Modificação genética e recombinação de culturas de órgãos de glândula salivar

Resumo

Uma técnica para manipular geneticamente as células epiteliais no quadro da totalidade Ex vivo Cultivadas glândulas embrionárias de camundongos submandibulares (SMGs) utilizando transferência de gene viral é descrito. Este método tira vantagem da capacidade inata de SMG epitélio e mesênquima para recombinar-se espontaneamente, após a separação e a infecção de rudimentos epiteliais com vectores adenovirais.

Resumo

Ramificação morfogénese ocorre durante o desenvolvimento de muitos órgãos, e a glândula submandibular embrionário de rato (GSM) é um modelo clássico para o estudo da ramificação morfogénese. No desenvolvimento de SMG, este processo envolve passos iterativos de broto epitelial e formação de condutas, para finalmente dar origem a uma rede complexa ramificada de ácinos e ductos, que servem para produzir e modificar / transportar a saliva, respectivamente, para dentro da cavidade oral ^{1 - 3.} A membrana basal epitelial associada e aspectos do compartimento mesenquimal, incluindo as células do mesênquima, factores de crescimento e da matriz extracelular, produzida por estas células, são essenciais para o mecanismo de ramificação, embora como os eventos celulares e moleculares são coordenadas permanece pouco compreendido ⁴ . O estudo dos mecanismos moleculares condução avanços morfogênese epiteliais nossa compreensão de mecanismos de desenvolvimento e fornece insights sobre Regener possívelAtive abordagens da medicina. Estes estudos têm sido dificultados pela falta de métodos eficazes de manipulação genética do epitélio salivar. Atualmente, a transdução adenoviral representa o método mais eficaz para os células epiteliais nas glândulas adultos in vivo ^5. No entanto, em explantes de embriões, mesênquima densa e a membrana basal que envolve as células epiteliais viral impede o acesso às células epiteliais. Se o mesênquima é removida, o epitélio pode ser transfectado utilizando adenovírus, e rudimentos epiteliais pode retomar a morfogénese ramificação na presença de Matrigel ou laminina-111 ^6,7. Mesênquima livre de crescimento epitelial rudimento também requer suplementação adicional com factores de crescimento solúveis e não totalmente recapitular morfogénese de ramificação tal como ocorre nas glândulas intactas ^8. Aqui descrevemos uma técnica que facilita a transdução adenoviral de células epiteliais e cultura do e transfectadaspithelium com mesênquima associado. Após microdissecção dos SMGs embrionárias, a remoção do mesênquima e infecção viral do epitélio com um adenovírus contendo GFP, vamos mostrar que o epitélio espontaneamente recombina com mesênquima não infectado, recapitulando estrutura intacta SMG glandular ea ramificação morfogênese. A população de células geneticamente modificadas epitelial pode ser facilmente controlada por meio de métodos padrão de microscopia de fluorescência, se fluorescentemente marcado com construções adenovirais são utilizados. O método de recombinação tecido aqui descrito é actualmente o método mais eficaz e acessível para a transfecção de células epiteliais com um vector do tipo selvagem ou mutante no interior uma estrutura de tecido complexo 3D que não requer a geração de animais transgénicos.

Protocolo

O protocolo contém quatro etapas principais, conforme representado na Figura 1. Todos os passos são descritos em pormenor. Construção do adenovírus e purificação viral deve ser realizada antes da colheita de órgãos para utilização na transdução genética das dissecados rudimentos epiteliais. Todos os padrões de precauções BSL-2 de segurança devem ser seguidas quando se trabalha com adenovírus.

1. Embrionárias de camundongos glândula submandibular colheita (SMG) e Microdissecção

1. Euthanize timed-fêmeas grávidas de ratinhos (estirpe CD-1 outbred ou ICR) usando CO ₂ narcose, seguido por deslocação cervical e cordas de colheita de embriões de ratinho no dia embrionário 13 (E13, 3-5 brotos epiteliais) seguintes procedimentos aprovados pelo IACUC institucional comitê. O dia da descoberta plug vaginal é designado como E0. As glândulas salivares podem também ser colhidas e cultivadas na fase E12, quando existe um único botão primário e do caule com fendas apenas começandopara iniciar. SMGs anteriores a esta fase requer diferentes condições de cultivo que os indicados aqui.
2. Transferir cordas de embriões em estéreis 10 centímetros pratos de cultura de tecido cheias com 25 ml de DMEM / Ham 's Medium F12 (F12) sem vermelho de fenol (Life Technologies), suplementado com 100 U / penicilina ml e 100 ug / ml de estreptomicina (pen-strep, Life Technologies).
3. Usando um bisturi estéril (# 11 lâminas) e fórceps (# 5, Ferramentas Ciência Fine, 11.252-20), remova os embriões dos sacos em um prato separado 10 centímetros contendo 25 ml de DMEM/F12 + pen-strep.
4. Cortar as cabeças de embriões com um corte angular, logo abaixo do maxilar inferior.
5. Isolar as mandíbulas inferiores das cabeças sob um microscópio de dissecação estéreo com uma base de luz transmitida (Nikon SMZ645 ou equivalente), utilizando um corte abaixo do maxilar superior. Colocar os tecidos em cima de uma peça extra de vidro, em vez de directamente sobre o elemento de vidro da base do microscópio.
6. Recolha as mandíbulas inferiores em 3 ml de DMEM/F12 + pen-strep em um prato de 35 milímetros estéril de cultura de tecido.
7. Coloque uma fatia mandíbula na platina do microscópio de dissecação, de modo que a lingueta está na parte inferior da fatia, mas está a apontar para a posição 0:00 horas.
8. Usando um dos lados de duas pinças cruzadas em um movimento de tesoura, remover e descartar o ^rd 1/3 inferior da fatia de mandíbula.
9. Transformar a fatia de 90 ° para a direita (se destro) e, usando um corte de tesoura com o fórceps, cortar a parte superior da fatia da mandíbula (sem corte da língua) na metade da fatia.
10. Descascar o tecido em excesso e removê-la para expor as SMGs por baixo. Haverá um de cada lado, perto da base da língua.
11. Usando um par de fórceps para segurar o tecido pela língua, usar o fórceps outros para provocar a SMG longe da língua. Repita o processo para a glândula outro.
12. Recolher as glândulas salivares microdissecadas em 3 ml de DMEM/F12 + pen-strep em um tecido estéril 35 milímetros novoplaca de cultura. Nota: as glândulas submandibulares maiores (3-5 brotos epiteliais), juntamente com a mais pequena glândula sublingual conectado (1 bud) podem ser cultivadas intactas saltando a etapa 4 e realizando os passos 4.1, 4.3, e 4.4, como descrito anteriormente ^2,8.

2. SMG Separação Rudiment epitelial

1. Colocar 5 (ou mais) das glândulas salivares para um fundo de vidro de 50 mm de diâmetro de micropoços prato (MatTek Corporation, P50G-1.5-14-F), contendo 200 ul de solução salina equilibrada de Hank (HBSS sem Ca ^{+ +} ou Mg ^{+ +,} Life Technologies) contendo 0,4% (v / v) de dispase (Life Technologies, cat. no. 17105-041) e incubar durante 15 min a 37 ° C.
2. Após a incubação, utilizando uma ponta de pipeta estéril de 200 ul, aspirar cuidadosamente a solução de dispase, sem perturbar as glândulas. Imediatamente adiciona-se 200 ul de meio DMEM/F12 contendo 5% (w / v) BSA (DMEM/F12-BSA, pré-esterilizado com um filtro de 0,22 ^ M) para neutralizar a dispase.
3. Sob um microscópio de dissecação, usando um par de pinças com pontas finas (# 5 Dumostar, Ferramentas Ciência Fine, 11.295-20), gentilmente separar o mesênquima solto ao redor dos botões SMG epiteliais e dutos, tendo o cuidado de deixar o epitélio intacto .
4. Pré-molhada estéril 200 ponteira ul com DMEM/F12-BSA mídia e gentilmente pipetar os rudimentos epiteliais em um 50 milímetros de diâmetro novo prato micropoços contendo 200 ul de DMEM/F12 + caneta strep. Use uma alta qualidade de 200 ul de ponta da pipeta com uma extremidade lisa.
5. No prato que contém as peças mesênquima, descartar qualquer tecido não-mesenquimal, incluindo as glândulas sublinguais e quaisquer destacadas botões de glândulas submandibulares.

3. A infecção adenoviral de Rudiments Epiteliais

1. Fazer 200 ul de meios de infecções virais através da diluição do adenovirus de interesse em DMEM/F12 + pen-strep em um tubo de microcentrífuga, de modo que o título da solução resultante é 1x10 ⁸ -10 ⁹ PFU. Otítulo óptimo requerido para diferentes vírus podem variar. É importante a utilização de cloreto de césio (CsCl), preparações purificadas virais para a eficiência de absorção óptima.
2. Remova a mídia do prato contendo os cinco rudimentos epiteliais. Rapidamente adicionar 200 ul do meio de infecção, mantendo-se os rudimentos húmida em todos os momentos. Tome precauções necessárias ao manuseio do vírus e eliminação de pontas de pipeta contaminados. Desinfectar as superfícies contaminadas com vírus solução de água sanitária a 10%.
3. Mover os rudimentos epiteliais longe um do outro, com uma pinça para evitar que fiquem colados e permitir que elas se depositem no fundo da placa. Incubar rudimentos em meios virais durante 1 hora à temperatura ambiente. Durante a incubação, a separação dos rudimentos, se eles se movem juntos. Balanço excessivo ou movimento vai permitir que as glândulas a se aglutinarem.
4. Após a incubação, remova a mídia viral contendo e descartar adequadamente, tendo o cuidado de não perturbar o rudiments. Adicionar 200 ul de DMEM/F12 + pen-strep. Repita esta lavagem pelo menos mais duas vezes e substituir com 200 ul de DMEM/F12 + pen-strep mídia. Estas lavagens são críticos para remover qualquer vírus que não está fortemente ligado ao epitélio e para evitar a infecção do mesênquima.
5. Incubar rudimentos epiteliais com 200 ml de DMEM/F12 contendo 2% (v / v) de Matrigel (BD Biosciences, 356231) durante 20 minutos. Descobrimos que esta incubação curto em Matrigel minimiza a regressão das fissuras existentes, durante o período de cultura inicial, mas este passo pode ser omitido se a exposição a Matrigel não é desejado.

4. Cultura ex vivo de SMGs recombinados

1. Colocar cada rudimento, um de cada vez, usando uma pré-molhado 200 ul ponta de pipeta, em cima de um (pequeno corte) com entalhe 13 mm, 0,1 um Nuclepore Track-Etch membrana de filtro (Whatman) que flutuam mais de 200 uL de meio de cultura ( 5 rudimentos / filtro) em uma microplaca com fundo de vidro. Os meios de culturaé: DMEM/F12 + pen-strep contendo 50 ug / ml de transferrina e 150 mg de ácido ascórbico / ml, conforme descrito anteriormente ^2,8. Transferrina é conhecido por estimular a sobrevivência e ramificação morfogénese de glândula salivar e de outros órgãos explantes ^9. Adição de ácido ascórbico foi mostrado para estimular SMG ramificação. ¹⁰ É conhecido por actuar como um cofactor em reacções de hidroxilação de muitos processos metabólicos (tais como a hidroxilação de prolina durante a formação de colagénio fibra ¹¹⁾ e também estimula a produção de fibronectina e laminina em explantes de outros órgãos ^12.
2. Remover como meios muito em cima do filtro que possível após a adição de cada um rudimento epitelial. Media muito em cima do filtro pode causar o filtro para afundar, enquanto meios menos torna a colocação dos rudimentos mesênquima e muito mais fácil. Mídia em excesso pode ser removido quer com uma ponta de pipeta ou usando uma pinça para agarrar os meios de comunicação entre as pontas.
3. Peças mesenquimais derivadas lugar from 3-4 glândulas na parte superior e / ou em torno de cada um rudimento epitelial. Remova qualquer mídia extra que está ao redor das glândulas para evitar o movimento do mesênquima longe dos rudimentos. Mesênquima derivado mais glândulas não é benéfico, mas pode ser menos prejudicial para o crescimento rudimento epitelial.
4. Incubar SMGs recombinados num incubador humidificado (95% de ar / 5% CO _2), a 37 ° C durante 48 -72 horas, conforme desejado.
5. Adquirir claro e / ou imagens fluorescentes das glândulas ao vivo a 0 h (se desejado), duas horas após a recombinação e cada hora 24, depois disso, um microscópio de luz invertida, na posição vertical, ou estéreo equipado com uma câmara digital, utilizando um objetivo de ampliação 4X ou 5X para capturar toda a glândula recombinada em um único quadro de vista. Imagens da glândula salivar mostrar o melhor contraste usando a configuração de campo claro ou o anel de fase apropriado colocado a meio caminho para o percurso da luz (que não é possível no totalmente automatizados microscópios). Contraste de fase normal hát necessário uma vez que a glândula é grossa e cria contraste.
6. Nas desejados pontos de tempo, SMGs recombinados pode ser fixo durante 20 minutos com solução de fixação constituídos por 2% de paraformaldeído (PFA) em 1X PBS contendo 5% (w / v) de sacarose (para melhor preservar a estrutura celular interna, mantendo as células em um estado isosmótica). Ao contrário de PFA a 4%, 2% PFA irá preservar uma quantidade significativa do sinal de GFP, se o fixador estiver completamente removido após a fixação. Glândulas pode ser armazenado durante até 1 semana, em 1X PBS no escuro a 4 ° C até que toda a imunocitoquímica de montagem e de imagem confocal é realizada, como relatado anteriormente ^3,6,13-15. Idealmente, imunocitoquímica e imagem deve ser realizada logo após a fixação de obter imagens de melhor qualidade. Glândulas também podem ser lisadas em tampão RIPA para SDS-PAGE seguido por Western blotting.

Resultados

O fluxo dos principais passos experimentais é apresentada na Figura 1. Um exemplo de um SMG intacto, um rudimento isolado epitelial, e sua mesênquima correspondente são mostrados na Figura 2. As imagens de campo claro de SMGs recombinadas, que continuam a sofrer de ramificação morfogénese quando cultivadas ex vivo para os tempos indicados, são mostrados na Figura 3. Glândulas recombinados cultivadas durante 48 horas expressando GFP epitelial são mostra...

Discussão

O ex vivo técnica de recombinação epitelial-mesenquimal foi publicado em glândulas salivares submandibulares em 1981 ^16. Neste protocolo, expandir-se no método original, utilizando infecção adenoviral para manipular a expressão de genes das células epiteliais, no contexto de uma glândula recombinada. Mostra-se que a percentagem de células epiteliais infectadas com o adenovirus, enquanto que a percentagem de células que estão infectadas depende das propriedades do promotor viral, titulaç...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
DMEM / Ham 's F12 Medium sem vermelho de fenol	Life Technologies	21041-025
Penicilina e estreptomicina	Life Technologies	15070-163	Estoque 10X
Dispase	Life Technologies	17105-041	Congelar em alíquotas de utilização única de 20C-
BSA	Sigma	A2934-100G	V fração, endotoxina baixo
Adeno-X-GFP	BD Biosciences	8138-1	Deveria ser título elevado (1x10 10 pfu / ml). Vírus CsCl purificados são mais eficazes do que os vírus purificado coluna neste ensaio.
Paraformaldeído 16%	Electron Microscopy Sciences	15710	Diluída a 2% em PBS com 5% de sacarose (w / v)
1X tampão de fosfato salino (PBS)	Life Technologies	70011-044	Preparado a partir estoque 10X
Solução Salina Equilibrada de Hank	Life Technologies	14175095	sem cálcio, magnésio não, não Vermelho de Fenol
Transferrina	Sigma	T8158	25 mg / ml de solução stock de DMEM/F12 media. Congelar de uso único alíquotas a-20C
Ácido L-ascórbico (Vitamina C)	Sigma	A4403	75 mg / ml de solução stock de DMEM/F12 media.Freeze de uso único alíquotas a-20C
			Tabela 1. Lista dos reagentes necessários para a SMG protocolo recombinação.
10 centímetros pratos de plástico estéreis	Corning	430167	Placas de cultura de tecido não--tratados podem também ser usados.
Estereomicroscópio estéreo com base de luz transmitida	Nikon	SMZ645	Qualquer estéreo microscópio de dissecção podem ser utilizadas, que tem uma base de luz transmitida.
35 placas de cultura de tecidos milímetros	Falcão	353001	Placas de cultura de tecido não--tratados podem também ser usados.
50 mm de diâmetro pratos micropoços	MatTek Corporação	P50-G-1.5-14F
Nuclepore Track-Etch filtros de membrana	Whatman	110405	13 mm de diâmetro, tamanho de poro 0,1 milímetros
Widefield microscópio de fluorescência	Carl Zeiss, EUA	Axio Observer Z1	Qualquer microscópio de fluorescência (de pé, inverted ou estéreo microscópio de dissecção) pode ser utilizado para monitorizar a expressão da GFP em baixa ampliação com uma câmara anexa digital.
Microscópio confocal	Leica Microsystems	TCS SP5	Microscopia confocal é necessário ver estruturas celulares detalhados. Qualquer microscópio confocal pode ser usado.
Timed-fêmeas grávidas de ratinhos, tensão CD-1 ou ICR	Charles River Labs		Os embriões são colhidos no dia 13 (dia da descoberta com tampão designado como dia 0).
Lâmina de bisturi n º 11	Belas Science Tools	10011-00
Cabo de bisturi n º 3	Belas Science Tools	10003-12
Dumont n º 5 fórceps liga de inox, 0.05mm X 0,02 milímetros	Belas Science Tools	11252-20	Ideal para a colheita de embriões glândulas
Dumont n º 5 fórceps liga dumostar, 0.05mm X 0,01 milímetros	Belas Science Tools	11295-20	Pontas finas são necessárias para a remoção do epitélio mesênquima. Agulhas de tungsténio também podem ser usados.
			Equipamento Tabela 2. Usado em SMG protocolo recombinação.