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요약

Peyer의 패치에있는 셀의 특정 subpopulations (조달청), 창자 관련 림프의 조직의 주요 유도 사이트의 면역 기능을 이해 증가 관심이 있습니다. 여기 흐름 cytometric 분석 및 immunostaining을위한 PP cryosections위한 단일 셀 준비를 PP 준비 병렬 프로토콜을 설명합니다.

초록

Peyer의 패치 (조달청) 창자 관련 림프 조직의 핵심 부품 (갈트)이며, 장 immunosurveillance과 항상성에 중심 역할을한다. 장 루멘의 미립자 항원과 미생물이 지속적으로 대과 - 관련 상피 (FAE)에 PP M 세포에 의해 샘플 및 기본 수지상 세포 네트워크 (코디네이터), 대 식세포 및 림프구로 이송됩니다. 이 문서에서는, 우리는 손쥐 조달청은 (i) 단일 세포 현탁액에 dissociated이며, 유동 세포 계측법을 받게하고 (ii) cryosectioning 및 immunostaining을 준비하는 프로토콜을 설명합니다. 유동 세포 계측법를 들어, 조달청은 기계적으로 dissociated하고 상피 세포 및 대형 쓰레기의 무료 단세포 현탁액을 생성하기 위해 70 μm 멤브레인을 통해 필터링합니다. 20-25 조달청 (4 마우스에서)를 시작으로,이 신속하고 재현 방법은> 2.5 인구를 산출 × 10> 90 % 세포 생존 능력 6 셀. cryosectioning, 신선한 들어지적인 절연 조달청은 cryomicrotome을 사용하는 다음 최적의 절삭 온도 (OCT) 중간, 액체 질소 스냅인 - 냉동 및 sectioned에 몰두하고 있습니다. 조직 섹션 (5-12 μm)은 아세톤이나 메탄올로 고정, 공기 건조 있으며, 다음 immunolabeling를 받게.

서문

Peyer의 패치 (조달청) 인간과 생쥐 (그림 1)의 소장에 걸쳐 현재의 조직 림프 모낭 매크로 집계하고 점막 면역 응답이식이 항원, 공생 박테리아, 미생물 병원균, 그리고 구두 백신에 대해 시작되는에서 주요 사이트를 구성 1-4. 같은 창 자간 막 림프절과 같은 다른 주변 림프 조직과는 달리, 조달청은 수입 성의 lymphatics가 부족합니다. 조달청에서 같은 적응 면역 반응은 장 내강에서 파생 된 항원에 대한 응답으로 구동 때문입니다. luminal 항원의 샘플링은 M 세포로 알려진 enterocytes 및 항원 샘플링 세포 모두로 구성되어 있습니다 대과 - 관련 상피 (FAE)에 의해 달성된다. FAE 아래의 하위 상피 돔 (SED) 지역에, 대 식세포, B 세포, 그리고 CD4 + T 세포를 5-9로 혼합 된 수지상 세포 (DC가)의 네트워크에 자리 잡고 있습니다. 각 PP 림프 follicl의 핵심e는 follicular의 수지상 세포 (FDCs)와 T 세포 풍부한 interfollicular 지역으로 둘러싸인 B 세포 풍부한 중앙 본원 센터입니다. 이가 + B 세포 plasmablasts와 CD4 + 효과기 및 메모리 셀의 개발에 조달청 결과로 항원 샘플링 그 종자 주위의 얇은 판의 propria와 점막 침략자에 대한 광범위한 내성을 제공합니다.

조달청의 항원 샘플링, 처리, 및 프리젠 테이션과 관련된 복잡한 immunologic 이벤트를 해부하는 것은 PP 세포는 장의 점막에 총 림프 세포의 아주 작은 일부를 구성하는 것을 생각하면 부담스러운 작업입니다. 이 환경에서 세포의 체외 특성화에에 도움이하기 위해, 우리는 흐름 cytometric 및 기능 분석뿐만 아니라, immunofluorescence 현미경과 immunohistology에 대한 cryosections을 PP 준비하기위한 프로토콜 총 마우스 PP 전지를 준비하기위한 프로토콜을 제공합니다. mous의 절연, 특성 및 immunostaining에 대한 프로토콜전자 PP 전지는 이러한 기술 할 5,6,9-11를 인용 25 년 이상 거슬러 올라가는 많은 참조가 있다는 사실에 의해 입증, 본질적으로 소설이 아닙니다. 오히려, 우리의 프로토콜은 처음 조달청를 수집 조사의 간소화 (및 영상) 메소드를 제공합니다. 우리가 설명하는 기술을 쉽게 습득하고 쉽게> 90 % 세포 생존과 세포의 큰 숫자를 얻을 수 있습니다. cryosectioning 프로토콜은 이상적으로 immunofluorescence 얼룩 및 공 촛점 이미징에 적합 높은 재현 시리얼 섹션을 산출. 또한, 우리 프로토콜은 두 개의 다른 최근 주피터 기사를 보완합니다. 첫 번째는, 후쿠다 및 동료에 의해, PP M 세포 12 병원성 박테리아의 이해를 평가하는 출혈도 잡았 ileal 루프 assays의 사용을 설명합니다. 다른 하나는, Geem 및 동료에 의해 ​​DCS 및 마우스 장 점막에서 대 식세포의 분리 및 특성을 설명하지만, 명시 적으로 분석 13 일부터 조달청을 제외.

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프로토콜

동물은 종래의, 무균 조건 하에서 보관되었으며 워즈 워드 센터의 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC) 가이드 라인에 전체 준수 취급되었다.

1. 구강 Gavage

  1. 22 G를 x1.5-에 사용 관심 항원이나 미생물과 선택 (옵션) Gavage 마우스 변형. 무딘 엔드 먹이 바늘 (Popper 과학, 뉴 하이드 파크 (Hyde Park), NY). 배달 볼륨 마우스 당 400 μl를 초과 할 수 없습니다.

2. 유동 세포 계측법에 대한 PP 세포의 분리

  1. 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 가이드 라인에 따라, CO 2 질식으로 쥐를 안락사시켜야.
  2. 70 % 에탄올 또는 수술하기 전에 betadine으로 복부를 정화. 갈비의 기본에서 1.5 cm에 대한 중간 선을 따라 처음 수술 학년 가위를 사용하여 하나의 (1 ㎝) 절개를 포함하는 표준 개복술을 수행합니다. 당 노출itoneal 캐비티와이게 맹장을 식별합니다. ileal-cecal 교차점에서 터미널 소장을 하나 자르지 부드럽게 전체에서 장을 제거합니다. 이 복막 캐비티에서 제거되는대로 장 조직을 hyperextend 않도록주의보십시오.
  3. 젖은 종이 수건이나 Kimwipes의 침대에 소장을 놓는다. 조직 탈수를 방지하기 위해 식염수에 부드럽게 소장 젖었 어. 시각 장 (그림 1)의 반 장간막 측에있는 개인 조달청를 확인합니다. 일반적으로 한 번의 마우스가 고르게 회장 (말초)에 십이지장 (근위)에서 배포됩니다 5-10 표시 조달청이 있습니다. 평균적으로, 네 마우스 23 조달청를 얻을 수 있습니다.
  4. 곡선 외과 가위, 부드럽게 소비세 개인 조달청과 차가운 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)에 넣어 사용하기. 참고, 가위 방금 PP 위에 곡선 측을 배치하고 부드럽게 조직에 적용해야합니다. 소비세 만 PP (안 surroundiNG 조직)과 차가운 HBSS로 전송됩니다.
    참고 : 앞으로 제 2의이 시점에서 모든 incubations 및 원심 분리 단계는 ° C 세포 생존 능력을 유지하기 위해 4시에 수행해야합니다.
  5. 37 15-20 분 5 ML의 비장 분리 매체 및 배양에 조달청을 전송 ° C 힘차게 250 rpm으로 흔들어 동안. 긴 배양 시간은 부정적인 세포 생존에 영향을 미칩니다.
  6. 멸균 (autoclaved) 70 μm 나일론 메쉬 셀 스트레이너에 대한 단일 세포 현탁액, 장소 조달청을 생성하고 강제로 1 참조 주사기에서 플런저의 기본을 사용하여 메쉬로 조직을 분쇄합니다. 또한, 두 불투명 멸균 유리 현미경 슬라이드 (봉투에 autoclaved)과 부드럽게 앞뒤로 운동과 조직을 부러 사이의 샌드위치 조달청. 5 ML 팔콘 튜브에 세포 현탁액을 전송하기 위해 멸균 전송 피펫을 사용합니다.
  7. 세포 현탁액 1 mm의 최종 농도에 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가합니다. 대한 락커에 품다상온에서 5 분 거리에 있습니다.
  8. 두 번째 70 μm 전지 스트레이너를 통해 가만히 따르다 세포 현탁액은 남아있는 세포 집계 또는 조직 파편을 제거합니다. 15 또는 50 ML 원뿔 튜브에 세포를 수집합니다.
  9. 부드러운 원심 분리에 따라 셀 (500 XG에서 5 분). 인산염 식염수 (PBS)는 1퍼센트 태아 송아지 혈청 (FCS)를 포함하는 버퍼입니다 흐름 버퍼에 가만히 따르다 표면에 뜨는 및 resuspend 세포.
  10. 휴대폰 번호와 가능성을 확인하려면 trypan 파랑에 1시 10분 세포를 희석하고 시각적으로 가벼운 현미경과 hemocytometer를 사용하여 세포를 검사한다. 또한, 백작 셀 카운터 (Invitrogen) 또는 이와 유사한 악기가 자동으로 셀 번호와 생존을 열거하는 데 사용할 수 있습니다.
    20-25 조달청를 시작으로,이 프로토콜은> 2.5 X 10 6 총 세포를 얻을 수 있습니다. 이 ~ 0.8-1.2 마우스 당 X 10 6 세포에 equates.

유동 세포 계측법에 대한 세포의 항체 라벨링

<안녕, 시작 = "11">
  • 96 - 웰 둥근 바닥 판 우물에 세포를 (물론 당 10 5) 투여.
  • 부드러운 원심 분리 (1,000 XG에서 5 분), 그리고 부드럽게 반전 플레이트에 의해 가만히 따르다 표면에 뜨는에 따라 판.
  • FC 블록 버퍼에 세포를 Resuspend 15 분 동안 얼음에 품다. 상업적으로 이용 가능한 FC 블록 버퍼의 수 (예 쥐 안티 - 마우스 CD16/CD32, BD Biosciences)가 있지만, 우리는 단순히 손쥐에 대한 단클론 IgG 1 숨기면 쥐 B 세포 하이 브리 도마 (ATCC 2.4.G2)에서 소비 매체를 사용하여 이 단계에 대한 Fcγ 수용체.
  • 이상과 같이 부드러운 원심 분리 (1,000 XG에서 5 분), 그리고 부드럽게 반전 플레이트에 의해 가만히 따르다 표면에 뜨는에 따라 판.
  • 원하는 희석에서 세포 현탁액에 직접 형광 - 복합 항체를 추가하고, 지속적으로 요동과 30 분에 얼음에 품다.
  • 제목 부드러운 원심 분리로 판 (1,000 XG에서 5 분), 그리고 가만히 따르다부드럽게 반전 플레이트에 의해 표면에 뜨는.
  • 흐름 버퍼 100 μl로 세포를 씻으십시오.
  • 부드럽게 반전 접시로 5 분, 그리고 가만히 따르다 표면에 뜨는 1,000 XG에서 판을 원심 분리기.
  • Resuspend 세포 흐름 버퍼 300 μl와 PHEM 버퍼에 1 % paraformaldehyde (60 MM 파이프, 25 밀리미터 HEPES, 10 MM EGTA, 4 MM pH를 6 MgCl 2)의 100 μl로 구성되어 400 μl 고정 버퍼.
  • 제목 셀 FACSCalibur 또는 동급를 사용하여 세포 계측법을 흘러. 셀 퀘스트 프로 소프트웨어 버전 5.2을 사용하여 결과를 분석합니다.

    • 3. PP Cryosections의 작성

    1. 조직 컬렉션의 사전에서 7x7x5 mm 플라스틱베이스 금형에 최적의 절삭 온도 (OCT) 화합물을 추가 할 수 있습니다. 또한 dewar 또는 얼음 양동이의 액체 질소 (> 750 ML)의 풀을 준비합니다.
    2. 마우스를 안락사시켜야하고 위에 설명 된대로, laparotamy을 수행합니다. 젖은 종이 타월에 소장과 장소를 제거합니다.
    3. 에cyrosectioning에 조달청을 따로 분리하여 PBS를 포함하는 페트리 접시에 단일 PP 및 전송 조직을 포함하는 작은 창자의 0.5 cm 가로 세그먼트를 잘라. 부드럽게 원치 않는 지저분한 오염 물질을 제거하기 위해 PBS로 해당 세그먼트의 내강을 씻어.
    4. 수직 10월를 포함하는 기본 틀 안에서 장 조직 세그먼트를 배치합니다. 액체 질소에 금형을 빠져과 조직은 (1-2 분) 완전히 정지 할 수 있습니다. 조직이 완전히 고정 될 때 10월의 색상은 분명에서 흰색으로 변경됩니다. . 더 점진적 냉각 (예 : 10월의 균열 줄이기 위해)의 경우, 액체 질소 증기를 냉각 이소 펜탄의 욕조에 담그지 곰팡이 ​​참고 : 액체 질소와 함께 작업 할 때 적절한 안전 고글을 착용하십시오.
    5. 집게를 사용하여 액체 질소에서 냉동의 기본 틀을 제거하고 곰팡이가 10월 블록의 가장자리가 부드럽게 할 수 있도록 충분히 만족 상온 (~ 10-15 초)에서 따뜻하게 할 수 있습니다. 그때부터 10월의 냉동 블록을 제거하려면금형, 금형 반전과 알루미늄 호일의 클린 4 X 4cm 기사에 블록을 꺼내 뒷면에 살짝 누르십시오. 즉시 액체 질소 나 드라이 아이스에 저장 라벨이 표본 가방에 호일과 장소에 조직을 래핑. 또는 냉동고 (<-20 ° C)에서 조직을 전송할 수 있습니다. 일주일 이내에 조직을 사용, 그렇지 않으면 블록은 나이가 취성이 될 것입니다.

    Cryosectioning

    1. Cryosection Leica CM3050S cryomicrotome 또는 동급를 사용하여 조직을. 그라 이오 스탯의 챔버 온도는 -21로 설정해야 ° C.
    2. 두께 12-14 μm 아르 섹션에 노력하고 있습니다.
    3. 피셔 SuperFrost 플러스 (또는 이에 상응하는 금액)의 유리 현미경 슬라이드로 섹션을 수집하여 표준 저전력 광 현미경을 사용하여 시각적으로 검사한다. 여러 섹션 슬라이드에서 수집되는 경우가 하류 착색 응용 프로그램 모여 있는지 확인합니다.
    4. 스토어 t그는 슬라이드 상자에 실온에서 슬라이드하고, 이상적으로, 몇 일 이내에 사용하십시오.

    Cryosections의 항체 라벨링 및 공 촛점 현미경 분석

    1. 2 분을위한 조직 염색법 병이나 랙에 아세톤에 빠져 슬라이드 (또는 메탄올). 장시간 부화는 슬라이드에서 분리 조직의 원인이 될 수 있습니다.
    2. 새로운 착색 병에 슬라이드를 갈아 3 분마다 PBS-T (0.05 % 십대 초반-20과 1X PBS)로 3 회 씻는다.
    3. ImmEdge의 소수성 펜으로 섹션을 둘러 싸다. 이 시약 및 항체가 incubations 동안 그 지역에 국한 유지 될 수 있도록해야합니다.
    4. 빛으로부터 보호 humidified 챔버에서 37 ° C에서 30 분을 위해 블록 버퍼에 슬라이드 (PBS에 2 % 염소 혈청을) 품다.
    5. 37 10 분에 FC 블록 버퍼 (위 참조) 슬라이드를 품다 ° C.
    6. PBS-T 및 Kimwipes 또는 기타 흡수제 조직을 사용하여 섹션을 건조한 지역에서 수영을 슬라이드.실제 조직 섹션을 터치하면 안됩니다.
    7. 오버레이 조직 37 번 30 분을위한 기본 항체 솔루션과 배양 ° humidified 챔버에서 C로 섹션을 제공합니다. 기본 항체는 일반적으로 20 μg / ML의 최종 농도에 블록 버퍼에 희석되어 있습니다. 많은 셋처럼 항체가이 단계에서 직접 결합 할 수 있기 때문에 직접 표시 주요 항체의 사용은 바람직하다. 직접 표시된 항체는 또한 추가 항체 부화 단계에 대한 필요성을 제거합니다.
    8. 워시는 PBS에 빠져 3 회 (5 분마다)을 슬라이드.
    9. 만약 수분 챔버에서 37 ° C에서 30 분 관련 보조 항체와 필요 품다 슬라이드.
    10. 워시는 PBS에 빠져 3 회 (5 분마다)을 슬라이드.
    11. 위의 설명 PHEM 버퍼의 1 % paraformaldehyde에 4 분을 위해 슬라이드를 품다.
    12. 1 분에 PBS로 슬라이드를 씻어.
    13. 드라이 Kimwipes를 사용하여 섹션을 지역 또는 다른 흡수다닐 조직. 실제 조직 섹션을 터치하면 안됩니다. 피펫이나 스포이트를 사용하여 부드럽게 섹션에 직접 골드 장착 매체를 연장 한 방울을 넣으십시오. 거품을 피하기 위해 돌봐 장착 매체에 유리 coverslip을 적용합니다. 초과 장착 매체를 흡수하는 압지를 사용합니다.
    14. 상업 매니큐어와 건조한 공기 할 수있는 현미경 슬라이드에 인감이 coverslips.
    15. Leica TCS SP5 또는 이에 상응하는 공 촛점 현미경으로 슬라이드를 볼 수 있습니다.

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    결과

    총 PP 세포 monodisperse 현탁액의 흐름 cytometric 분석은 좋은 가난한 셀 준비를 확실히 구별을 보여줍니다. 80 %의 생존과 좋은 휴대 준비에서 세포의 대부분은 높은 기대 분산 (FSC), 높은 세포 볼륨의 지표, 낮은 측 분산 (SSC), 낮은 세포 단위 (그림 2A)의 표시기를 보여줍니다. 이 실험에서 우리는 의도적으로 (대신 PHEM의 PBS 플러스 1% FCS와 세포를 잠복기, 마지막 단계에서, 실온 (대신 얼음에?...

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    토론

    이 문서에서는, 우리는 immunostaining에 대한 흐름 cytometric 및 기능 분석 및 cryosections위한 단일 셀 준비를 PP 준비를 위해 병렬 프로토콜을 제공합니다. 두 가지 방법은 흐름 cytometer와 그라 이오 스탯을 사용할 수 있습니다 제공 높은 재현하고 쉽게 액세스 할 수 있습니다. 처음 수사를 위해이 비장에 비해, 조달청의 총 세포 수율이 상대적으로 빈약하다고 지적한다. 그럼에도 불구하고, 프로토콜은 우...

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    공개

    관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

    감사의 말

    우리는 세포 분석 및 파라핀 섹션의 준비 헬렌 존슨 (워즈 워드 센터 동물 조직 병리학 코어)의 도움을 Renjie 노래 (워즈 워드 센터 유동 세포 계측법 코어)을 감사드립니다. 우리는 공 촛점 현미경 및 이미지 수집과 도움 박사 리처드 A. 콜 (워즈 워드 센터 라이트 현미경 핵심)을 감사드립니다. 우리는 애니메이션 지원 앤디 벤틀리 (워즈 워드 센터 사진 및 삽화)을 인정하고 싶습니다.

    MDJ은 생명 과학 연구 재단, 하워드 휴즈 의학 연구소 (HHMI) 동지에 의해 지원됩니다. SA는 워즈 워드 센터 - 건강 연구 주식회사 교내 박사 친목에 의해 지원됩니다. 이 작품은 NIH 보조금 HD061916과 GM082978에 의해 부분적으로 지원되었다.

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    자료

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    항목 회사 고양이. # 코멘트 (선택 사항)
    10월 컴파운드 조직 - 테크 4583
    7x7x5 mm 기본 틀 Fisherbrand 22-363-552
    ImmEdge 펜 벡터 연구소 H-4000
    Superfrost 플러스는 슬라이드 열 과학 4951
    에지 라이트 블레이드 열 과학 4280L
    안티 - 마우스 CD11c-PE eBioscience 17-0114-82
    안티 - 마우스 CD45R/B220-APC BD Pharmigen 553092
    안티 - 마우스에는 3 번 CD-FITC BD Pharmigen 561798
    안티 - 마우스 CD4-PE BD Pharmigen 553652
    안티 - 마우스 CD8-PE BD Pharmigen 553032
    안티 - 마우스 CD19-PercP BioLegend 115531
    페놀 레드없이 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 피셔 과학 14175-079
    70 μm 셀 스트레이너 BD 팔콘 352350
    비장 해리 중 셀 기술을 줄기 7915
    염소 혈청 Invitrogen 16210-072
    FC 블록 ATCC 2.4.G2 HB-197 Supes은 셀 라인 2.4.G2에서 얻은
    구부러진 가위 FST 14061-09
    그라 이오 스탯 Leica 3050S
    FACS Calibur BD
    백작 셀 카운터 Invitrogen
    Hematoxylin 리처드 앨런 7211
    Eosin 리처드 앨런 71,304
    포르말린 Starplex 과학 3661

    표 1. 본 연구에 사용 된 시약 및 장비.

    참고문헌

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