Modificación genética y recombinación de las Glándulas Salivales culturas de órganos

Resumen

Una técnica para manipular genéticamente las células epiteliales dentro de toda Ex vivo Cultivadas de embriones de ratón glándulas submandibulares (SMG) con transferencia génica viral se describe. Este método se aprovecha de la capacidad innata de SMG epitelio y el mesénquima para recombinarse espontáneamente después de la separación y la infección de rudimentos epiteliales con vectores adenovirales.

Resumen

La morfogénesis de ramificación se produce durante el desarrollo de muchos órganos, y la glándula submandibular del ratón embrionario (SMG) es un modelo clásico para el estudio de la morfogénesis de ramificación. En la SMG desarrollo, este proceso implica pasos iterativos de brote epitelial y la formación del conducto, en última instancia, para dar lugar a una compleja red ramificada de acinos y conductos, que sirven para producir y modificar / transportar la saliva, respectivamente, en la cavidad oral de ^{1 - 3.} La membrana basal epitelial asociada y los aspectos de la compartimiento mesenquimal, incluyendo las células del mesénquima, factores de crecimiento y la matriz extracelular, producidas por estas células, son críticos para el mecanismo de ramificación, aunque la forma de los acontecimientos celulares y moleculares están coordinados sigue siendo poco conocida ⁴ . El estudio de los mecanismos moleculares de conducción avances epiteliales morfogénesis nuestra comprensión de los mecanismos de desarrollo y da una idea de posible regeneraraproximaciones creativas medicina. Tales estudios se han visto obstaculizados por la falta de métodos eficaces para la manipulación genética del epitelio salival. Actualmente, la transducción adenoviral representa el método más eficaz para atacar a las células epiteliales de las glándulas adultos in vivo ^5. Sin embargo, en los explantes de embriones, mesénquima y densa de la membrana basal que rodea las células epiteliales impide el acceso viral a las células epiteliales. Si el mesénquima se retira, el epitelio puede ser transfectadas utilizando adenovirus, y rudimentos epiteliales puede reanudar la morfogénesis de ramificación en presencia de Matrigel o laminina-111 ^6,7. Mesénquima crecimiento libre de rudimento epitelial también requiere suplementos adicionales con factores de crecimiento solubles y no completamente recapitular la morfogénesis de ramificación ya que se produce en las glándulas intactas ^8. Aquí se describe una técnica que facilita la transducción adenoviral de las células epiteliales y la cultura de la e transfectadaspithelium con mesénquima asociado. Después de la microdisección de los subfusiles embrionarias, la eliminación de la mesénquima, y ​​la infección viral del epitelio con un adenovirus que contiene GFP, se muestra que el epitelio espontáneamente recombina con mesénquima no infectada, recapitulando intacta la estructura glandular SMG y la morfogénesis de ramificación. La población de células epiteliales modificadas genéticamente pueden controlarse fácilmente utilizando métodos estándar de microscopía de fluorescencia, si fluorescentemente etiquetados construcciones adenovirales se utilizan. El método de recombinación de tejidos descrito aquí es actualmente el método más eficaz y accesible para la transfección de células epiteliales con un vector de tipo salvaje o mutante dentro de una construcción de tejido complejo 3D que no requiere la generación de animales transgénicos.

Protocolo

El protocolo contiene cuatro etapas principales, como se representa en la figura 1. Todos los pasos se describen con todo detalle. Construcción de adenovirus y la purificación viral se debe realizar antes de la extracción de órganos para su uso en la transducción genética de diseccionados rudimentos epiteliales. Todos los estándares BSL-2 medidas de seguridad se deben seguir cuando se trabaja con adenovirus.

1. Embrionarias de ratón glándula submandibular (SMG) Recolección y microdisección

1. Eutanasiar cronometrado embarazadas ratones hembra (cepa consanguínea CD-1 o ICR) utilizando CO ₂ narcosis, seguido por dislocación cervical y cadenas de cosecha de embriones de ratón en el día embrionario 13 (E13, 3-5 papilas epiteliales) siguientes procedimientos aprobados por el IACUC institucional comité. El día del descubrimiento de tapón vaginal se designa como E0. Las glándulas salivales también pueden ser cosechados y cultivados en la etapa E12 cuando hay un solo brote primario y tallo con hendiduras empezandoa iniciar. Subfusiles antes de esta etapa requieren diferentes condiciones de cultivo de las indicadas aquí.
2. Transferir cadenas de embriones en estériles de 10 placas de cultivo cm de tejido llena de 25 ml de DMEM / Ham 's F12 (F12) que carecen de rojo fenol (Life Technologies) suplementado con 100 U / ml de penicilina, y 100 ug / ml de estreptomicina (pen-strep, Life Technologies).
3. Con un bisturí estéril (# 11 cuchillas) y pinzas (# 5, Herramientas de Bellas ciencia, 11252-20), la toma de embriones a partir de los sacos en un plato separado 10 cm que contiene 25 ml de DMEM/F12 + pen-strep.
4. Cortar las cabezas de embriones con un corte en ángulo justo debajo de la mandíbula inferior.
5. Aislar las mandíbulas inferiores de las cabezas bajo un microscopio de disección estéreo con una base de luz transmitida (Nikon SMZ645 o equivalente) con un corte por debajo de la mandíbula superior. Colocar los tejidos en la parte superior de una pieza extra de vidrio en lugar de directamente sobre el componente de vidrio de la base del microscopio.
6. Recoge las mandíbulas inferiores a 3 ml de DMEM/F12 + pen-strep en una estéril 35 mm plato de cultivo de tejidos.
7. Colocar una rodaja mandíbula sobre la platina del microscopio de disección para que la lengua está en la parte inferior de la rebanada pero está apuntando hacia la posición de las 12:00.
8. Usando un lado de dos pinzas cruzadas en una especie de tijera, retire y deseche la ^rd 1/3 inferior de la porción mandibular.
9. Girar la rebanada 90 ° a la derecha (si es diestro) y, usando un corte de tijera con los fórceps, cortar la parte superior de la rebanada mandíbula (sin cortar la lengua) hasta la mitad en la rebanada.
10. Pelar el exceso de tejido y retirar a exponer las metralletas debajo. Habrá una en cada lado cerca de la base de la lengua.
11. Con un par de pinzas para sujetar el tejido de la lengua, utilizar las pinzas para molestar a los demás SMG lejos de la lengua. Repita el procedimiento para la otra glándula.
12. Recoger las glándulas salivales microdissected en 3 ml de DMEM/F12 + pen-strep en un nuevo tejido estéril mm 35cultura plato. Nota: las glándulas submandibulares más grandes (3-5 yemas epiteliales), junto con la glándula más pequeña conectada sublingual (1 yema) se pueden cultivar intacto por saltarse el paso 4 y de realizar los pasos 4,1, 4,3 y 4,4, como se ha descrito previamente ^2,8.

2. SMG Separación rudimento epitelial

1. Place 5 (o más) las glándulas salivales en un fondo de vidrio, 50 mm diámetro del plato de micropocillos (MatTek Corporation, P50G-1.5-14-F) que contiene 200 l de solución salina equilibrada de Hank (HBSS carece Ca ^{+ +} o Mg ^{+ +,} Life Technologies) que contenía 0,4% (v / v) dispasa (Life Technologies, cat. no. 17,105-041) e incubar durante 15 min a 37 ° C.
2. Después de la incubación, usando una punta de pipeta estéril 200 l, aspirar con cuidado a la solución de dispasa sin perturbar las glándulas. Añadir inmediatamente 200 l de medio DMEM/F12 que contiene 5% (w / v) BSA (DMEM/F12-BSA, pre-esterilizado con un filtro de 0,22 micras) para neutralizar la dispasa.
3. Bajo un microscopio de disección, usando un par de pinzas con puntas finas (# 5 Dumostar, herramientas finas Science, 11295-20), suavemente separar el mesénquima alrededor de aflojado de las papilas epiteliales SMG y conductos, teniendo cuidado de dejar el epitelio intacto .
4. Humedezca previamente una punta de pipeta estéril 200 ml con DMEM/F12-BSA medios de comunicación y pipetear suavemente los rudimentos epiteliales en un nuevo 50 mm diámetro del plato de micropocillos que contiene 200 l de DMEM/F12 + pen-strep. Utilice una alta calidad de 200 l punta de la pipeta con un borde liso.
5. En el plato que contiene las piezas mesénquima, desechar cualquier tejido no-mesenquimal incluyendo las glándulas sublinguales y las glándulas submandibulares yemas separadas.

3. La infección adenoviral de Rudimentos epiteliales

1. Hacer 200 l de medios de infección viral mediante la dilución del adenovirus de interés en DMEM/F12 + pen-strep en un tubo de microcentrífuga de modo que el título de la solución resultante es 1x10 ⁸ -10 ⁹ PFU. Latítulo óptimo requerido para diferentes virus puede variar. Es importante utilizar cloruro de cesio (CsCl)-preparaciones purificadas virales para la eficacia de la absorción óptima.
2. Retire el material de la cápsula que contiene las cinco rudimentos epiteliales. Añadir rápidamente 200 l de los medios de comunicación de infección, manteniendo los rudimentos húmedo en todo momento. Tome las precauciones necesarias al manipular el virus y la eliminación de puntas de pipeta contaminados. Desinfecte las superficies contaminadas con virus con la solución de lejía al 10%.
3. Mover los rudimentos epiteliales lejos el uno del otro con pinzas para evitar que se peguen entre sí y permitir que se depositen en el fondo de la placa. Incubar rudimentos en medios virales durante 1 hora a temperatura ambiente. Durante la incubación, separar los rudimentos, si se mueven juntos. Balanceo excesivo o movimiento permitirá a las glándulas para agruparse.
4. Después de la incubación, retire con cuidado los medios de comunicación viral que contienen y deseche adecuadamente, teniendo cuidado de no alterar la rudiments. Añadir 200 l de DMEM/F12 + pen-strep. Repita este lavado por lo menos dos veces más y reemplazar con 200 l de DMEM/F12 + pen-strep medios de comunicación. Estos lavados son fundamentales para eliminar cualquier virus que no está fuertemente unida al epitelio y para prevenir la infección del mesénquima.
5. Incubar rudimentos epiteliales con 200 ml de DMEM/F12 que contiene 2% (v / v) de Matrigel (BD Biosciences, 356.231) durante 20 min. Encontramos que este corto de incubación en Matrigel minimiza la regresión de las hendiduras existentes durante el período inicial de cultivo, pero este paso puede obviarse si la exposición a Matrigel no se desea.

4. Ex Culture in vivo de subfusiles recombinados

1. Colocar cada rudimento, uno a la vez, usando una pre-mojado punta de pipeta 200 l, en la parte superior de una muesca (pequeño corte) 13 mm, 0,1 micras Nuclepore Track-Etch membrana de filtro (Whatman) flotando sobre 200 l de medio de cultivo ( 5 rudimentos / filtro) en una placa de vidrio con fondo de pocillos de microtitulación. Los medios de cultivoes: DMEM/F12 + pen-strep que contenía 50 mg / ml de transferrina y 150 ug / ml de ácido ascórbico, como se ha descrito previamente ^2,8. La transferrina se sabe que estimula la supervivencia y morfogénesis de ramificación de explantes de glándula salival y otros órganos ^9. La adición de ácido ascórbico se ha demostrado que estimula la ramificación SMG. ¹⁰ Se sabe que actúa como un cofactor en muchas reacciones de hidroxilación de vías metabólicas (tales como hidroxilación de prolina durante la formación de fibras de colágeno ¹¹⁾ y también estimula la producción de fibronectina y la laminina en explantes de otros órganos ^12.
2. Eliminar como muchos medios en la parte superior del filtro como sea posible después de añadir cada rudimento epitelial. Medios demasiado en la parte superior del filtro puede hacer que el filtro a hundirse, mientras que menos medios de comunicación hace que la colocación de los rudimentos y mesénquima mucho más fácil. El exceso de medios de comunicación se puede eliminar con una punta de pipeta o utilizando pinzas para sujetar el papel entre las puntas.
3. Coloque las piezas de mesénquima derivado from tres y cincuenta y siete glándulas en la parte superior y / o alrededor de cada rudimento epitelial. Quite todos los medios adicionales que se rodean las glándulas para evitar el movimiento del mesénquima lejos de los rudimentos. Mesénquima derivado de más glándulas no es beneficiosa, pero puede ser menos perjudicial para el crecimiento rudimento epitelial.
4. Incubar metralletas recombinados en un incubador humidificado (95% aire / 5% CO ₂₎ a 37 ° C durante 48 -72 horas, según se desee.
5. Adquirir claro y / o imágenes fluorescentes de glándulas en vivo a 0 horas (si se desea), 2 h después de la recombinación y cada 24 horas a partir de entonces en un microscopio de luz invertida, en posición vertical, o estéreo equipado con una cámara digital con un objetivo de aumento 4X o 5X para capturar la glándula recombinada todo en un solo marco de vista. Las imágenes de la glándula salival mostrar el mejor contraste utilizando el ajuste campo claro o el anillo de fase apropiado colocado a medio camino en la trayectoria de la luz (lo cual no es posible en totalmente automatizados microscopios). Contraste de fase estándar es not necesario ya que la glándula esté espesa y crea contraste.
6. En los puntos de tiempo deseados, subfusiles recombinados se puede fijar durante 20 minutos con la solución de fijación hechos de 2% de paraformaldehído (PFA) en 1X PBS que contenía 5% (w / v) de sacarosa (para mantener la mejor estructura celular interna, manteniendo las células en un estado isotónico). A diferencia de PFA al 4%, 2% PFA conservará una cantidad significativa de la señal de GFP si el fijador se elimina por completo después de la fijación. Las glándulas se pueden almacenar durante hasta 1 semana en 1X PBS en la oscuridad a 4 ° C hasta que toda la inmunocitoquímica y montaje de imagen confocal se lleva a cabo, como se informó anteriormente ^3,6,13-15. Idealmente, inmunocitoquímica y de imagen se debe realizar poco después de la fijación de obtener imágenes con la mejor calidad. Glándulas también pueden ser lisadas en tampón RIPA por SDS-PAGE seguida por análisis de Western Blot.

Resultados

El flujo de las etapas experimentales principales se describen en la Figura 1. Un ejemplo de un SMG intacto, un rudimento epitelial aislado, y su mesénquima correspondiente se muestra en la Figura 2. Imágenes de campo claro subfusiles recombinados, que siguen a someterse a la morfogénesis de ramificación cuando cultivadas ex vivo durante los tiempos indicados, se muestran en la Figura 3. Glándulas recombinados cultivadas durante 48 horas epitelial que expr...

Discusión

El ex vivo epitelial-mesenquimal técnica de recombinación fue publicado por primera vez por las glándulas salivales submandibulares en 1981 ^16. En este protocolo, se expanda en el método original, usando infección adenoviral para manipular la expresión génica de células epiteliales en el contexto de una glándula recombinado. Se demuestra que un porcentaje de las células epiteliales están infectadas con el adenovirus, mientras que el porcentaje de células que están infectadas depende de l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de Catálogo	Comentarios
DMEM / Ham 's F12 medio sin rojo de fenol	Life Technologies	21041-025
Penicilina y Estreptomicina	Life Technologies	15070-163	Valores 10 veces
Dispasa	Life Technologies	17105-041	Congele solo uso alícuotas a -20 º C.
BSA	Sigma	A2934-100G	Fracción V, endotoxinas bajo
Adeno-X-GFP	BD Biosciences	8138-1	Debe ser alto título (1x10 10 pfu / ml). CsCl virus purificados son más eficaces que la columna virus purificados en este ensayo.
16% de paraformaldehído	Ciencias de Microscopía Electrónica	15710	Diluido al 2% en PBS con 5% de sacarosa (w / v)
1X tampón fosfato salino (PBS)	Life Technologies	70011-044	Preparado a partir de valores 10 veces
Solución salina equilibrada de Hank	Life Technologies	14175095	sin calcio, magnesio no, no rojo de fenol
Transferrina	Sigma	T8158	25 mg / ml de solución madre en medio DMEM/F12. Congelar solo uso alícuotas a -20 º C.
L-ácido ascórbico (vitamina C)	Sigma	A4403	75 mg / ml de solución madre en DMEM/F12 media.Freeze solo uso alícuotas a -20 º C.
			Tabla 1. Lista de los reactivos necesarios para SMG protocolo de recombinación.
10 cm de platos de plástico estériles	Corning	430167	Placas de cultivo de tejido no-tratados también se puede utilizar.
Microscopio de disección estéreo con base de luz transmitida	Nikon	SMZ645	Cualquier estéreo microscopio de disección puede ser utilizado que tiene una base de luz transmitida.
35 mm placas de cultivo de tejidos	Halcón	353001	Placas de cultivo de tejido no-tratados también se puede utilizar.
50 mm de diámetro micropocillos platos	MatTek Corporación	P50-G-1.5-14F
Nuclepore Track-Etch filtros de membrana	Whatman	110405	13 mm de diámetro, 0,1 mm de tamaño de poro
Widefield microscopio de fluorescencia	Carl Zeiss, EE.UU.	Axio Observer Z1	Cualquier microscopio de fluorescencia (vertical, inverted o estéreo microscopio de disección) se puede utilizar para controlar la expresión de GFP a bajo aumento con una cámara digital conectada.
Microscopio confocal	Leica Microsystems	TCS SP5	La microscopía confocal es necesario ver estructuras detalladas celulares. Cualquier microscopio confocal se puede utilizar.
El tiempo-ratones hembra embarazadas, cepa CD-1 o ICR	Charles River Labs		Los embriones se recogieron en el día 13 (día de descubrimiento con enchufe designado como día 0).
Hoja de bisturí # 11	Herramientas Artes Ciencias	10011-00
Mango de bisturí n º 3	Herramientas Artes Ciencias	10003-12
Dumont # 5 pinzas inox aleación, 0.05mm 0.02mm X	Herramientas Artes Ciencias	11252-20	Ideal para la recolección de glándulas a partir de embriones
Dumont # 5 fórceps dumostar aleación, 0.05mm 0.01mm X	Herramientas Artes Ciencias	11295-20	Puntas finas son necesarias para la eliminación de mesénquima de epitelio. Agujas de tungsteno también se puede utilizar.
			Tabla 2. Equipos utilizados en SMG protocolo de recombinación.