침샘 조직 문화의 유전자 변형과 재결합

요약

유전자 전체에서 상피 세포를 조작하는 기술 예 생체 교양 배아 마우스 턱밑의 분비 (SMGs)이 설명되어 있습니다. 이 방법은 상피와 자발적으로 adenoviral 벡터와 상피 초보의 분리 및 감염 후 재결합 할 수 mesenchyme을 SMG의 본래 기능을 활용합니다.

초록

morphogenesis을 분기하는 많은 기관의 개발 기간 동안 발생하며, 배아 마우스 턱밑의 선 (SMG)는 morphogenesis을 가지 연구를위한 클래식 모델입니다. ^- 궁극적으로 구강 ^하나에 각각 침을 생산 및 수정 / 전송하기 위해 사용될 acini과 관의 복잡한 분지 네트워크에 상승을 제공하기 위해 상피 봉오리 덕트 형성 단계를 반복 개발 SMG,이 과정은 포함 ^3. 어떻게 세포와 분자 이벤트가 제대로 이해 남아 조정 아르하지만 상피 - 관련 지하 막하고 이러한 세포에 의해 생산 mesenchyme 세포, 성장 인자와 세포 외 기질을 포함하는 중간 엽 구획의 측면은, 분기 메커니즘에 중요한 ^사 . 분자 메커니즘의 연구는 상피 morphogenesis 진행에게 발달 메커니즘에 대한 우리의 이해를 운전 가능한 regener에 대한 통찰력을 제공합니다ative 의학 접근. 이러한 연구는 침 상피의 유전자 조작에 대한 효과적인 방법의 부족으로 인해 방해되었습니다. 현재 adenoviral 도입은 생체 ⁵ 성인 분비에 상피 세포를 타겟팅하는 가장 효과적인 방법을 나타냅니다. 그러나 배아 explants에서 조밀 mesenchyme과 상피 세포를 둘러싸고있는 지하 막는 상피 세포에 바이러스 접근을 막는. mesenchyme가 제거되면, 상피는 adenoviruses를 사용하여 transfected 수 있고, 상피 초보는 Matrigel 또는 laminin-111 ^6,7의 존재에 morphogenesis을 분기 재개 할 수 있습니다. Mesenchyme 무료 상피 흔적 기관의 성장은 수용성 성장 요인으로 추가 보완이 필요하고 그대로 땀샘 ⁸ 발생할 때 완전히 분기 morphogenesis을 요점을 되풀이하지 않습니다. 여기 transfected 전자의 상피 세포와 문화의 adenoviral 전달을 용이하게하는 기술을 설명관련 정보 mesenchyme있는 pithelium. 배아 SMGs, mesenchyme의 제거, 그리고 GFP 함유 아데노 바이러스와 상피의 바이러스 감염의 microdissection 따라, 우리는 상피가 저절로 그대로 SMG 선의 구조를 recapitulating하고 morphogenesis을 분기, 감염되지 않은 mesenchyme과 recombines을 보여줍니다. 유전자 변형 상피 세포 인구는 쉽게 휘황 태그 경우 adenoviral 구조가 사용되는 표준 형광 현미경 방법을 사용하여 모니터링 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 조직 재조합 방법은 현재 유전자 변형 동물의 생성을 필요로하지 않습니다 복잡한 3D 조직 구조 내에서 야생 형 또는 돌연변이 벡터와 상피 세포의 transfection을위한 가장 효과적이고 접근 방법입니다.

프로토콜

프로토콜은 그림 1에 설명 된 네 개의 주요 단계가 포함되어 있습니다. 모든 단계는 전체 자세히 설명되어 있습니다. 아데노 바이러스 건설 바이러스 정화는 해부하는 상피 초보의 유전 형질 도입에 사용하기 위해 장기 수확을 사전에 수행해야합니다. adenoviruses과 함께 작업 할 때 모든 표준 BSL-2 안전 조치를 준수해야합니다.

1. 마우스 배아 턱밑 분비선 (SMG) 수확 및 Microdissection

1. 배아 일 13시 마우스 배아의 자궁 전위와 수확 문자열 (E13, 3-5 상피 꽃 봉오리) 기관 IACUC의 승인을 다음 절차에 이어 CO ₂ 마취법을 사용하여 시간 제한이 초과 임신 여성 마우스 (outbred 변형 CD-1 또는 ICR)을 안락사시켜야 위원회. 질 플러그 발견의 날은 E0로 지정되어 있습니다. 갈라진 틈은 단지 시작과 하나의 주요 꽃 봉오리와 줄기가있을 때 침샘도 E12 단계에서 수확하고 배양 할 수 있습니다시작합니다. 이전 단계에 SMGs 여기에 표시된 것보다 다른 문화 조건을 필요로합니다.
2. 페놀 레드 (생명 기술), 100 U / ML 페니실린과 보충, 100 μg / ML의 스트렙토 마이신 (펜 패 혈성이 부족한 DMEM / 햄의 F12 매체 (F12)의 25 ML로 가득 무균 10cm 조직 문화 요리에 배아 문자열을 전송, 생활 기술을).
3. 멸균 메스 (# 11 블레이드)와 집게를 (# 5, 정밀 과학 도구, 11252-20)를 사용하여, DMEM/F12 + 펜 패 혈성의 25 ML을 포함하는 별도의 10cm 접시에 주머니에서 배아를 제거합니다.
4. 단지 아래턱 아래의 각진 컷으로 배아 머리를 자르다.
5. 상단 턱 아래 컷을 사용하여 전송 라이트베이스 (니콘 SMZ645 또는 동급)와 스테레오 해부 현미경 헤드의 낮은 개미를 분리합니다. 유리의 추가 작품의 상단에보다는 직접 현미경베이스의 유리 구성 요소에 조직을 배치합니다.
6. DM 3 ML로 낮은 개미를 수집EM/F12 + 살균 35mm 조직 배양 접시에 펜 패 혈성.
7. 혀는 슬라이스의 맨 아래에 있지만 12시시 위치쪽으로 향하고되도록 해부 현미경 무대에 턱이 슬라이스를 놓습니다.
8. scissoring 모션에서 두 짓밟 포셉의 한면을 사용하여 제거하고 아래턱 슬라이스의 3분의 1 낮은 ^회를 폐기하십시오.
9. 포셉과 scissoring 컷을 사용하여 슬라이스 90 오른쪽에 ° (오른 손잡이 경우) 등을 돌려, 중간 슬라이스로 아래턱 슬라이스의 상단 부분을 (혀를 절단하지 않고) 절단.
10. 필 초과 거리에 조직과 아래 SMGs를 노출 할을 제거합니다. 혀의 기지 근처 각면에 하나가 될 것입니다.
11. 혀에 의해 조직을 누르고 포셉 한 쌍의를 사용하여 혀에서 SMG을 멀리 감히 다른 집게를 사용합니다. 다른 선에 대해 반복합니다.
12. 새로운 살균 35mm 조직에 DMEM/F12 + 펜 패 혈성 3 ML에 microdissected 침샘을 수집배양 접시. 참고 : 연결된 작은 sublingual 글 랜드 (1 꽃 봉오리)와 함께 큰 턱밑 분비 (3-5 상피 꽃 봉오리)이 4 단계로 건너와 단계 4.1 4.3 수행하고, 4.4에서 그대로 배양 할 수와 같은 이전에 ^2,8 설명했다.

2. 상피 흔적 기관 분리를 SMG

1. 장소 5 (이상) 행크의 균형 소금 솔루션 200 μl (HBSS는 칼슘이 부족한를 포함하는 유리 바닥, 50mm 직경 microwell 요리 (MatTek 공사, P50G-1.5-14-F)로 침샘 ^{+ +} 또는 MG ^{+ +,} 생명 기술) 0.4 %를 포함 (V / V) dispase (생명 기술, 고양이. 안돼. 17105-041)와 37 15 분에 품다 ° C.
2. 부화 후, 멸균 200 μl 피펫 팁 사용하여 조심스럽게 분비를 방해하지 않으면 서 dispase 솔루션을 기음. 즉시 BSA (DMEM/F12-BSA, 필터 0.22 μm와 사전 소독)는 dispase을 중화하는데 5 % (w / v를) 포함 DMEM/F12 미디어 200 μl를 추가합니다.
<리> 해부 현미경에서 좋은 팁 (# 5 Dumostar 좋아, 과학 도구, 11295-20)와 포셉 한 쌍의를 사용하여 부드럽게 상피를 그대로 유지하도록 관리하고, SMG 상피 꽃받침과 구멍 주변에서 느슨해 mesenchyme을 분리 .
3. 사전 젖은 멸균 200 μl 피펫의 DMEM/F12-BSA 매체와 팁 부드럽게 DME​​M/F12 200 μl + 펜 패 혈성을 포함하는 새로운 50mm 직경 microwell 요리로 상피 초보를 피펫. 부드러운 가장자리와 높은 품질을 200 μl 피펫 팁을 사용합니다.
4. mesenchyme 조각을 포함하는 음식에서 sublingual 분비와 분리 턱밑 글 랜드 꽃 봉오리를 포함하여 비 중간 엽 조직을 폐기합니다.

3. 상피 초보의 Adenoviral 감염

1. 결과 솔루션의 titer는 1x10 ⁸ -10 ⁹ PFUs이되도록 microcentrifuge 관 DMEM/F12 + 펜 패 혈성에 대한 관심의 아데노 바이러스를 diluting하여 바이러스 감염 미디어 200 μl를 확인합니다.다른 바이러스에 필요한 최적의 titer는 다를 수 있습니다. 이 세슘 염화물 (CsCl) - 정화 최적의 통풍 관 효율을위한 바이러스 준비를 사용하는 것이 중요합니다.
2. 다섯 상피 초보가 포함 된 음식에서 미디어를 제거합니다. 신속 항상 초보가 젖 유지, 감염 미디어 200 μl를 추가합니다. 바이러스를 처리하고 오염 pipet 팁 폐기에 필요한주의 사항을보십시오. 10 % 표백제 솔루션 바이러스 오염 된 표면을 소독.
3. 같이 가겠다는에서 그들을 방지하고 그들에게 접시의 바닥에 정착 할 수 있도록 집게와 멀리 떨어져 서로 상피 초보를 이동합니다. 상온에서 1 시간에 바이러스 성 미디어 초보를 품다. 사람들이 가까운 곳에 이동하면 부화하는 동안, 초보를 구분합니다. 과도한 흔들거나 운동이 선들이 함께 덩어리 할 수​​ 있습니다.
4. 부화 후, 부드럽게 바이러스 함유 미디어를 제거하고 적절하게 폐기, 연구를 중단하지 돌봐udiments. DMEM/F12 + 펜 패 혈성 200 μl를 추가합니다. 이 세차 적어도 두 번 이상 반복하고 DMEM/F12 + 펜 패 혈성 미디어 200 μl로 교체하십시오. 이 세차 강력 상피에 부착되지 않은 바이러스를 제거하고 mesenchyme의 감염을 방지하기 위해 중요합니다.
5. DMEM/F12 200 ML 2 %를 포함과 상피 초보를 배양 (V / V) 20 분에 Matrigel (BD Biosciences, 356231). 우리는 Matrigel이 짧은 부화가 초기 문화 기간 동안 기존의 갈라진 틈의 회귀를 최소화 발견,이 단계는 Matrigel에 노출이 원하는하지 않은 경우에 투여 할 수 있습니다.

재결합 SMGs 4. 예를 생체 문화

1. 노치 (작은 컷)의 상단에, 사전 젖은 200 μl 피펫 팁을 사용하여 각 퇴화 기관, 한 번에 하나를 놓고 13mm, 0.1 μm 문화 미디어 200 μl (를 떠 Nuclepore 트랙 - 에칭 막 필터 (워트 먼지) 바닥이 유리로 microwell 판 5 초보 / 필터). 문화 미디어입니다 : DMEM/F12 + 펜 패 혈성은 50 μg / ML 트랜스페린과 150 μg / ML 아스코르브 산 등 이전에 ^{2,8 설명을} 포함. 트랜스페린은 생존을 촉진하는 것으로 알려져 있으며 침샘과 다른 장기의 explants ⁹ morphogenesis을 가지입니다. 아스코르브 산의 추가는 SMG 브랜칭을 촉진하기 위해 표시되었습니다. ^(10)는 이것은 신진 대사 경로 (예 : 콜라겐 섬유 형성 ^11시 프롤린 hydroxylation 등)의 많은 hydroxylation 반응에 cofactor 역할을하는 것으로 알려져 있으며, 다른 장기의 explants에서 fibronectin과 laminin 생산을 자극합니다 ^12.
2. 각 상피 흔적 기관을 추가 한 후 가능한 한 필터의 상단에 많이 미디어로 제거합니다. 필터의 상단에 너무 많은 미디어가 적은 미디어 초보의 배치를 할 동안, 필터가 침몰의 원인과 훨씬 쉽게 mesenchyme 수 있습니다. 초과 미디어는 피펫 팁이나 조언의 미디어를 놓치 집게를 사용하여 하나 제거 할 수 있습니다.
3. 장소 mesenchyme 조각이 서있는 파생상단 및 / 또는 각 상피 흔적 기관 주위 m 3-4 분비. 멀리 초보에서 mesenchyme의 움직임을 피하기 위해이 선들을 둘러싼되는 추가 미디어를 제거합니다. 더 많은 선들에서 파생 Mesenchyme가 도움이되지 않습니다 미만 상피 흔적 기관의 성장에 해로운 수 있습니다.
4. 원하는대로, 48 -72 시간에 37 ° C에서 humidified 인큐베이터 (95% 공기 / 5퍼센트 CO _2)에 재결합 SMGs을 품다.
5. brightfield 및 / 또는 형광성 0 시간 라이브 분비의 이미지 (원하는 경우), 재결합 후 2 시간하고 4X 또는 5 배 확대 목표를 사용하여 디지털 카메라를 갖추고, 역 수직, 또는 스테레오 가벼운 현미경에 이후 모든 24 시간을 습득 보기의 단일 프레임에 전체 재결합 선을 캡처합니다. 침샘의 이미지는 빛 경로 (이 완전 자동화 된 현미경에 수 없습니다)에 부품 방법을 배치 brightfield 설정하거나 적절한 단계 링을 사용하여 최적의 대비를 보여줍니다. 표준 위상 대비는 없습니다필요 t는 선 육중하고 있기 때문에 대비를 만듭니다.
6. 원하는 시간 점에서 재결합 SMGs은 5 % (w / V) 자당을 (더 나은에 세포를 유지하여 내부 세포 구조를 유지하기 위해 포함 1X PBS에 2 % paraformaldehyde (PFA)로 만든 정착액 솔루션을 20 분 고정 할 수 있습니다 isosmotic 주). 정착액이 완전히 고정 후 제거하면 4% 달리 PFA, 2퍼센트 PFA는 GFP 신호의 상당한 양을 유지합니다. 선들은 4에서 어둠 속에서 1X PBS에서 일주까지에 저장할 수 있습니다 ° C 전체 마운트 immunocytochemistry 및 공 촛점 이미징이 수행 될 때까지 이전과 같이 ^3,6,13-15 보도했다. 이상적으로, immunocytochemistry 및 이미징은 최고 품질의 이미지를 얻기 위해 고정 후 곧 수행해야합니다. 분비는 서양 blotting 분석에 이어 SDS-PAGE에 RIPA 버퍼에 lysed 될 수 있습니다.

결과

주요 실험 단계의 흐름은 그림 1에 설명되어 있습니다. 그대로 SMG 고립 된 상피 흔적 기관 및 해당 mesenchyme의 예는 그림 2에 표시됩니다. 지정된 시간에 대한 양식 예를 생체가 그림 3에 표시됩니다 때 morphogenesis을 분기 받아야 계속 재결합 SMGs의 Brightfield 이미지. 상피 GFP를 표현하는 48 시간에 성장 재결합 분비가 그림 4에 표시됩니다....

토론

예 생체 상피 - 중간 엽 재조합 기술이 처음 1981 ¹⁶ 턱밑 침샘에 출판되었다. 이 프로토콜에서는, 우리는 재결합 선의 컨텍스트 내에서 상피 세포의 유전자 발현을 조작하는 adenoviral 감염를 사용하여 원래의 방법에 따라 확장합니다. 우리는 감염된 세포의 비율은 바이러스 발기인의 속성, 바이러스 titer 및 바이러스 순도에 따라 달라집니다 반면, 상피 세포의 비율은, 아데노 바이러?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트
페놀 레드가없는 DMEM / 햄의 F12 중	생명 기술	21041-025
페니실린과 스트렙토 마이신	생명 기술	15070-163	10X 주식
Dispase	생명 기술	17105-041	단일 사용 aliquots을 고정에서-20C
BSA	시그마	A2934-100G	분수 V, 낮은 내 독소
Adeno-X-GFP	BD Biosciences	8138-1	높은 titer (1x10 10 PFU / ML) 여야합니다. CsCl 정화 바이러스는이 분석에서 바이러스를 열 정화보다 더 효과적입니다.
16 % Paraformaldehyde	전자 현미경 과학	15,710	5 %의 자당 (w / V)와 PBS에서 2 %로 희석
1X 인산 버퍼 생리 (PBS)	생명 기술	70011-044	10X 혈통 준비
행크의 균형 소금 솔루션	생명 기술	14175095	더 칼슘도없고, 마그네슘, 아니 페놀 레드
트랜스페린	시그마	T8158	25 MG / DMEM/F12 미디어 ML 주식 솔루션입니다. 단일 사용 aliquots에서-20C를 고정
L-아스코르브 산 (비타민 C)	시그마	A4403	DMEM/F12 media.Freeze 단일 사용 aliquots 75 MG / ML 주식 솔루션에서-20C
			표 1. 재결합 프로토콜을 SMG에 필요한 시약의 목록입니다.
10cm 멸균 플라스틱 요리	코닝	430167	비 조직 문화 치료 접시도 사용할 수 있습니다.
전송 라이트 기반으로 스테레오 해부 현미경	니콘	SMZ645	현미경을 해부 모든 스테레오가 전송 가벼운 기지를 가지고 사용할 수 있습니다.
35mm 조직 문화 요리	매	353001	비 조직 문화 치료 접시도 사용할 수 있습니다.
50mm 직경 microwell 요리	MatTek 공사	P50-G-1.5 14F
Nuclepore 트랙 - 에칭 막 필터	워트 먼지	110405	13mm 직경, 0.1 mm 구멍 크기
Widefield 형광 현미경	칼 Zeiss, USA	Axio 옵저버 Z1	모든 형광 현미경 (똑바로, 전) nverted 또는 현미경을 해부 스테레오는 첨부 된 디지털 카메라로 낮은 배율에서 GFP 발현을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.
공 촛점 현미경	Leica 마이크로 시스템즈	TCS SP5	공 촛점 현미경 자세한 세포 구조를 볼 필요가 있습니다. 모든 공 촛점 현미경을 사용하실 수 있습니다.
시간 제한이 초과 임신 여성 마우스, 스트레인 CD-1 또는 ICR	찰스 강 (Charles River) 연구소		태아는 하루에 13 일 (일 0로 지정 플러그 발견 하루)에 수확하고 있습니다.
메스 블레이드 # 11	정밀 과학 도구	10011-00
메스 핸들 # 3	정밀 과학 도구	10003-12
뒤몽 # 5 포셉 inox 합금, 0.05mm X 0.02mm	정밀 과학 도구	11252-20	배아에서 분비 수확에 이상적
뒤몽 # 5 포셉 dumostar 합금, 0.05mm X 0.01mm	정밀 과학 도구	11295-20	좋은 팁 상피에서 mesenchyme을 제거 필요합니다. 텅스텐 바늘도 사용하실 수 있습니다.
			표 2. 장비 재결합 프로토콜을 SMG에 사용됩니다.