Et isoler immunocoloration des lymphocytes et des cellules dendritiques à partir des plaques de Peyer murin de

Résumé

Il ya un intérêt croissant pour la compréhension des fonctions immunologiques des sous-populations spécifiques de cellules dans les plaques de Peyer (PP), les sites principaux inducteurs de tissus lymphoïdes associés à l'intestin. Ici, nous décrivons les protocoles parallèles pour la préparation PP préparations cellulaires simples pour l'analyse par cytométrie en flux et cryosections PP immunomarquage.

Résumé

Les plaques de Peyer (PP) font partie intégrante des tissus lymphoïdes associées à l'intestin (GALT) et jouent un rôle central dans l'homéostasie intestinale et immunosurveillance. Antigènes particulaires et des microbes dans la lumière intestinale sont continuellement échantillonné par les cellules M PP dans l'épithélium folliculaire associée (EAF) et transportés vers un réseau sous-jacent des cellules dendritiques (CD), les macrophages et les lymphocytes. Dans cet article, nous décrivons les protocoles dans lesquels PP murins sont (i) dissociée en suspensions de cellules isolées et soumises à la cytométrie en flux et (ii) préparé pour découpe au cryostat et immunomarquage. Pour la cytométrie en flux, PPs sont dissociées mécaniquement et ensuite filtré à travers 70 pm à générer des membranes suspensions monocellulaires libres des cellules épithéliales et les gros débris. Démarrage avec 20-25 PP (à partir de quatre souris), cette méthode rapide et reproductible donne une population de> 2,5 x 10 ⁶ cellules avec> 90% de viabilité cellulaire. Pour découpe au cryostat, fraisPP ly isolés sont immergés dans la température de coupe optimale (PTOM) moyen, composant logiciel enfichable congelés dans l'azote liquide, puis sectionnée à l'aide d'un cryomicrotome. Les coupes de tissus (5-12 um) sont séchés à l'air, fixées à l'acétone ou le méthanol, puis soumis à immunomarquage.

Introduction

Les plaques de Peyer (PP) sont des agrégats macroscopiques organisés follicules lymphoïdes présents tout au long de l'intestin grêle de l'homme et la souris (figure 1) et constituent les principaux sites à laquelle des réponses immunitaires muqueuses sont engagées contre des antigènes alimentaires, les bactéries commensales, les agents pathogènes microbiens et les vaccins oraux ^1-4. Contrairement à d'autres tissus lymphoïdes périphériques tels que les ganglions lymphatiques mésentériques, PP manquent vaisseaux lymphatiques afférents. En tant que tels, des réponses immunitaires adaptatives en PP sont entraînés en réponse à des antigènes provenant de la lumière intestinale. L'échantillonnage des antigènes luminal est accomplie par l'épithélium du follicule-associé (EAF), qui se compose de deux entérocytes et l'antigène d'échantillonnage cellules appelées cellules M. Sous l'EAF, dans le dôme sous-épithélial (SED) région, se trouve un réseau de cellules dendritiques (CD) entremêlés avec les macrophages, les lymphocytes B et les lymphocytes T CD4 ^{+ 5-9.} Au cœur de chaque follicl PP lymphoïdee sont des cellules dendritiques folliculaires (FDC) et un B riche en cellules germinales centre central, flanqué de zones T interfolliculaires cellules riches. D'échantillonnage de l'antigène par les résultats PP dans le développement de plasmablastes + IgA cellules B et cellules CD4 ⁺ mémoires et effectrices que les semences de la lamina propria environnante et offrir une immunité à un large éventail d'envahisseurs muqueuses.

Disséquer les événements immunologiques complexes associées à l'échantillonnage antigène, le traitement et la présentation de PP est une tâche ardue, étant donné que les cellules PP ne constituent qu'une infime partie de la totalité des cellules lymphoïdes dans la muqueuse intestinale. Pour aider à la caractérisation in vitro de cellules dans ce contexte, nous proposons un protocole de préparation total des cellules de souris PP pour la cytométrie en flux et fonctionnelles, ainsi que d'un protocole de préparation PP cryosections pour la microscopie d'immunofluorescence et immunohistochimie. Notre protocole pour l'isolement, la caractérisation et immunomarquage des protocoles d'ententee cellules PP n'est pas nouvelle en soi, comme en témoigne le fait qu'il ya de nombreuses références datant de plus de 25 ans qui citent ces techniques ^5,6,9-11. Au contraire, notre protocole prévoit une procédure simplifiée (et visuel) méthode de collecte des enquêteurs PP pour la première fois. Les techniques que nous décrivons sont faciles à maîtriser et facile à produire un grand nombre de cellules avec> 90% de viabilité cellulaire. Le protocole de découpe au cryostat donne hautement reproductibles coupes sériées parfaitement adaptés pour immunofluorescence et la microscopie confocale. En outre, notre protocole complète deux autres articles Jove dernières années. La première, par Fukuda et ses collègues, décrit l'utilisation de tests anse iléale ligaturée à évaluer l'absorption de bactéries pathogènes par les cellules M PP ^12. L'autre, par Geem et ses collègues, décrit l'isolement et la caractérisation des cellules dendritiques et les macrophages de la muqueuse intestinale de la souris, mais exclut explicitement les PP à partir de leur analyse ¹³.

Protocole

Les animaux ont été logés dans des classiques, spécifiques exemptes d'agents pathogènes conditions et ont été traitées en parfaite conformité avec les soins du Centre Wadsworth animaux institutionnel et l'utilisation des comités (IACUC) des lignes directrices.

1. Gavage oral

1. (Facultatif) souche de souris Gavage de choix avec un antigène ou microbes d'intérêt en utilisant un G 22 x1.5-in. aiguille d'alimentation en extrémité franche (Popper scientifique, New Hyde Park, New York). Les volumes de livraison ne doit pas dépasser 400 pi par souris.

2. Isolement de cellules PP pour cytométrie en flux

1. Euthanasier les souris par le CO ₂ asphyxie, selon des soins aux animaux et utilisation comité (IACUC) des lignes directrices.
2. Nettoyer l'abdomen avec de l'éthanol à 70% ou Bétadine avant la chirurgie. Réaliser une laparotomie standard qui implique un seul (1 cm) incision à l'aide de ciseaux chirurgicaux de qualité le long de la ligne médiane début d'environ 1,5 cm de la base de la cage thoracique. Exposez le parcavité itoneal et identifier le caecum. Snip l'intestin petit terminal à la jonction iléale-caecal et retirez délicatement l'intestin dans son intégralité. Veillez à ne pas hyperextension du tissu intestinal car il est retiré de la cavité péritonéale.
3. Posez l'intestin grêle sur un lit de serviettes en papier humides ou Kimwipes. Mouiller doucement l'intestin grêle avec une solution saline pour prévenir la déshydratation des tissus. Identifier visuellement PP individuelles situées du côté anti-mésentérique de l'intestin (figure 1). En règle générale, une seule souris de 5 à 10 PP visibles qui sont uniformément réparties dans le duodénum (proximale) à l'iléon (distale). En moyenne, quatre souris va rendement de 23 PP.
4. Utilisation courbes ciseaux chirurgicaux, doucement d'accise PP individuels et les placer dans une solution froide saline équilibrée de Hank (HBSS). Remarque, les ciseaux doivent être placés courbe vers le haut juste au-dessus du PP et puis doucement appliquée au tissu. D'accise que le PP (pas surrounding tissus) et transfert à l'HBSS froid.
   Remarque: Toutes les incubations et les étapes de centrifugation de ce point de l'article 2 doit être effectuée à 4 ° C afin de préserver la viabilité des cellules.
5. Transfert PP en 5 ml Spleen dissociation moyen et incuber pendant 15-20 min à 37 ° C tout en agitant vigoureusement à 250 rpm. Le temps d'incubation plus longue affectera négativement la viabilité cellulaire.
6. À générer une suspension de cellules individuelles, sur un lieu PP stérile (autoclave) 70 um tamis en nylon maille et de force broyer le tissu dans la maille à l'aide de la base d'un plongeur d'une seringue de 1 cc. Alternativement, PP sandwich entre deux givrés stériles lames de microscope (autoclavés dans des enveloppes) et doucement broyer les tissus avec un mouvement de va-et-vient. Utiliser une pipette de transfert stérile pour transférer la suspension de cellules dans un tube de 5 ml Falcon.
7. Ajouter de l'EDTA à une concentration finale de 1 mM à la suspension cellulaire. Incuber sur un agitateur pour5 min à température ambiante.
8. Suspension cellulaire décanter à travers un second filtre 70 cellules um pour éliminer les agrégats cellulaires ou autres débris tissulaires. Prélever des cellules dans un tube de 15 ml ou 50 conique.
9. Cellules soumises à une centrifugation douce (5 min à 500 xg). Décanter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un tampon de flux, ce qui est un tampon phosphate salin (PBS) contenant 1% de sérum de veau foetal (FCS).
10. Pour déterminer le nombre et la viabilité cellulaire, diluer les cellules 1:10 dans du bleu trypan et inspecter visuellement les cellules en utilisant un microscope optique et d'un hémocytomètre. Alternativement, un compteur de cellules comtesse (Invitrogen) ou un instrument similaire peut être utilisée pour énumérer automatiquement le nombre de cellules et leur viabilité.
    Démarrage avec 20-25 PP, ce protocole devrait donner> 2,5 x 10 ⁶ cellules totales. Cela équivaut à ~ 0.8 à 1,2 x 10 ⁶ cellules par souris.

Marquage de l'anticorps de cellules de cytométrie en flux

Distribuer des cellules (10 ⁵ par puits) dans les puits d'une plaque de 96 puits à fond rond.

Sous réserve de la plaque centrifugation douce (5 min à 1000 xg), et le surnageant décanter en retournant doucement la plaque.

Remettre en suspension les cellules dans un tampon de bloc Fc et incuber sur de la glace pendant 15 min. Bien qu'il existe un certain nombre de blocs de buffers disponibles dans le commerce Fc (par exemple chez le rat anti-souris CD16/CD32, BD Biosciences), nous utilisons simplement milieu usé d'un rat de cellules d'hybridome B (ATCC 2.4.G2) qui sécrète un anticorps monoclonal murin IgG ₁ contre Fcy récepteurs pour cette étape.

Sous réserve de la plaque centrifugation douce (5 min à 1000 xg) comme ci-dessus, et le surnageant décanter en retournant doucement la plaque.

Ajouter fluorophore anticorps conjugués directement à des suspensions cellulaires lors de la dilution désirée, et incuber sur de la glace pendant 30 min avec balancement continu.

Sous réserve de la plaque centrifugation douce (5 min à 1000 xg), et décantersurnageant en retournant doucement la plaque.

Laver les cellules avec 100 pi de tampon de flux.

Centrifuger la plaque à 1.000 xg pendant 5 min, et le surnageant décanter en retournant doucement la plaque.

Resuspendre les cellules tampon 400 ul de fixation, qui se compose de 300 pi de tampon de flux et 100 pi de 1% de paraformaldéhyde dans des MEHP tampon (60 mM PIPES, HEPES 25 mM, 10 mM EGTA, 4 _mM de MgCl2 à pH 6).

Cellules soumises à la cytométrie de flux en utilisant un FACSCalibur ou équivalent. Analyser les résultats à l'aide du logiciel Cell Quest Pro version 5.2.

3. Préparation de cryosections PP

1. En prévision de la collecte de tissus, ajoutez une température optimale de coupe (PTOM) composé de 7x7x5 mm moules à base de plastique. Préparer également une piscine de l'azote liquide (> 750 ml) dans un seau dewar ou la glace.
2. Euthanasier souris et effectuer un laparotamy, comme décrit ci-dessus. Enlever l'intestin et les placer sur du papier absorbant humide.
3. ÀPP pour isoler cyrosectioning, couper 0,5 cm segments transversaux de l'intestin grêle contenant un seul PP et les tissus transfert à une boîte de Pétri contenant du PBS. Rincer délicatement la lumière de ces segments avec du PBS pour éliminer les débris indésirables fécale.
4. Placez les segments de tissus intestinaux verticalement à l'intérieur des moules de base contenant octobre Plongez les moules dans de l'azote liquide et permettre au tissu de geler complètement (1-2 min). La couleur de l'OPO va changer du clair au blanc lorsque le tissu est complètement gelé. . Pour un refroidissement plus progressive (par exemple, pour réduire la fissuration des PTOM), les moisissures immerger dans un bain d'isopentane refroidi avec de vapeurs d'azote liquide Remarque: Porter des lunettes de sécurité appropriées lorsque vous travaillez avec de l'azote liquide.
5. Retirer les moules de base congelée de l'azote liquide en utilisant une pince et de permettre le moule à réchauffer à la température ambiante juste assez longtemps (~ 10-15 secondes) pour permettre aux bords du bloc octobre à ramollir. Pour retirez le bloc congelé de l'OCT dele moule, retourner le moule et appuyez doucement sur le dos pour éjecter le bloc sur un chiffon propre 4 pièces x 4 cm de papier d'aluminium. Immédiatement envelopper le tissu de la feuille et les placer dans un sac spécimen étiqueté stockés dans de l'azote liquide ou de la neige carbonique. Sinon, le transfert de tissus dans un congélateur (<-20 ° C). Utilisez le tissu à l'intérieur d'une semaine, sinon les blocs deviennent fragiles avec l'âge.

Découpe au cryostat

6. Coupe à congélation du tissu en utilisant un Leica CM3050S cryomicrotome ou équivalent. La température de la chambre sur le cryostat doit être réglé à -21 ° C.
7. Efforcez-vous de sections qui sont 12-14 um d'épaisseur.
8. Recueillir des sections sur Fisher SuperFrost Plus (ou équivalent) des lames de microscope en verre et d'inspecter visuellement à l'aide d'un microscope à faible niveau de lumière électrique. Si plusieurs sections sont recueillies sur une lame, assurez-vous qu'ils sont regroupés pour des applications en aval de coloration.
9. Magasin de til glisse à température ambiante dans une boîte à lames et, idéalement, de les utiliser dans quelques jours.

Étiquetage des anticorps cryosections et analyse par microscopie confocale

10. Immerger les lames dans de l'acétone (ou méthanol) en cuve de coloration des tissus ou supports pendant 2 min. Une incubation prolongée peut causer des tissus à se détacher de la lame.
11. Transfert de diapositives à cuve de coloration nouvelle et laver 3 fois avec du PBS-T (PBS 1X avec 0,05% de Tween-20) pendant 3 minutes chacun.
12. Encercler les sections avec un stylo hydrophobe ImmEdge. Cela permettra d'assurer que les réactifs et les anticorps restera confiné à cette région pendant les incubations.
13. Incuber les lames dans un tampon de bloc (sérum de chèvre 2% dans du PBS) pendant 30 min à 37 ° C dans une chambre humidifiée à l'abri de la lumière.
14. Incuber les lames avec un tampon de bloc Fc (voir ci-dessus) pendant 10 min à 37 ° C.
15. Tremper dans du PBS-T et sec autour de sections à l'aide Kimwipes ou d'autres tissus absorbant.Prenez soin de ne pas toucher les coupes de tissus réels.
16. Coupes de tissus de recouvrement avec une solution d'anticorps primaire et incuber pendant 30 min à 37 ° C dans une chambre humidifiée. Anticorps primaire est généralement dilué dans un tampon de bloc à une concentration finale de 20 pg / ml. L'utilisation d'anticorps directement marqués primaires est souhaitable, car pas moins de trois anticorps peuvent être combinés directement à cette étape. Anticorps directement marqués également d'éliminer la nécessité de mesures supplémentaires d'incubation d'anticorps.
17. Laver les lames 3 fois (5 min chacun) par immersion dans du PBS.
18. Si nécessaire, des diapositives incuber avec les anticorps secondaires pendant 30 min à 37 ° C dans une chambre humide.
19. Laver les lames 3 fois (5 min chacun) par immersion dans du PBS.
20. Incuber les lames pendant 4 min dans du paraformaldéhyde à 1% dans un tampon de MEHP, comme décrit ci-dessus.
21. Rincer les lames dans du PBS pendant 1 min.
22. Zone sèche autour des sections à l'aide Kimwipes ou d'autres absorbentent des tissus. Prenez soin de ne pas toucher les coupes de tissus réels. Avec une pipette ou compte-gouttes, placer délicatement une goutte de prolonger à moyen Or montage direct sur la section. Recouvrir d'une lamelle de verre sur le support de montage en prenant soin d'éviter les bulles. Utilisez du papier buvard pour absorber l'excès n'importe quel support de montage.
23. Joint à lamelles lames de microscope avec vernis à ongles commerciale et laisser sécher à l'air.
24. Afficher les diapositives avec un Leica TCS SP5 ou équivalent microscope confocal.

Résultats

L'analyse par cytométrie en flux des suspensions monodisperses de cellules PP totaux révèle une nette distinction entre les préparations de cellules bons et les mauvais. Dans les préparations cellulaires de bonnes relations avec plus de 80% de viabilité, la grande majorité des cellules démontrent une forte diffusion vers l'avant (FSC), un indicateur de volume cellulaire élevée et à faible dispersion latérale (SSC), un indicateur de granularité cellulaire faible (figure 2A). Dans cet...

Discussion

Dans cet article, nous avons fourni des protocoles parallèles pour la préparation PP préparations de cellules uniques pour l'analyse par cytométrie en flux et fonctionnelle et cryosections pour immunomarquage. Les deux méthodes sont hautement reproductibles et facilement accessible, à condition d'un cytomètre en flux et cryostat sont disponibles. Pour les enquêteurs première fois, il convient de souligner que, par rapport à la rate, les rendements cellulaires totaux provenant PP sont relativement maigr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Article	Entreprise	Cat. #	Commentaires (optionnel)
Composé octobre	Tissue-Tek	4583
7x7x5 mm Moules	Fisherbrand	22-363-552
ImmEdge Pen	Vector Labs	H-4000
Superfrost Plus Diapositives	Thermo Scientific	4951
Rite bord de la lame	Thermo Scientific	4280L
Anti-Mouse CD11c-PE	eBioscience	17-0114-82
Anti-Mouse CD45R/B220-APC	BD Pharmigen	553092
Anti-souris CD3-FITC	BD Pharmigen	561798
Anti-souris CD4-PE	BD Pharmigen	553652
Anti-souris CD8-PE	BD Pharmigen	553032
Anti-souris CD19-PerCP	BioLegend	115531
Hank solution saline équilibrée de Hank (HBSS) sans rouge de phénol	Fisher Scientific	14175-079
70 um tamis cellulaire	BD Falcon	352350
Spleen dissociation moyen	Technologies des cellules souches	7915
Sérum de chèvre	Invitrogen	16210-072
Fc Bloquer	ATCC 2.4.G2	HB-197	Supes obtenu à partir de la lignée cellulaire 2.4.G2
Ciseaux courbe	FST	14061-09
Cryostat	Leica	3050S
FACS Calibur	BD
Compteur de cellules comtesse	Invitrogen
Hématoxyline	Richard Allan	7211
Eosine	Richard Allan	71304
Formol	Starplex scientifique	3661
			Tableau 1. Réactifs et équipements utilisés dans cette étude.