唾液腺器官培養の遺伝子改変と再結合

要約

遺伝的に全体の内の上皮細胞を操作する技術 ex vivoで培養胚マウス顎下腺（サブマシンガン）が記述されている。この方法では、自発的にアデノウイルスベクターを用いた上皮初歩の分離及び感染後再結合する上皮と間充織をSMGの生得的な能力を活用しています。

要約

分枝形態形成することは、多くの臓器の開発中に発生し、マウス胎児の顎下腺（SMG）は、分枝形態形成の研究のための古典的なモデルである。 ^-最終的に口腔¹に、それぞれ、唾液を生産し、変更/輸送するために役立つ腺やダクトの複雑な分岐鎖のネットワークを生じさせるために、上皮芽とダクト形成のステップを反復開発SMGでは、このプロセスが含まれます^3。細胞および分子イベントがコーディネートされている方法が、これらの細胞によって産生される間葉細胞、成長因子や細胞外マトリックスを含む上皮関連基底膜と間葉コンパートメントの側面は、、、、分岐メカニズムに不可欠な貧弱^4を理解^して残っている。分子メカニズムの研究では、上皮の形態形成の進歩の発達メカニズムの理解を推進し、可能レーゲナーへの洞察を提供ative医学的アプローチ。このような研究は、唾液上皮の遺伝子操作のための効果的な方法が不足しているため妨げられてきた。現在、アデノウイルス形質導入は 、in vivo ⁵ で成人腺上皮細胞を標的とするための最も効果的な方法を表しています。しかし、胚外植片に、緻密間葉と上皮細胞を取り巻く基底膜は、上皮細胞へのウイルスのアクセスを妨げている。間充織が削除された場合は、上皮はアデノウイルスを用いてトランスフェクトすることができ、および上皮初歩はマトリゲルまたはラミニン-111 ^6,7の存在下で分岐形態形成を再開することができます。間葉フリー上皮原基の成長はまた、可溶性増殖因子と追加の補充を必要とし、それをそのまま腺⁸で発生したような完全に分岐形態形成を再現していません。ここでは、トランスフェクトされたeの上皮細胞と文化のアデノウイルス形質導入を容易にする技術を説明関連した間充織とpithelium。胚のサブマシンガン、間葉の除去、およびGFP含有アデノウイルスによる上皮のウイルス感染の顕微解剖に続いて、我々はそのままSMG腺構造をrecapitulatingと分枝形態形成、上皮が自発的に感染していない間充織と再結合することを示している。蛍光タグ付きアデノウイルスコンストラクトが使用されている場合、遺伝的に修飾された上皮細胞集団は簡単に、標準的な蛍光顕微鏡法を使用して監視できます。ここで説明された組織の組換え方法は、現在、トランスジェニック動物の生成を必要としない複雑な3次元組織構築物内に野生型または変異型ベクターを用いた上皮細胞のトランスフェクションのための最も効果的かつアクセス可能な方法である。

プロトコル

プロトコルは、 図1に示した4つの主要な手順が含まれています。すべての手順が完全に詳細に記載されています。アデノウイルスの構築およびウイルス精製は解剖上皮初歩の遺伝形質で使用するための臓器摘出の前に実行する必要があります。アデノウイルスを扱うときは、すべての標準的なBSL-2の安全上の予防措置に従うべきである。

1。マウス胚性顎下腺（SMG）の収穫と顕微解剖

1. 胎生13日目のマウス胚の頸椎脱臼や収穫列（E13、3-5上皮芽）制度の動物実験委員会によって承認され、次の手順に続いて、CO ₂ナルコーシスを使用してタイムアウト妊娠雌マウス（非近交系の系統のCD-1またはICR）を、安楽死させる委員会。膣栓の発見の日は、E0として指定されています。始まったばかりクレフトを持つ単一の主芽と茎がある場合には唾液腺もE12の段階で収穫し、培養することができる開始します。この前のステージにサブマシンガンは、ここで示されたものとは異なる培養条件が必要です。
2. フェノールレッド（Life Technologies社）および100 U / mlのペニシリン、100μg/ mlストレプトマイシン（ペン連鎖球菌を欠いたDMEM /ハムF12培地（F12）25mlを充填した無菌の10cmの組織培養皿に胚の文字列を転送する、ライフテクノロジーズ）。
3. 滅菌メス（＃11ブレード）や鉗子（＃5、ファイン科学ツール、11252から20）を使用して、DMEM/F12 +ペン連鎖球菌の25ミリリットルを含む別々の10cm皿に嚢から胚を取り除く。
4. ちょうど下顎下の斜めのカットで胚の頭部を切断。
5. 上顎下のカットを使用した透過光ベース（ニコンSMZ645または同等品）を装備するステレオ解剖顕微鏡下で頭から下顎を分離します。ガラスの余分な部分の上に直接ではなく、顕微鏡ベースのガラス成分に組織を置く。
6. DMの3ミリリットルに下あごを収集無菌35mmの組織培養皿の中EM/F12 +ペン連鎖球菌。
7. 舌がスライスの底面にありますが、12時00時の位置に向かって指しているので、解剖顕微鏡ステージ上顎骨スライスを置きます。
8. シザリング動きの2つの交差したピンセットの片側を使って、下顎のスライスの下^1/3を削除し、破棄します。
9. 右（右利きの場合）にスライス90°回して、ピンセットではさみカットを使用して、途中でスライスに下顎骨スライスの先頭部分（舌を切断せずに）切る。
10. 離れて余分な組織をはがし、下にサブマシンガンを露出させるためにそれを削除します。舌の付け根付近各側に1つあるでしょう。
11. 舌でティッシュを押したままにする鉗子の1ペアを使用して、舌からSMGを離れていじめるために他の鉗子を使用しています。他の腺について、この手順を繰り返します。
12. 新しい無菌の35ミリメートル組織にDMEM/F12 +ペン連鎖球菌の3ミリリットルに顕微唾液腺を収集培養皿。注意：以前に^2,8を説明するように、接続され小さい舌下腺（1芽）と共に大きく顎下腺は（3-5上皮芽）、4と実行手順4.1、4.3、および4.4のステップにスキップすることにより無傷で培養することができる。

2。上皮性原基の分離をSMG

1. 場所5（またはそれ以上）のハンクス平衡塩溶液（HBSSはCa ^{+ +}やMg ^{+ +のを}欠い^て 、200μlを含むガラス底、直径50mmのマイクロウェルディッシュ（マテック株式会社、P50G-1.5-14-F）の中に唾液腺Life Technologies社）を0.4％含有する（v / v）のディスパーゼ（Life Technologies社、カタログ番号17105から041）と、37℃で15分間インキュベート℃、
2. インキュベーション後、200μlの滅菌ピペットチップを用いて、慎重に腺を乱すことなくディスパーゼソリューションを吸引します。直ちにディスパーゼを中和するために5パーセントを含むDMEM/F12培地200μlの（w / v）BSAを（DMEM/F12-BSA、0.22μmのフィルターで滅菌済み）を追加します。
解剖顕微鏡下では、細かいヒント（＃5 Dumostar、ファイン科学ツール、11295から20）とピンセットを使って、優しく上皮をそのままにしておくように注意しながら、SMGの上皮芽やダクト周りから緩めの間充織を分離。
3. DMEM/F12-BSAメディアやそっとでプリウェット滅菌200μlのピペットチップはDMEM/F12 +ペン連鎖球菌の200μlを含む新しい50mm径のマイクロウェル皿に上皮初歩を移します。滑らかなエッジを持つ高品質の200μlのピペットチップを使用しています。
4. 間葉片が含まれている皿の中で、舌下腺、デ​​タッチされた顎下腺のつぼみを含む、任意の非間葉組織を捨てる。

3。上皮初歩のアデノウイルス感染

1. 得られた溶液の力価は1×10 ^{8〜10 9} PFUsなるようにマイクロチューブにDMEM/F12 +ペン連鎖球菌に興味のあるアデノウイルスを希釈することにより、ウイルス感染の媒体の200μlを加える。ザ異なるウイルスに要する最適な力価は変わる場合があります。塩化セシウム（セシウム）に精製された最適な取り込み効率のためのウイルス調製物を使用することが重要です。
2. 5上皮初歩を含む皿からメディアを取り出します。すぐにすべての回で基礎が濡れ保ち、感染メディアの200μlを添加する。ウイルスを処理し、汚染されたピペットチップの処分に必要な予防措置を取る。 10％漂白剤溶液を用いて、任意のウイルスに汚染された表面を消毒してください。
3. くっつくのを防ぐし、それらがプレートの底に沈殿できるように鉗子で互いに離れ上皮初歩を移動します。室温で1時間ウイルスメディアの初歩をインキュベートする。彼らが近くに一緒に移動した場合のインキュベーションの間に、基礎を分離します。過度の揺れや動きが腺が一緒に凝集することができます。
4. インキュベーション後、そっと、ウイルス含有培地を除去し、適切に廃棄し、rを混乱させないように注意しながらudiments。 DMEM/F12 +ペン連鎖球菌の200μlを添加する。この洗浄は、少なくとも2回以上繰り返すとDMEM/F12 +ペン連鎖球菌メディア200μlと交換してください。これらの洗浄は強く上皮に添付されていない任意のウイルスを除去し、間充織の感染を防ぐために重要です。
5. DMEM/F12 200ml中で20分間、2％（v / v）のマトリゲル（BD Biosciences社、356231）を含有する上皮初歩をインキュベートする。我々は、マトリゲルでこの短いインキュベーションは、初期培養期間中に既存裂の退縮を最小限に抑えますが、マトリゲルへの暴露が望まれていない場合は、このステップを省くことができますを見つける。

再結合サブマシンガンの4。 エクスビボ文化

1. ノッチ（小カット）の上に、プリウェット200μlのピペットチップを用いて、各原基を、一つずつ置く13ミリメートル、0.1μmの培地を200μl（浮かんNucleporeトラックエッチメンブレンフィルター（ワットマン）ガラス底マイクロウェルプレートに5初歩/フィルタ）。培地次のとおりです。DMEM/F12 +ペン連鎖球菌は、50μg/ mlのトランスフェリンおよび150μg/ mlのアスコルビン酸を含む、前述のように^2,8は 。トランスフェリンは生存を刺激することが知られており、唾液腺や他の器官外植片⁹の分枝形態形成されています。アスコルビン酸の添加は、SMGは分岐を刺激することが示されている図^10は、それが代謝経路（例えば、コラーゲン線維の形成¹¹時プロリン水酸化など）の多くの水酸化反応における補因子として作用することが知られ、また、他の臓器の外植片におけるフィブロネクチンおよびラミニン産生を刺激される^12。
2. 各上皮原基を追加した後、できるだけフィルターの上にできるだけ多くのメディアを取り出します。小さいメディアは初歩の配置を行い、はるかに容易に間充織間フィルターの上にあまりにも多くのメディアは、フィルタがシンクすることがあります。余分なメディアをピペットチップでまたは先端間のメディアを把持する鉗子を使用することによって、削除することができます。
3. あちこち由来間葉片を置きメートル上に三から四腺および/または各上皮性原基の周りに。離れて初歩から間葉の動きを避けるために、腺を取り囲んでいる余分なメディアを取り出します。有益ではありませんが、あまり上皮原基の成長に有害であることができるより多くの腺由来間葉。
4. 必要に応じて、48 -72時間37℃加湿インキュベーター（95％空気/ 5％CO _2）内で再結合サブマシンガンをインキュベートする。
5. 明視野および/または蛍光0時間でのライブ腺の画像（必要な場合）、組換え後2時間およびに4Xまたは5X倍率の対物レンズを使用してデジタルカメラを装着し、倒立正立、またはステレオの光学顕微鏡でその後は24時間を取得するビューの1つのフレームに再結合された全体の腺をキャプチャします。唾液腺の画像は、明の設定や（完全に自動化された顕微鏡では不可能である）光路内の途中に配置され、適切な位相リングのいずれかを使用して最高のコントラストを示す。標準位相コントラストは、noです腺が厚いとコントラストを作成するので、トン必要。
6. 希望の時点では、再結合されたサブマシンガンが良いで細胞を維持することにより、内部細胞構造を維持するために5％（w / v）スクロースを（含む1X PBS中2％パラホルムアルデヒド（PFA）製の固定液で20分間固定することができます等浸透圧性の状態）。固定剤が完全に固定した後に削除された場合は4％PFA、2％とは違ってPFAは、GFPシグナルのかなりの量を保存します。腺を4℃の暗所で1×PBSで1週間まで保存することができる°Cのホールマウント免疫細胞化学と共焦点イメージングが実行されるまで、前述^3,6,13-15報告した。理想的には、免疫細胞化学およびイメージングは​​、最高品質の画像を得るために固定した後すぐに実行する必要があります。腺はまた、ウエスタンブロット分析に続いて、SDS-PAGE用のRIPA緩衝液で溶解することができる。

結果

主要な実験手順のフローを図1に概説されています。無傷のSMGは、隔離された原基上皮、およびそれに対応する間充織の例を図2に示す。ときに指示された時間のために培養されたex vivoで分岐形態形成を継続して受ける組み換えられたサブマシンガンの明視野像を図3に示す。上皮GFPを発現している48時間成長させ再結合腺が図4

ディスカッション

ex vivoでの上皮間葉組換え技術は、1981年に初めて¹⁶で顎下唾液腺のために公開されていました。このプロトコルでは、再結合された腺のコンテキスト内で上皮細胞の遺伝子発現を操作するためにアデノウイルス感染を用いて、元のメソッドを拡張。感染している細胞の割合は、ウイルスプロモーターの性質、ウイルス力価およびウイルス純度に依存するのに対し、我々は、上皮...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号	注釈
フェノールレッドを含まないDMEM /ハムF12培地	ライフテクノロジーズ	21041-025
ペニシリンおよびストレプトマイシン	ライフテクノロジーズ	15070-163	10X株式
ディスパーゼ	ライフテクノロジーズ	17105-041	-20Cで単一使用アリコートを凍結
BSA	シグマ	A2934-100G	フラクションV、低エンドトキシン
アデノX-GFP	BD Biosciences社	8138から1	高力価（1×10 10 pfu / ml）をする必要があります。セシウム精製ウイルスは、このアッセイにおいて、カラム精製ウイルスよりも効果的です。
16％パラホルムアルデヒド	電子顕微鏡学	15710	5％スクロース（w / v）を含むPBS中2％に希釈
1Xリン酸緩衝食塩水（PBS）	ライフテクノロジーズ	70011-044	10Xストックから調製
ハンクス液	ライフテクノロジーズ	14175095	全くカルシウムなし、マグネシウム、無フェノールレッド
トランスフェリン	シグマ	T8158	25ミリグラム/ DMEM/F12メディアにおけるミリリットル原液。 -20Cでシングルユースのアリコートを凍結
L-アスコルビン酸（ビタミンC）	シグマ	A4403	-20CでDMEM/F12 media.Freezeシングルユースのアリコートで75 mg / mlの原液
			表1。組み換えプロトコルをSMGに必要な試薬のリスト。
10センチメートル滅菌したプラスチック製の皿	コー​​ニング	430167	非組織培養処理プレートを使用することもできます。
透過光ベース付きステレオ解剖顕微鏡	ニコン	SMZ645	顕微鏡を解剖し、あらゆるステレオ、透過光のベースを持っていることを使用することができます。
35ミリメートルの組織培養皿	ファルコン	353001	非組織培養処理プレートを使用することもできます。
直径50mmのマイクロウェル皿	マテック株式会社	P50-G-1.5-14F
Nucleporeトラックエッチメンブレンフィルター	ワットマン	110405	直径13mm、0.1mmの細孔径
広視野蛍光顕微鏡	カールツァイス、米国	アクシオオブザーバーZ1	任意の蛍光顕微鏡（直立、Invertedまたはステレオ解剖顕微鏡）添付されたデジタルカメラで低倍率でGFPの発現をモニターするために使用することができます。
共焦点顕微鏡	ライカマイクロシステムズ	TCS SP5	共焦点顕微鏡は、詳細なセル構造を参照してくださいする必要があります。任意の共焦点顕微鏡を使用することができます。
時限妊娠雌マウス、ひずみのCD-1またはICR	チャールズリバー研究所		胚は13日（0日として指定されたプラグインの発見の日を含む）に収穫されます。
メスの刃＃11	ファイン科学ツール	10011から00
スカルペルハンドル＃3	ファイン科学ツール	10003から12
デュモン＃5鉗子INOX合金、0.05ミリメートルX 0.02ミリメートル	ファイン科学ツール	11252から20	胚から腺を収穫するための理想的な
デュモン＃5鉗子dumostar合金、0.05ミリメートルX 0.01ミリメートル	ファイン科学ツール	11295から20	ファインヒントは上皮から間葉を除去するために必要とされる。タングステン針を使用することもできます。
			表2機器組プロトコルをSMGで使用されます。