عزل والخلايا اللمفاوية المناعية والخلايا الجذعية من الفئران باير لالرقع

Summary

هناك اهتمام متزايد في فهم وظائف مناعية المجموعات السكانية الفرعية معينة من الخلايا في بقع باير (PPS)، والمواقع الأساسية استقرائي من الأنسجة اللمفاوية الأمعاء المرتبطة. نحن هنا الخطوط العريضة لإعداد بروتوكولات موازية PP الاستعدادات خلية واحدة لتحليل تدفق cytometric وcryosections PP لالمناعية.

Abstract

بقع باير (PPS) جزءا لا يتجزأ من أنسجة الأمعاء المرتبطة اللمفاوية (GALT) ولعب دورا محوريا في الأمعاء والترصد المناعي التوازن. يتم أخذ عينات باستمرار مستضدات الجسيمات والجراثيم في لمعة الأمعاء من قبل خلايا M PP في ظهارة جريب المرتبطة (FAE) ونقلها إلى شبكة الكامنة وراء الخلايا الجذعية (DCS)، الضامة، والخلايا الليمفاوية. في هذه المقالة، ونحن تصف بروتوكولات التي هي ذكر المكتب الصحفى الفئران (ط) فصل في تعليق خلية واحدة وتعرض لالتدفق الخلوي و (الثاني) والتي أعدت للcryosectioning المناعية. لالتدفق الخلوي، ذكر المكتب الصحفى لفصل ميكانيكيا ثم يصفى من خلال 70 ميكرومتر الأغشية لتوليد تعليق خلية واحدة خالية من الخلايا الظهارية والحطام الكبيرة. بدءا من 20-25 ذكر المكتب الصحفى (من أربعة الفئران)، وهذه الطريقة سريعة وقابلة للتكرار غلة يبلغ عدد سكانها> 2.5 × 10 ⁶ خلايا مع> بقاء الخلية 90٪. لجديدة، cryosectioningذكر المكتب الصحفى لاي مغمورة معزولة في قطع الأمثل المتوسطة (OCT) درجة الحرارة، الأداة الإضافية المجمدة في النيتروجين السائل، ثم مقطوع باستخدام cryomicrotome. أقسام الأنسجة (5-12 ميكرون) هي الهواء المجفف، ثابتة مع الأسيتون أو الميثانول، وثم تعرض لimmunolabeling.

Introduction

بقع باير (PPS) هي المجاميع العيانية من بصيلات اللمفاوية المنظمة الحالية في جميع أنحاء الأمعاء الدقيقة للإنسان والفئران (الشكل 1) وتشكل المواقع الأساسية التي تم تهيئتها الاستجابات المناعية المخاطية ضد مستضدات الغذائية والبكتيريا المتعايشة، ومسببات الأمراض الميكروبية، واللقاحات عن طريق الفم ^1-4. على عكس الأنسجة الأخرى اللمفاوية الطرفية مثل العقد الليمفاوية المساريقي، ذكر المكتب الصحفى تفتقر الأوعية اللمفاوية وارد. كما هي مدفوعة، مثل الاستجابات المناعية التكيفية في ذكر المكتب الصحفى ردا على مستضدات المستمدة من تجويف الأمعاء. ويتم إنجاز أخذ عينات من المستضدات لمعي من قبل ظهارة جريب المرتبطة (FAE)، الذي يتكون من كل من الخلايا المعوية ومستضد أخذ العينات المعروفة باسم الخلايا M. تحت FAE، في قبة شبه الظهارية (SED) المنطقة، وتقع شبكة من الخلايا الجذعية (DCS) تتداخل مع الضامة، والخلايا B، وCD4 ⁺ T الخلايا ^5-9. في صميم كل follicl اللمفاوية PPه هي الخلايا الجذعية الجريبي (FDCS) وخلية الغنية المركزية B مركز جرثومي، ويحيط بها مناطق T بين الجريبات الخلية الغنية. أخذ العينات بواسطة المستضد النتائج ذكر المكتب الصحفى في تطوير خلية + B ايغا plasmablasts وCD4 ⁺ الخلايا المستجيب والذاكرة التي الصفيحة المخصوصة البذور المحيطة ومنح الحصانة لمجموعة واسعة من الغزاة المخاطية.

تشريح الأحداث المناعية المعقدة المرتبطة مستضد أخذ العينات، وتجهيز، وعرض في ذكر المكتب الصحفى هو مهمة شاقة، بالنظر إلى أن خلايا PP لا تشكل سوى نسبة ضئيلة من الخلايا اللمفاوية في مجموع مخاطية الأمعاء. للمساعدة في توصيف في المختبر من خلايا في هذه البيئة، ونحن نقدم لإعداد بروتوكول مجموع الماوس خلايا PP لتحليل تدفق cytometric والوظيفية، وكذلك بروتوكول لإعداد PP cryosections المناعي للفحص المجهري وimmunohistology. لدينا بروتوكول لعزل وتوصيف، والمناعية من مذكرات التفاهمه خلايا PP ليست رواية في حد ذاتها، كما يتضح من حقيقة أن هناك إشارات عديدة يعود تاريخها إلى أكثر من 25 عاما أن أذكر هذه التقنيات ^5،6،9-11. بدلا من ذلك، لدينا بروتوكول يوفر مبسطة (والبصرية) للمحققين طريقة جمع ذكر المكتب الصحفى للمرة الأولى. ويتقن تقنيات بسهولة وصفنا وتسفر بسهولة أعداد كبيرة من الخلايا مع> بقاء الخلية 90٪. بروتوكول cryosectioning ينتج المسلسل أقسام استنساخه للغاية مثاليا للتلوين المناعي والتصوير مبائر. وعلاوة على ذلك، لدينا بروتوكول يكمل الأخريين إن الرب المقالات الأخيرة. الأولى، من قبل فوكودا والزملاء، يصف استخدام المقايسات ligated حلقة اللفائفية لتقييم امتصاص البكتيريا المسببة للأمراض من قبل خلايا M PP ^12. الآخر، من خلال Geem والزملاء، ويصف العزلة وتوصيف البلدان النامية والضامة من الغشاء المخاطي المعوي الماوس، لكنه يستثني صراحة من ذكر المكتب الصحفى تحليل ال ¹³.

Protocol

وتم إيواء الحيوانات تحت التقليدية وشروط محددة خالية من مسببات الأمراض وعولج في الامتثال الكامل لمركز رعاية الحيوان في ادسورث المؤسسية واستخدام المبادئ التوجيهية للجنة (IACUC).

1. عن طريق الفم بالتزقيم

1. (اختياري) سلالة تسمين الماوس في الاختيار مع مستضد أو الميكروبات ذات الاهتمام باستخدام مجموعة ال 22 x1.5 في. بصراحة نهاية إبرة التغذية (بوبر العلمية، نيو هايد بارك، نيويورك). يجب تسليم كميات لا يتجاوز 400 ميكرولتر في الماوس.

2. عزل خلايا PP لقياس التدفق الخلوي

1. الموت ببطء الفئران خنقا ₂ CO، وفقا لرعاية الحيوانات المؤسسية واستخدام المبادئ التوجيهية للجنة (IACUC).
2. تطهير البطن مع الايثانول 70٪ أو betadine قبل الجراحة. إجراء البطن القياسية التي تنطوي على واحد (1 سم) شق الصف باستخدام مقص جراحي على طول خط الوسط بداية حوالي 1.5 سم من قاعدة القفص الصدري. فضح فيitoneal تجويف وتحديد الأعور. قص الأمعاء الصغيرة الطرفية عند تقاطع اللفائفية-الأعور وإزالة بلطف الأمعاء بكاملها. والحرص على عدم hyperextend الأنسجة المعوية كما يتم إزالته من التجويف البريتوني.
3. وضع الأمعاء الدقيقة على سرير من المناشف الورقية الرطبة أو Kimwipes. الرطب الأمعاء الدقيقة بلطف مع المياه المالحة لمنع الجفاف الأنسجة. ذكر المكتب الصحفى تحديد بصريا الفردية تقع على الجانب مضادة للالمساريقي من الأمعاء (الشكل 1). عادة، وهي واحدة من الفأرة من 5 إلى 10 ذكر المكتب الصحفى مرئية التي يتم توزيعها بالتساوي من العفج (القريبة) لالدقاق (البعيدة). في المتوسط، سوف تسفر عن فئران 4 23 ذكر المكتب الصحفى.
4. باستخدام مقص جراحي منحني، ذكر المكتب الصحفى الفردية المكوس بلطف ووضعها في محلول ملح الباردة هانك المتوازن (HBSS). ملاحظة، يجب وضع المقص منحنى الجانب الأعلى فقط فوق PP ثم تطبق بلطف على الأنسجة. المكوس فقط PP (لا surroundiنانوغرام الأنسجة) ونقل إلى HBSS الباردة.
   ملاحظة: يجب أن يتم كل حضانات والخطوات الطرد المركزي من هذه النقطة إلى الأمام في القسم 2 في 4 درجات مئوية للحفاظ على بقاء الخلية.
5. ذكر المكتب الصحفى نقل إلى 5 مل الطحال التفكك المتوسطة واحتضان لمدة 15-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حين تهز بقوة في 250 دورة في الدقيقة. وتعد فترة حضانة تؤثر سلبا على بقاء الخلية.
6. لإنشاء تعليق خلية واحدة، ذكر المكتب الصحفى مكان على معقمة (تعقيمها) ميكرومتر النايلون 70 مصفاة الخلية شبكة وطحن بالقوة الأنسجة في شبكة باستخدام قاعدة من المكبس من المحاقن سم مكعب 1. بدلا من ذلك، ذكر المكتب الصحفى شطيرة بين اثنين بلوري العقيمة الشرائح المجهر والزجاج (تعقيمها في مظاريف) وتطحن بلطف الأنسجة مع الحركة ذهابا وإيابا. استخدام ماصة نقل معقمة لنقل التعليق الخلية في أنبوب فالكون 5 مل.
7. إضافة إلى EDTA تركيز النهائي من 1 ملم إلى تعليق الخلية. احتضان على الروك ل5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
8. صب التعليق الخلية من خلال 70 ميكرون في الثانية مصفاة لإزالة أي خلايا المجاميع المتبقية الخلوية أو الحطام الأنسجة. جمع الخلايا في أنبوب 15 مل المخروطية أو 50.
9. موضوع الخلايا لطيف الطرد المركزي (5 دقائق في 500 XG). صب الخلايا و resuspend طاف في تدفق العازلة، التي هي الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 1٪ مصل العجل الجنين (FCS).
10. لتحديد عدد الخلايا وقدرتها على البقاء، تمييع الخلايا في الزرقاء التريبان 1:10 وتفتيش بصريا الخلايا باستخدام المجهر الخفيفة وعدادة الكريات أ. وبدلا من ذلك، يمكن استخدام عداد الخلايا الكونتيسة (إينفيتروجن) أو أداة مماثلة لتعداد الخلايا تلقائيا الأرقام وقدرتها على البقاء.
    بدءا من 20-25 ذكر المكتب الصحفى، يجب أن هذا البروتوكول تسفر> 2.5 × 10 ⁶ خلايا الكلية. وهذا يعادل 0،8-1،2 ~ × 10 ⁶ خلايا في الماوس.

الأجسام المضادة للخلايا وصفها لقياس التدفق الخلوي

<رأ بداية = "11">

الاستغناء الخلايا (10 ⁵ لكل بئر) في آبار من أسفل لوحة 96-الجولة أيضا.

موضوع لطيف لوحة لالطرد المركزي (5 دقائق في 1،000 XG)، وطاف من لوحة صب في قلب بلطف.

إعادة تعليق الخلايا في كتلة عازلة ونادي احتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة. في حين أن هناك عددا من المخازن المؤقتة المتاحة تجاريا كتلة FC (مثل الفئران لمكافحة فأر CD16/CD32، BD العلوم البيولوجية)، ونحن ببساطة استخدام قضى المتوسطة من ورم هجين B خلية فأر (ATCC 2.4.G2) التي تفرز مفتش حيدة النسيلة ₁ ضد الفئران Fcγ مستقبلات لهذه الخطوة.

موضوع لطيف لوحة لالطرد المركزي (5 دقائق في 1،000 XG) على النحو الوارد أعلاه، وطاف من لوحة صب في قلب بلطف.

إضافة fluorophore، مترافق الأجسام المضادة مباشرة إلى تعليق خلية في التخفيف المطلوب، واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة مع هزاز المستمر.

موضوع لطيف لوحة لالطرد المركزي (5 دقائق في 1،000 XG)، وصبطاف من قلب لوحة وبلطف.

غسل الخلايا مع 100 ميكرولتر من العازلة التدفق.

أجهزة الطرد المركزي لوحة في 1،000 x ج لمدة 5 دقائق، وطاف من لوحة صب في قلب بلطف.

إعادة تعليق الخلايا 400 ميكرولتر العازلة التثبيت، والذي يتألف من 300 ميكرولتر من العازلة تدفق و 100 ميكرولتر من 1٪ في بارافورمالدهيد العازلة PHEM (أنابيب 60 ملم، 25 ملم HEPES، 10 ملم EGTA، 4 ملم MgCl ₂ في الرقم الهيدروجيني 6).

الخلايا تخضع لتدفق الخلوي باستخدام FACSCalibur أو ما يعادلها. تحليل النتائج باستخدام برنامج برو النسخة المحمولة كويست 5.2.

3. إعداد Cryosections PP

1. في وقت مبكر من جمع الأنسجة، إضافة الأمثل قطع الحرارة (OCT) لمجمع قوالب مم 7x7x5 قاعدة من البلاستيك. أيضا بإعداد مجموعة من النيتروجين السائل (> 750 مل) في دلو ديوار أو الجليد.
2. الموت ببطء الماوس وإجراء laparotamy، كما هو موضح أعلاه. إزالة الأمعاء ووضعت على مناشف ورقية مبللة.
3. إلىذكر المكتب الصحفى لخفض عزل cyrosectioning، شرائح 0.5 سم عرضية من الأمعاء الدقيقة تحتوي على واحد ونسيج PP نقل إلى طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني. شطف بلطف تجويف هذه الشرائح مع PBS لإزالة الحطام البراز غير المرغوب فيها.
4. وضع شرائح الأنسجة المعوية عموديا داخل قوالب قاعدة تحتوي أكتوبر تزج القوالب في النيتروجين السائل وتسمح لتجميد الأنسجة تماما (1-2 دقائق). وهذا اللون من أكتوبر من تغيير واضح إلى الأبيض عندما يتم تجميد كامل للأنسجة. . لتبريد أكثر تدرجا (على سبيل المثال للحد من تشقق OCT)، قالب تزج في حمام من نظير البنتان مع تبريد أبخرة النيتروجين السائل ملاحظة: ارتداء نظارات السلامة المناسبة عند العمل مع النيتروجين السائل.
5. إزالة قوالب قاعدة المجمدة من النيتروجين السائل باستخدام ملقط والسماح للقالب لتدفئة في درجة حرارة الغرفة فترة طويلة بما يكفي (~ 10-15 ثانية) للسماح للحواف كتلة أكتوبر لتخفيف. ثم لإزالة كتلة المجمدة من أكتوبر منالقالب، القالب عكس واضغط بلطف على ظهره لإخراج الكتلة على قطعة نظيفة × 4 سم 4 من رقائق الألومنيوم. التفاف على الفور الأنسجة في احباط وضعها في حقيبة عينة المسمى المخزنة في النيتروجين السائل أو على الثلج الجاف. بدلا من ذلك، نقل الأنسجة في الفريزر (<-20 درجة مئوية). استخدام الأنسجة في غضون أسبوع، وإلا سوف تصبح هشة لبنات مع التقدم في السن.

Cryosectioning

6. Cryosection الأنسجة باستخدام CM3050S ايكا cryomicrotome أو ما يعادلها. وينبغي ضبط درجة حرارة الغرفة على ناظم البرد -21 ° C. إلى
7. نسعى جاهدين لالمقاطع التي هي 12-14 ميكرومتر في السمك.
8. جمع المقاطع على SuperFrost فيشر زائد (أو ما يعادلها) الشرائح المجهر والزجاج، وفحص بصريا باستخدام معيار ضوء انخفاض القوة المجهر. إذا كان يتم جمعها مقاطع متعددة على شريحة، تأكد من أن تتجمع معا لتطبيقات تلطيخ المصب.
9. متجر رانه الشرائح في درجة حرارة الغرفة في صندوق الشرائح و، من الناحية المثالية، واستخدامها في غضون أيام قليلة.

وصفها الأجسام المضادة من Cryosections ومتحد البؤر المجهر التحليل

10. الشرائح تزج في الأسيتون (أو الميثانول) في جرة أو تلطيخ الأنسجة رفوف لمدة 2 دقيقة. قد يسبب الحضانة لفترات طويلة من الأنسجة لفصل الشريحة.
11. نقل الشرائح إلى تلطيخ جرة جديدة وغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني-T (1X PBS مع 0.05٪ توين-20) لمدة 3 دقائق لكل منهما.
12. تطويق المقاطع مع ImmEdge القلم مسعور. وسوف يضمن هذا ستبقى محصورة الكواشف والأجسام المضادة لتلك المنطقة خلال حضانات.
13. احتضان الشرائح في كتلة عازلة (2٪ مصل الماعز في PBS) لمدة 30 دقيقة في C ° 37 في غرفة مرطب، محمية من الضوء.
14. احتضان الشرائح العازلة مع كتلة FC (انظر أعلاه) لمدة 10 دقيقة عند 37 ° C.
15. تراجع الشرائح في PBS-T ومنطقة جافة حول أقسام باستخدام ماصة أو الأنسجة Kimwipes أخرى.والحرص على عدم لمس الأجزاء الأنسجة الفعلية.
16. أقسام الأنسجة تراكب مع حل الأجسام المضادة الأولية واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في غرفة مرطب. عادة يتم تخفيف الأجسام المضادة الأولية في كتلة عازلة للتركيز النهائي من 20 ميكروغرام / مل. استخدام الأجسام المضادة الأولية مباشرة، وصفت أمر مرغوب فيه، لأنه لا يمكن الجمع بين ما يصل الى ثلاثة أجسام مضادة مباشرة في هذه الخطوة. الأجسام المضادة التي تحمل علامات مباشرة القضاء أيضا على الحاجة إلى خطوات إضافية حضانة الأجسام المضادة.
17. غسل الشرائح 3 مرات (5 دقائق لكل منهما) عن طريق الغمر في برنامج تلفزيوني.
18. إذا لزم الأمر، والشرائح احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية ذات الصلة لمدة 30 دقيقة في C ° 37 في غرفة الرطوبة.
19. غسل الشرائح 3 مرات (5 دقائق لكل منهما) عن طريق الغمر في برنامج تلفزيوني.
20. احتضان الشرائح لمدة 4 دقائق في بارافورمالدهيد 1٪ في المخزن المؤقت PHEM، كما هو موضح أعلاه.
21. شطف الشرائح مع PBS لمدة 1 دقيقة.
22. منطقة جافة حول أقسام باستخدام Kimwipes أو غيرها من استيعابالأنف والحنجرة الأنسجة. والحرص على عدم لمس الأجزاء الأنسجة الفعلية. باستخدام ماصة أو القطارة، ضع قطرة من بلطف إطالة المتوسطة الذهب تصاعد مباشرة على القسم. تطبيق ساترة الزجاج على المدى المتوسط ​​تصاعد مع الحرص على تجنب الفقاعات. استخدام ورق النشاف لامتصاص فائض أي وسيط في تصاعد مستمر.
23. coverslips ختم على الشرائح المجهر مع طلاء الأظافر التجارية والسماح للهواء الجاف.
24. عرض الشرائح مع SP5 TCS لايكا أو المجهر متحد البؤر ما يعادلها.

النتائج

تحليل تدفق cytometric من المعلقات monodisperse من الخلايا PP مجموع يكشف عن تمييز واضح بين استعدادات جيدة الخلية والفقراء. في الخلية الاستعدادات جيدة مع بقاء أكثر من 80٪، فإن الغالبية العظمى من الخلايا إظهار مبعثر إلى الأمام عالية (FSC)، وهو مؤشر على حجم الخلايا عالية، وانخفاض مبعث?...

Discussion

في هذه المقالة، قدمنا ​​البروتوكولات موازية لإعداد التحضيرات PP خلية واحدة لتحليل تدفق cytometric والوظيفية وcryosections للالمناعية. كلتا الطريقتين هي استنساخه للغاية ويمكن الوصول إليها بسهولة، وفرت قياس التدفق الخلوي وناظم البرد المتاحة. وينبغي للمحققين مرة الأولى تجدر ا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
بند	شركة	القط. #	التعليقات (اختياري)
مجمع أكتوبر	الأنسجة تيك	4583
7x7x5 ملم قاعدة قوالب	Fisherbrand	22-363-552
ImmEdge القلم	ناقلات مختبرات	H-4000
Superfrost زائد الشرائح	الحرارية العلمية	4951
حافة شفرة شعيرة	الحرارية العلمية	4280L
المضادة للماوس CD11c-PE	eBioscience	17-0114-82
المضادة للماوس CD45R/B220-APC	BD Pharmigen	553092
المضادة للماوس CD3-FITC	BD Pharmigen	561798
المضادة للماوس CD4-PE	BD Pharmigen	553652
المضادة للماوس CD8-PE	BD Pharmigen	553032
مكافحة CD19-الماوس PercP	BioLegend	115531
هانك حل متوازن الملح (HBSS) دون الحمراء الفينول	فيشر العلمية	14175-079
70 ميكرومتر مصفاة الخلية	BD الصقر
الطحال التفكك متوسطة	وقف تقنيات الخليوي	7915
مصل الماعز	إينفيتروجن	16210-072
FC بلوك	ATCC 2.4.G2	HB-197	Supes تم الحصول عليها من خط الخلية 2.4.G2
منحني مقص	FST	14061-09
ناظم البرد	لايكا	3050S
FACS Calibur	BD
الكونتيسة خلية مكافحة	إينفيتروجن
الهيماتوكسيلين	ريتشارد ألان	7211
يوزين	ريتشارد ألان	71304
الفورمالين محلول مائي	Starplex العلمية	3661
			الجدول 1. الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة.