Isolar e imunocoloração linfócitos e células dendríticas a partir de placas de Peyer Murino

Resumo

Existe um interesse crescente na compreensão das funções imunológicas de subpopulações específicas de células em placas de Peyer (PP), os locais primários indutivos de tecidos linfóide associado ao intestino. Aqui destacamos protocolos paralelos para preparar PP preparações de células individuais para análise por citometria de fluxo e criosseções PP para imunocoloração.

Resumo

Placas de Peyer (PP) são componentes integrais dos tecidos linfóide associado ao intestino (GALT) e desempenham um papel central na imunovigilância intestinal e homeostase. Antigénios particulados e micróbios no lúmen intestinal estão continuamente sujeitos a amostragem por células PP M no epitélio folicular-associado (FAE) e transportado para uma rede de base de células dendríticas (DC), macrófagos, linfócitos e. Neste artigo, descreve protocolos em que PPs murinos são (i) dissocia-se em suspensões de células isoladas e sujeitas a citometria de fluxo, e (ii) preparado para cryosectioning e imunocoloração. Para a citometria de fluxo, PPs são dissociadas mecanicamente e em seguida filtrada através de membranas 70 uM para gerar suspensões de células individuais livres de células epiteliais e os detritos de grandes dimensões. Começando com 20-25 PPs (a partir de quatro ratinhos), esse método rápido e reproduzível origina uma população de> 2,5 x 10 ⁶ células, com> 90% de viabilidade celular. Para cryosectioning, frescoPPs ly isoladas estão imersos em meio de corte ideal de temperatura (OCT), congelado em nitrogênio líquido, e seccionados usando um cryomicrotome. As secções de tecido (5-12 mm) são secas ao ar, fixadas com acetona ou metanol, e, em seguida, submetido a imunomarcação.

Introdução

Placas de Peyer (PP) são agregados macroscópicos de organizados folículos linfóides presentes em todo o intestino delgado dos humanos e ratos (Figura 1) e que constituem os sítios primários em que mucosas respostas imunes são iniciadas contra antígenos alimentares, bactérias comensais, agentes patogénicos microbianos e vacinas orais ^1-4. Ao contrário de outros tecidos linfóides periféricos, como os linfonodos mesentéricos, PPs não têm vasos linfáticos aferentes. Como tal, as respostas imunes adaptativas em PPs são accionados em resposta a antigénios derivados a partir do lúmen intestinal. A amostragem de antigénios luminais é realizado pelo epitélio do folículo-associado (FAE), que consiste em dois enterócitos e antigénio-amostragem células conhecidas como células M. Abaixo da FAE, na cúpula sub-epitelial (SED) região, encontra-se uma rede de células dendríticas (CDs) misturavam-se com macrófagos, células B e células T CD4 ^{+ 5-9.} No centro de cada follicl PP linfóidee são células dendríticas foliculares (FDC) e uma de células B rico centro centro germinal, ladeada por zonas de célula T ricos interfoliculares. Amostragem de antigénio por PPs resulta no desenvolvimento de IgA + plasmablasts de células B e as células CD4 ⁺ efectoras e de memória que a semente da lâmina envolvente e proporcionar imunidade a uma grande variedade de invasores mucosas.

Dissecando os eventos imunológicos complexos associados à amostragem antígeno, tratamento e apresentação em PPC é uma tarefa difícil, considerando-se que as células PP constituem apenas uma pequena fração do total de células linfóides na mucosa intestinal. Para ajudar na caracterização in vitro de células neste meio, é proporcionado um protocolo para a preparação de células totais de PP de rato para a análise de citometria de fluxo e funcionais, bem como um protocolo para a preparação de PP criocortes para microscopia de imunofluorescência, e imunohistologia. O protocolo para o isolamento, caracterização e imunocoloração de mouscélulas E PP não é novidade, por si só, como evidenciado pelo fato de que há inúmeras referências datam mais de 25 anos que citam estas técnicas ^5,6,9-11. Em vez disso, nosso protocolo fornece um método (e visual) simplificado para investigadores coleta PPs pela primeira vez. As técnicas aqui descritos são facilmente dominado e prontamente produzir grandes números de células com> 90% de viabilidade celular. O protocolo cryosectioning rende altamente reprodutíveis de secções seriadas idealmente adequadas para a coloração de imunofluorescência e de imagem confocal. Além disso, o nosso protocolo complementa dois outros artigos de Jove recentes. O primeiro, por Fukuda e colaboradores, descreve a utilização de ensaios de ligadura de laço ileal para avaliar a absorção de bactérias patogénicas em células PP M ^12. O outro, pelo GEEM e colaboradores, descreve o isolamento e caracterização de DCs e macrófagos da mucosa intestinal do rato, mas exclui explicitamente PPs da sua análise ¹³.

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Protocolo

Os animais foram alojados em convencionais, livres de patógenos específicos condições e foram tratados em total conformidade com cuidado o Wadsworth Center Animal da Comissão Institucional e de Uso (IACUC) diretrizes.

1. Gavagem oral

1. (Opcional) estirpe de ratinho Gavage de escolha com antigénio ou micróbios de interesse utilizando uma G 22 x1.5-in. blunt-ponta da agulha alimentação (Popper Scientific, New Hyde Park, NY). Volumes de entrega não deve exceder 400 ul por rato.

2. Isolamento de Células PP para Citometria de Fluxo

1. Euthanize ratos por asfixia CO _2, de acordo com o cuidado de animais e de uso institucional do comitê (IACUC) diretrizes.
2. Purificar o abdómen com etanol a 70% ou betadine antes da cirurgia. Realizar uma laparotomia padrão que envolve uma incisão (1 cm) único usando tesouras cirúrgicas grau ao longo do inicio da linha média de cerca de 1,5 cm da base da caixa torácica. Exponha o porcavidade itoneal e identificar o ceco. Cortar o intestino pequeno terminal na junção íleo-cecal e remova o intestino na sua totalidade. Tomar cuidado para não hiperextensão o tecido intestinal, uma vez que está a ser removida a partir da cavidade peritoneal.
3. Coloque o intestino delgado em uma cama de toalhas de papel úmidas ou Kimwipes. Molhar o intestino delgado suavemente com solução salina para evitar a desidratação dos tecidos. Identificar visualmente PPs individuais localizados no lado anti-mesentérico do intestino (Figura 1). Tipicamente, um único rato tem 5-10 PPs visíveis que são uniformemente distribuídos a partir do duodeno (proximal) ao íleo (distal). Em média, quatro ratos renderá 23 PPs.
4. Utilizando uma tesoura cirúrgica, curvadas suavemente consumo PPs individuais e colocá-los em solução fria salina balanceada de Hank (HBSS). Nota, a tesoura curva deve ser colocada voltada para cima logo acima do PP e então suavemente aplicada ao tecido. Excise apenas a PP (não surrounding de tecido) e de transferência de HBSS frio.
   Nota: Todas as incubações e os passos de centrifugação a partir deste ponto para a frente na secção 2, deve ser feita a 4 ° C para preservar a viabilidade celular.
5. Transferir PPs em 5 ml de Meio Baço dissociação e incubar durante 15-20 min a 37 ° C, enquanto se agita vigorosamente a 250 rpm. Tempo de incubação vai afetar negativamente a viabilidade celular.
6. Para gerar uma suspensão de célula única, PPs lugar numa estéril 70 um (autoclavado) nylon peneira malha de célula e à força moer o tecido dentro da malha utilizando a base de um êmbolo de uma seringa de 1 cc. Como alternativa, o PPS sanduíche entre duas lâminas de vidro fosco estéreis microscópio (autoclavado em envelopes) e gentilmente moer tecidos com um movimento de ida e volta. Usar uma pipeta estéril para transferir a suspensão de células para um tubo Falcon de 5 ml.
7. Adicionar EDTA para uma concentração final de 1 mM para a suspensão de células. Incubar em uma cadeira de balanço para5 min à temperatura ambiente.
8. Suspensão de células através de um segundo decantar célula 70 um filtro para remover quaisquer agregados remanescentes celulares ou restos de tecido. Recolher as células num tubo de 15 ml ou 50 cónica.
9. Células sujeitas a centrifugação suave (5 min a 500 xg). Decantar sobrenadante e ressuspender as células em tampão de fluxo, que é salino tamponado com fosfato (PBS) contendo 1% de soro fetal de vitelo (FCS).
10. Para determinar o número de células e viabilidade, diluir as células em azul de tripano 01:10 e inspeccionar visualmente células utilizando um microscópio de luz e um hemocitómetro. Alternativamente, um contador de células Countess (Invitrogen) ou instrumento similar pode ser usado para enumerar automaticamente o número de células e viabilidade.
    Começando com 20-25 PP, este protocolo deve render> 2,5 x 10 ⁶ células totais. Isso equivale a ~ 0,8-1,2 x 10 ⁶ células por mouse.

Labeling anticorpo de células por citometria de fluxo

Pipetar as células (10 ⁵ por cavidade) em cavidades de uma placa de 96 poços de fundo redondo.

Placa sujeita a centrifugação suave (5 min a 1000 xg), e decantar o sobrenadante invertendo suavemente a placa.

Ressuspender as células em tampão de bloqueio Fc e incubar em gelo durante 15 min. Embora haja um certo número de tampões de bloco comercialmente disponíveis Fc (por exemplo, de rato anti-ratinho CD16/CD32, BD Biosciences), simplesmente usar meio gasto a partir de uma célula de hibridoma de rato B (ATCC 2.4.G2) que segrega um IgG monoclonal murino contra _um Fcy receptores para este passo.

Placa sujeita a centrifugação suave (5 min a 1000 xg), como acima, e decantar o sobrenadante invertendo suavemente a placa.

Adicionar fluoróforo anticorpos conjugados directamente para as suspensões de células a diluição desejada, e incubar em gelo durante 30 min com agitação contínua.

Placa sujeita a centrifugação suave (5 min a 1000 xg), e decantarsobrenadante, invertendo com cuidado a placa.

Lavar as células com 100 uL de tampão de fluxo.

Centrifugar a placa 1000 xg durante 5 minutos, decanta-se o sobrenadante e invertendo suavemente a placa.

Ressuspender as células 400 tampão de fixação ul, que consiste em 300 ul de tampão de fluxo e 100 uL de paraformaldeído a 1% em tampão PHEM (60 mM de PIPES, HEPES 25 mM, EGTA 10 mM, MgCl2 4 _mM, pH 6).

As células sujeitas a citometria de fluxo utilizando um FACSCalibur ou equivalente. Analisar os resultados utilizando células da Quest versão do software Pro 5.2.

3. Preparação de PP criocortes

1. Antes da coleta de tecido, adicione Optimal Cutting Temperatura composto (OCT) para 7x7x5 milímetros moldes base de plástico. Também preparar um conjunto de azoto líquido (> 750 mL) num balde de gelo ou dewar.
2. Euthanize rato e executar uma laparotamy, como descrito acima. Remover intestino e coloque em toalhas de papel molhado.
3. Paraisolar PPs para cyrosectioning, cortar segmentos de 0,5 centímetros transversais do intestino delgado, contendo uma única e tecido PP transferência para uma placa de Petri contendo PBS. Lave o lúmen desses segmentos com PBS para remover os restos não desejados fecal.
4. Colocar os segmentos de tecido intestinal verticalmente dentro de moldes de bases contendo outubro Mergulhar os moldes em azoto líquido e permitir que o tecido para congelar completamente (1-2 min). A cor da OCT irá mudar de transparente para branco quando o tecido é completamente congelada. . Para um arrefecimento mais gradual (por exemplo, para reduzir a fractura do OCT), molde imerso em um banho de isopentano resfriado com nitrogênio líquido vapores Nota: Usar óculos de segurança adequadas quando se trabalha com nitrogênio líquido.
5. Remover os moldes de bases congelados do azoto líquido utilizando fórceps e permitir que o molde se aquecer à temperatura ambiente, apenas o tempo suficiente (~ 10-15 segundos) para permitir que as bordas do bloco OCT para amolecer. Para, em seguida, remover o bloco congelado de outubro deo molde, inverter o molde e pressione suavemente sobre a volta para ejetar o bloco para um 4 x 4 cm limpo pedaço de papel alumínio. Imediatamente enrolar o tecido na película e colocar num saco de amostra marcado armazenados em azoto líquido ou em gelo seco. Alternativamente, a transferência de tecido em um congelador (<-20 ° C). Usar o tecido dentro de uma semana, de outro modo os blocos vão tornar-se frágil com a idade.

Cryosectioning

6. Criocorte o tecido utilizando uma Leica CM3050S cryomicrotome ou equivalente. A temperatura da câmara do criostato deve ser ajustado para -21 ° C.
7. Esforce-se para as secções que são 12-14 um de espessura.
8. Colete secções em Fisher SuperFrost Plus (ou equivalente) lâminas de microscópio de vidro e inspecionar visualmente utilizando um microscópio de luz padrão de baixa potência. Se várias seções estão sendo coletados em um slide, garantir que eles estão agrupados em cluster para aplicações de coloração jusante.
9. Loja tele desliza para a temperatura ambiente dentro de uma caixa corrediça e, de preferência, usa-los dentro de poucos dias.

Labeling anticorpo de criocortes e Análise Microscopia Confocal

10. Imergir as lâminas em acetona (ou metanol) em frasco de tecido de coloração ou prateleiras durante 2 min. Incubação prolongado pode causar tecidos para destacar do slide.
11. Transferir as lâminas para coloração novo frasco e lava-se 3 vezes com PBS-T (1X PBS com 0,05% de Tween-20) durante 3 minutos cada.
12. Cercar as seções com uma caneta hidrofóbica ImmEdge. Isto irá assegurar que os reagentes e anticorpos permanecerá confinado a essa área durante as incubações.
13. Incubar as lâminas em tampão de bloqueio (soro de cabra a 2% em PBS) durante 30 min a 37 ° C numa câmara humidificada, protegido da luz.
14. Incubar as lâminas com tampão de bloqueio Fc (ver acima) durante 10 min a 37 ° C.
15. Dip slides em PBS-T, e em torno de secções de área seca usando Kimwipes ou tecido absorvente.Tome cuidado para não tocar nos cortes de tecido reais.
16. Sobreposição de secções de tecido com uma solução de anticorpo primário e incubar durante 30 min a 37 ° C numa câmara humidificada. O anticorpo primário é geralmente diluído em tampão de bloqueio para uma concentração final de 20 ug / ml. A utilização de anticorpos marcados directamente primários é desejável, porque até três anticorpos pode ser combinada directamente nesta etapa. Anticorpos marcados directamente também eliminar a necessidade de passos adicionais de incubação de anticorpos.
17. Lavar as lâminas três vezes (5 min cada) por imersão em PBS.
18. Se necessário, incubar com anticorpos secundários relevantes para 30 min a 37 ° C numa câmara de humidade.
19. Lavar as lâminas três vezes (5 min cada) por imersão em PBS.
20. Incubar as lâminas durante 4 min em paraformaldeído a 1% em tampão PHEM, como descrito acima.
21. Lavar as lâminas com PBS durante 1 min.
22. Área seca em torno de seções usando Kimwipes ou outros absorvertecido ent. Tome cuidado para não tocar nos cortes de tecido reais. Usando uma pipeta ou conta-gotas, coloque delicadamente uma gota de Prolongar meio de Ouro de montagem diretamente na seção. Aplicar uma lamela de vidro para o meio de montagem com cuidado para evitar bolhas. Use papel absorvente para absorver qualquer excesso de meio de montagem.
23. Lamínulas do selo para lâminas de microscópio com unha polonês comercial e deixar secar ao ar.
24. Ver slides com uma Leica TCS SP5 ou microscópio confocal equivalente.

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Resultados

Citometria de fluxo e suspensões monodispersas de células totais PP revela uma clara distinção entre preparações de células boas e pobres. Em preparações de células com mais de 80 anos de boa viabilidade%, a grande maioria das células demonstram alta dispersão frontal (FSC), um indicador do volume da célula de alta e baixa dispersão lateral (SSC), um indicador de granularidade baixa de células (Figura 2A). Nesta experiência, também preparado intencionalmente a "preparação de cél...

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Discussão

Neste artigo, nós fornecemos protocolos paralelos para preparar PP preparações de células individuais para análise por citometria de fluxo e funcional e criosseções para a imunocoloração. Ambos os métodos são altamente reprodutível e facilmente acessível, na condição de um citómetro de fluxo e criostato estão disponíveis. Para os investigadores primeira vez deve-se sublinhar que, quando comparado com o baço, o rendimento total de células de PPs são relativamente escassas. No entanto, o protocolo des...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Item	Companhia	Gato. #	Comentários (opcional)
Composto outubro	Tissue-Tek	4583
7x7x5 milímetros Moldes de Base	Fisherbrand	22-363-552
ImmEdge Pen	Vector Labs	H-4000
Além disso Superfrost Slides	Thermo Scientific	4951
Borda Rito Lâmina	Thermo Scientific	4280L
Anti-Mouse CD11c-PE	eBioscience	17-0114-82
Anti-Mouse CD45R/B220-APC	BD Pharmigen	553092
Anti-Mouse CD3-FITC	BD Pharmigen	561798
Anti-CD4 de rato-PE	BD Pharmigen	553652
Anti-rato CD8-PE	BD Pharmigen	553032
Anti-Mouse CD19-PerCP	BioLegend	115531
Solução salina equilibrada de Hank (HBSS) sem vermelho de fenol	Fisher Scientific	14175-079
70 filtro de células mM	BD Falcon	352350
Médio baço dissociação	Stem Cell Technologies	7915
Soro de cabra	Invitrogen	16210-072
Fc Bloco	ATCC 2.4.G2	HB-197	SUPES obtido a partir de linha de células 2.4.G2
Tesoura curva	FST	14061-09
Criostato	Leica	3050S
FACS Calibur	BD
Condessa contador de células	Invitrogen
Hematoxilina	Richard Allan	7211
Eosina	Richard Allan	71304
Formalina	Starplex Scientific	3661
			Tabela 1. Reagentes e equipamento utilizados neste estudo.