隔离和免疫淋巴细胞和树突状细胞的小鼠Peyer氏斑

摘要

理解在派伊尔氏淋巴集结的特定的细胞亚群（PPS），初级感应网站肠相关的淋巴组织的免疫功能有越来越大的兴趣。在这里，我们列出了流式细胞仪分析和PP冰冻切片免疫准备的PP单细胞准备的并行协议。

摘要

Peyer氏斑（PPS）的肠道相关淋巴组织（GALT）是不可或缺的组成部分，并在肠道的免疫监视和平衡中发挥核心作用。连续采样在肠腔内的颗粒性抗原和微生物PP M细胞在卵泡相关上皮（FAE），运到底层网络的树突状细胞（DC）的，巨噬细胞，和淋巴细胞。在本文中，我们描述了小鼠的PP是（i）解离成单细胞悬浮液，并进行流式细胞仪，及（ii）用于cryosectioning和免疫制备的协议。流式细胞仪，PPS的机械分离，然后通过70微米膜过滤产生单细胞悬液的上皮细胞和大的杂物。用20-25的PP（从四只小鼠）开始，此快速和可重复性的方法产生一个人口> 2.5×10 ⁶细胞> 90％的细胞存活率。对于cryosectioning，新鲜LY孤立的PP都沉浸在最佳切削温度（OCT）中，在液氮快速冷冻，然后切片用冷冻切片机。组织切片（5-12微米），空气干燥，用丙酮或甲醇固定，然后进行免疫标记。

引言

Peyer氏修补程序（PPS）是宏观集合体有组织淋巴滤泡整个的小小肠人类和小鼠（ 图1）中存在的和构成的主站点在粘膜免疫应答被发起针对膳食抗原共生细菌，微生物病原体，口服疫苗^1-4。与其他外周淋巴组织，如肠系膜淋巴结，PPS缺乏传入的淋巴管。因此，适应性免疫反应的PP中的驱动响应于来自肠腔抗原。管腔抗原的采样来完成的由卵泡关联的上皮（FAE），其中包括被称为M细胞肠细胞和抗原采样单元。上皮子圆顶（SED）的区域中，位于下方的FAE，间杂与巨噬细胞，B细胞和CD4 ^{+ T}细胞^5-9的树突状细胞（DC）的网络。在每个PP淋巴follicl的核心e是滤泡树突状细胞（FDCS）和B细胞丰富的中央生发中心，两侧的T细胞丰富的滤泡区。的PP的查询结果中的发展型IgA + B细胞浆母和CD4 ⁺效应和记忆细胞抗原采样种子周围的固有层，并提供很宽的范围内的免疫力粘膜入侵者。

解剖复杂的免疫抗原采样，处理和呈现在PPS相关的事件，是一项艰巨的任务，考虑到PP细胞只占一小部分的总淋巴样细胞在肠黏膜。为了有助于在体外表征细胞在这样的环境中，我们提供了一个协议，用于制备总鼠标PP细胞流式细胞仪和功能分析，以及用于制备聚丙烯的冷冻切片的免疫荧光显微镜和免疫组化检测的协议。我们的分离，鉴定和免疫组织化学的谅解备忘录的协议ËPP细胞本身并不新颖，所证明的事实，即有超过25年的历史，多次提到，引用这些技术^5,6,9-11。相反，我们的协议提供了一个简化的（视觉）的方法收集PPS第一次调查。我们所描述的技术很容易掌握，容易产生大量的细胞与细胞活力> 90％。 cryosectioning协议产生高度重复的连续切片进行免疫荧光染色和激光共聚焦成像非常适合。此外，我们的协议补充其他两个最近的朱庇特的文章。第一，由福田和他的同事，描述了使用结扎回肠环路检测，以评估的致病细菌的吸收，由PP M细胞^12。其他的，的GEEM和他的同事，介绍了小鼠肠黏膜的区议会和巨噬细胞的分离和鉴定，但明确排除了PPS从他们的分析¹³。

研究方案

根据传统，无特定病原体动物被安置和处理沃兹沃斯中心的机构动物管理和使用委员会（IACUC）的指导方针完全符合。

1。口灌胃

1. （可选）灌胃小鼠品系的选择与抗原或微生物使用X1.5-22 G的兴趣。钝端喂食针（，波普尔科学，海德公园，NY）。交货量不应超过400微升每鼠标。

2。 PP细胞用于流式细胞仪分离

1. 安乐死小鼠CO ₂窒息，根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导方针。
2. 用70％乙醇或优碘，手术前清洗腹部。执行标准剖腹手术，涉及到一个单一的（1厘米）切口手术级的剪刀沿中线开始从基地约1.5厘米的肋骨。公开每itoneal腔，并确定盲肠。剪断终端小肠回肠盲肠交界处，轻轻取出肠道内的全部。 ，请注意不要超伸被删除，因为它是从腹膜腔肠组织。
3. 在床上的湿纸巾或Kimwipes奠定小肠。湿用生理盐水轻轻的小肠，以防止组织脱水。可视地识别个别位于肠道反肠系膜侧（ 图1）的PP。通常情况下，一个单一的鼠标具有均匀分布从十二指肠（近端）回肠（远端）的5至10可见的PP。平均而言，四只老鼠将产生23的PP。
4. 使用弯曲的手术剪刀，轻轻消费个别PP和将它们放置在冷的Hank氏平衡盐溶液（HBSS）。 笔记 ，剪刀应该被放置曲线侧的正上方的PP，然后轻轻地施加到组织。海关关长只的PP（surroundi的异常组织），转移到冷的HBSS。
   注:所有的孵化和离心步骤，这一点在第2节，应在4°C保存细胞活力。
5. 转移的PP5毫升健脾解离中孵育15-20分钟，在37°C，同时大力摇晃在250转。培养时间的延长细胞活力将产生负面影响。
6. 要产生单细胞悬浮液，无菌（蒸压）为70μm的尼龙网细胞过滤网上的地方的PP和强行研磨组织成网状，使用从1毫升注射器的柱塞的基。另外，PPS磨砂无菌玻璃显微镜幻灯片（高压灭菌信封），轻轻地磨一个来回运动组织之间的夹层。使用无菌移液管转移到一个5毫升的Falcon管中的细胞悬浮液。
7. 加入EDTA至终浓度为1mM的细胞悬浮液。孵育摇杆在室温下5分钟。
8. 倒出细胞悬液通过第二个70微米细胞过滤器，以消除任何剩余的细胞聚集或组织碎片。收集细胞中有15或50毫升锥形管。
9. 主题细胞温和离心（在500×g离心5分钟）。在流的缓冲液，磷酸盐缓冲盐水（PBS）含有1％胎牛血清（FCS）的滗析上清液和重悬细胞。
10. 为了确定细胞数和存活率，稀释1:10到台盼蓝染色的细胞，并目视检查用光学显微镜和血细胞计数仪的细胞。可替换地，一个的伯爵夫人细胞计数器（Invitrogen公司），或类似的仪器，可以使用自动枚举细胞数和生存能力。
    20-25 PPS开始，这个协议应该产生2.5×10 ^6个细胞总数。这相当于〜0.8-1.2×10 ⁶细胞每只小鼠。

抗体标记的细胞用于流式细胞仪

分送成的96孔圆底板的孔中的细胞（每孔10 ^5）。

主题板温和离心（在1,000 xg离心5分钟），并倾析上清液轻轻板反转。

FC块缓冲液重悬细胞，并在冰上孵育15分钟。虽然有许多市售的FC块缓冲区（ 如:大鼠抗小鼠CD16/CD32，BD Biosciences公司），我们简单地使用花介质从老鼠的B细胞杂交瘤（ATCC 2.4.G2）分泌的单克隆抗体对小鼠Fcγ受体，此步骤。

主题板温和的离心分离（在1000×g离心5分钟）以上，并倾析上清液轻轻板反转。

直接加入荧光标记的抗体所需稀释的细胞悬浮液，冰上孵育30分钟，连续摇摆。

主题板温和离心（在1,000 xg离心5分钟），并倾析上清液轻轻翻转板。

用100微升的流动缓冲液洗涤细胞。

离心板在1,000 xg离心5分钟，并倾析上清液轻轻板反转。

重悬细胞加入400μl固定缓冲液，其中包括流缓冲液以300μl和100μl1％多聚甲醛在PHEM缓冲液（60 mM的筒，25mM的HEPES，10mM的EGTA，在pH = 6的MgCl ₂ 4mM的）。

主题细胞，流式细胞仪使用FACSCalibur或同等学历。分析结果使用Cell任务Pro软件5.2版本。

3。 PP冰冻切片的制备

1. 在推进组织收集，最佳切削温度（OCT）化合物，7x7x5毫米的塑料底座模具。还要准备一个游泳池（750毫升）的液态氮杜瓦瓶或冰桶中。
2. 安乐死鼠标和执行laparotamy，如上所述。删除的小肠和地方上湿纸巾。
3. 对隔离为cyrosectioning的PP，横向切0.5厘米段的小肠内含有一个单一的PP和转移组织培养皿中包含PBS。这些段与PBS轻轻冲洗管腔，以消除不必要的粪便杂物。
4. 将肠组织分部内垂直基地模具OCT。浸没在液氮中的模具，并允许组织完全冻结（1-2分钟）。在OCT会改变颜色，从透明至白色，当组织被完全冻结。对于一个逐渐冷却（ 例如 ，减少开裂的OCT），浸泡在用液氮蒸气浴冷却的异戊烷的模具。 注意:穿戴合适的工作时，用液态氮的安全护目镜。
5. 从液氮使用钳子删除已冻结的基模具，并允许模具预热只是足够长，在室温下（约10-15秒），以允许在OCT块的边缘软化。然后删除冻结块OCT倒置的模具的模具，并在后面轻轻按下，退出块到一个干净的4×4 cm长的铝箔。立即在箔片和地点在液氮或干冰上存储的标记的试样袋包裹组织。或者，转移组织中的冷冻器（<-20℃）。使用组织在一个星期内，否则，块随着年龄的增长会变脆。

Cryosectioning

6. 冰冻切片的组织使用一个徕卡CM3050S的冷冻切片机或同等学历。应设置在低温恒温器的腔室的温度为-21℃。
7. 争取是12-14微米厚的部分。
8. 费舍尔的Superfrost Plus（或同等学历）显微镜玻片上收集部分和视觉使用的是标准的低功耗光学显微镜检查。如果有多个部分正在收集有关的幻灯片，确保他们聚集在一起下游染色应用。
9. 商店吨他滑动的滑动框，并在室温下在理想的情况下，使用它们在几天之内。

冰冻切片抗体标记和共聚焦显微镜分析

10. 浸入丙酮（或甲醇）的组织染色缸或机架2分钟的幻灯片。长时间的潜伏期，可能会导致组织中分离的幻灯片。
11. 转移到新的染色缸的幻灯片，并用PBS-T（1X用0.05％Tween-20的PBS）洗3次，每次3分钟。
12. 与的ImmEdge疏水笔包围的部分。这将确保试剂和抗体将保持期间只限于该区域孵育。
13. 在一个加湿室中在37℃下30分钟，避光孵育在块缓冲液（2％山羊血清的PBS）的幻灯片。
14. 孵育10分钟的FC块缓冲区（见上文）的幻灯片，在37°C。
15. 浸在PBS-T和干燥的部分使用Kimwipes或其他吸水组织周围地区的幻灯片。小心不要接触到实际的组织切片。
16. 叠加组织切片与初级抗体溶液并孵育30分钟，在37℃下的潮湿室中。初级抗体通常是在块缓冲液稀释至终浓度为20微克/毫升。直接标记的第一抗体的使用是可取的，直接在此步骤中，因为多达三个抗体可以结合。直接标记的抗体的同时也消除了需要额外的抗体孵育步骤。
17. 浸泡在PBS中洗涤3次（每次5分钟）的滑动。
18. 如果必要，孵育与有关的二次抗体，在37℃下30分钟，在湿气室内滑动。
19. 浸泡在PBS中洗涤3次（每次5分钟）的滑动。
20. 孵育4分钟，在1％多聚甲醛在PHEM缓冲液中，如上文所述的幻灯片。
21. 冲洗1分钟，用PBS滑动。
22. 干周围地区的部分使用Kimwipes或其他吸收耳鼻喉科组织。小心不要接触到实际的组织切片。使用移液管或滴管轻轻将延长黄金直接安装介质上的部分下降。应用盖玻片上的安装介质照顾，以避免气泡。用吸水纸，以吸收任何多余的安装介质。
23. 密封盖玻片显微镜载玻片与商业的指甲油，并在空气中晾干。
24. 查看幻灯片用Leica TCS SP5或有同等作用的共聚焦显微镜。

结果

单分散悬浮液的总PP细胞的流式细胞仪分析揭示了一个明确的区分好的和坏的细胞制剂。在良好的细胞制剂中，有超过80％的可行性，绝大多数的细胞表现出高的前向散射（FSC），细胞体积高的指标，以及低侧散射（SSC），低的细胞粒度（ 图2A）的指标。在这个实验中，我们还特意准备了一个"细胞制剂差"孵育PP细胞在室温下（而不是在冰上）在分离步骤，并在最后一步，用PBS加1％FCS?...

讨论

在这篇文章中，我们提供了并行协议的准备PP准备流式细胞仪和功能分析和冰冻切片免疫组化染色的单细胞。这两种方法都高度重复性和容易获得，流式细胞仪和低温恒温器。对于第一次调查应该指出，当脾，总的电池产量PPS是相对贫乏。然而，该协议，概述一般为0.8〜1.2×10共^6个 PP细胞从一个单一的鼠标之间的收益率。规模化是可能的，但我们通常不超过20-25 PPS池，因为，在我们的经验?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
项目	公司	猫。 ＃	评论（可选）
OCT复合	组织康	4583
7x7x5 mm底座模具	Fisherbrand	22-363-552
ImmEdge笔	矢量实验室	H-4000
的Superfrost Plus幻灯片	Thermo Scientific的	4951
边爱色丽刀片	Thermo Scientific的	4280L
ANTI-MOUSE的CD11c-PE	eBioscience公司	17-0114-82
反鼠标CD45R/B220-APC的	BD Pharmigen	553092
ANTI-MOUSE CD3-FITC	BD Pharmigen	561798
抗小鼠CD4-PE	BD Pharmigen	553652
抗小鼠CD8-PE	BD Pharmigen	553032
抗鼠CD19-PercP	BioLegend	115531
Hank氏平衡盐溶液（HBSS）不含有酚红	Fisher Scientific则	14175-079
70微米的细胞过滤器	BD猎鹰	352350
健脾解离中	干细胞技术	7915
山羊血清	Invitrogen公司	16210-072
FC块	ATCC 2.4.G2	HB-197	从细胞线2.4.G2的Supes获得
弯剪式	FST	14061-09
低温恒温器	徕卡	3050S
FACS刀魂	BD
伯爵夫人细胞计数	Invitrogen公司
苏木	理查德·艾伦	7211
曙红	理查德·艾伦	71304
福尔马林	Starplex科学	3661
			表1中。本研究中所用的试剂和设备。