recombinaison.
10 cm plats en plastique stériles	Corning	430167	Des plaques de culture de tissus non-traitées peuvent aussi être utilisés.
Stéréo microscope à dissection avec socle de diascopie	Nikon	SMZ645	Toute stéréo microscope à dissection peut être utilisé qui a une base de lumière transmise.
35 mm boîtes de culture tissulaire	Faucon	353001	Des plaques de culture de tissus non-traitées peuvent aussi être utilisés.
50 mm de diamètre plats micropuits	MatTek Corporation	P50-G-1.5-14F
Filtres à membrane Nuclepore Track-Etch	Whatman	110405	13 mm de diamètre, 0,1 mm diamètre des pores
Widefield microscope à fluorescence	Carl Zeiss, USA	Axio Observer Z1	Toute microscope à fluorescence (debout, inverted ou loupe binoculaire stéréo) peut être utilisé pour contrôler l'expression de GFP à faible grossissement avec un appareil photo numérique jointe.
Microscope confocal	Leica Microsystems	TCS SP5	La microscopie confocale est nécessaire de voir les structures cellulaires détaillées. Un microscope confocal peut être utilisé.
Timed-souris femelles enceintes, souche CD-1 ou ICR	Charles River Labs		Les embryons sont récoltés au jour 13 (avec journée de découverte prise désigné comme jour 0).
Lame de bistouri n ° 11	Outils Fine Science	10011-00
Manche de bistouri n ° 3	Outils Fine Science	10003-12
Dumont # 5 pinces inox alliage, X 0.05mm 0.02mm	Outils Fine Science	11252-20	Idéal pour la récolte de glandes à partir d'embryons
Dumont # 5 pinces dumostar alliage, X 0.05mm 0.01mm	Outils Fine Science	11295-20	Pointes fines sont nécessaires pour retirer de l'épithélium mésenchyme. Aiguilles de tungstène peuvent également être utilisés.
			Tableau 2. Matériel utilisé pour SMG protocole de recombinaison.