Lenfositler ve mürin Peyer en Yamalar itibaren Dendritik Hücreler İzolasyon Ve immün

Özet

Peyer plaklarında hücrelerin belirli altgrupları (PPs), gut-ilişkili lenfoid dokuların primer endüktif sitelerin immünolojik işlevlerini anlamak giderek artan bir ilgi var. Burada akım sitometri analizi ve immun için PP cryosections için tek hücre hazırlıkları PP hazırlamak için paralel protokolleri anahat.

Özet

Peyer plaklarında (PPs) gut-ilişkili lenfoid dokuların ayrılmaz bileşenleri (GALT) ve intestinal immünosürveylansında ve homeostasis merkezi bir rol oynamaktadır. Bağırsak lümeninde Partikül antijen ve mikrop sürekli folikül ilişkili epitel (FAE) PP M hücreleri tarafından örneklenmiş ve altta yatan bir dendritik hücreler ağı (DC'ler), makrofajlar ve lenfositler taşınmaktadır. Bu yazıda, murin PPs (i) tek hücre süspansiyonları içine uzaklaşılmış ve akım sitometri tabi ve (ii) cryosectioning ve immün için hazırlanan hangi protokolleri tanımlar. Flow sitometri için santrallerin mekanik ayrılmış ve daha sonra epitel hücreleri ve büyük enkaz ücretsiz tek hücre süspansiyonları üretmek için 70 mikron membran ile filtre vardır. 20-25 PPs (dört fareler) ile başlayarak, bu hızlı ve tekrarlanabilir bir yöntemdir> 2,5 nüfusu verir x 10> 90% hücre canlılığı ile ⁶ hücre. Cryosectioning, taze içinly izole PPs bir cryomicrotome kullanarak o Optimal Kesme Sıcaklık (OCT) orta, sıvı azot içinde ek dondurulmuş ve kesitli batırılır. Doku kesitleri (5-12 mikron), aseton veya metanol ile tespit edilmiş, hava ile kurutulmuş, ve daha sonra immün tabi tutulmuştur.

Giriş

Peyer plaklarında (PPs) insan ve farelerde (Şekil 1) ince barsak boyunca mevcut organize lenfoid folikül makroskopik büyüklükler ve mukozal immün yanıtları diyet antijenler, komensal bakteriler, mikrobiyal patojenler ve oral aşılar karşı başlatılan hangi birincil siteler teşkil ^1-4. Böyle mezenterik lenf düğümleri gibi diğer periferal lenfoid dokuların aksine, PPs afferent lenfatikler yoksundur. PPs böyle, adaptif immün yanıtları intestinal lümen elde antijenlere yanıt olarak tahrik gibi. Luminal antijenlerinin örnekleme M hücreleri olarak bilinen enterocytes ve antijen-örnekleme hücrelerinin her iki oluşan folikül ilişkili epitel (FAE) ile gerçekleştirilmektedir. FAE altında, alt-epitelyal kubbe (SED) bölgesinde, makrofaj, B hücreleri ve CD4 ⁺ T hücreleri ^5-9 ile iç içe dendritik hücreler (DC) bir ağ yatıyor. Her PP lenfoid follicl özündeE foliküler dendritik hücreler (FDCs) ve T hücreden zengin interfolliküler zonları ile çevrili bir B hücre zengini Orta germinal merkez vardır. IgA + B hücre plasmablasts ve CD4 ⁺ efektör ve bellek hücrelerinin gelişiminde PPs sonuçları Antijen örnekleme o tohumu çevreleyen lamina propria ve mukoza işgalciler geniş bir bağışıklık sağlar.

PPs antijen örnekleme, işleme ve sunum ile ilişkili kompleks immünolojik olaylar Diseksiyon PP hücreleri bağırsak mukozasında toplam lenfoid hücrelerin ancak çok küçük bir kısmını teşkil ettiği göz önüne alındığında, zor bir iştir. Bu ortamda hücrelerin in vitro olarak karakterize yardımcı olmak için, akış sitometrisi ve işlevsel analizi, hem de immün flüoresan mikroskopi ve immünohistoloji için cryosections PP hazırlanması için bir protokol için toplam fare PP hücrelerinin hazırlanması için bir protokol sağlar. Mous izolasyonu, karakterizasyonu ve immun Bizim protokolE PP hücreleri bu teknikler ^5,6,9-11 cite daha 25 yıl öncesine tarihlenen çok sayıda başvuru olduğu gerçeğini kanıtladığı, başlı başına roman değildir. Aksine, protokol, ilk kez için PPs toplama araştırmacılar için düzenlenmiş bir (görme ve) bir yöntem sağlar. Bizim tarif teknikler kolayca hakim ve kolayca>% 90 hücre canlılığı ile hücrelerin büyük sayıda elde edilir. Cryosectioning protokolü ideal immünofloresan boyama ve konfokal görüntüleme için uygun son derece tekrarlanabilir seri kesitler verir. Ayrıca, protokol diğer iki yeni vallahi makaleler tamamlar. İlk, Fukuda ve arkadaşları tarafından, PP M hücreleri ¹² ile patojen bakterilerin alımını değerlendirmek için bağlanan ileal loop testlerinin kullanımı anlatılmaktadır. Diğer, Geem ve arkadaşları tarafından, DC'ler ve fare intestinal mukozadan makrofaj izolasyonu ve karakterizasyonu açıklar, ancak açıkça onların analiz ¹³ PPs dışlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Hayvanlar geleneksel, spesifik patojen free koşullarda muhafaza edildi ve Wadsworth Merkezi'nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (IACUC) kurallarına tam uyumlu olarak tedavi edildi.

1. Oral Gavaj

1. 22 G x1.5-kullanarak ilgi antijen veya mikroplarla seçim (İsteğe bağlı) Gavaj fare zorlanma. Künt uç besleme iğne (Popper Bilimsel, New Hyde Park, NY). Teslimat hacimleri fare başına 400 ul geçmemelidir.

2. Akış sitometrisi için PP Hücre İzolasyonu

1. Kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (IACUC) kurallarına göre, CO ₂ boğulma tarafından fareler Euthanize.
2. % 70 etanol veya cerrahi öncesi betadin ile karın temizleyin. Göğüs kafesinin tabanı 1,5 cm'lik orta hat başında birlikte cerrahi sınıf makas kullanarak tek bir (1 cm) kesi yapılır standart laparotomi gerçekleştirin. Başına Açığapreperitoneal kavite ve körbağırsak tanımlar. Ileal-çekal kavşakta terminali küçük bağırsak Kırpmalı ve yavaşça bütünüyle bağırsak çıkarın. Bu periton boşluğuna kaldırılır ediliyor gibi bağırsak dokusundan hyperextend vermemeye özen.
3. Nemli kağıt havlu veya Kimwipes bir yatak üzerinde ince bağırsak yatırın. Doku kaybını önlemek için tuzlu su ile hafifçe ince bağırsak ıslatın. Görsel olarak bağırsak (Şekil 1) 'in anti-mesenterik tarafında bulunan bireysel PPs tanımlar. Genellikle, tek bir fare eşit ileum (distal) için duodenum (proksimal) dan dağıtılır 5 ila 10 görünür PPs vardır. Ortalama olarak, dört fare 23 PPs verecektir.
4. Kavisli cerrahi makas, yavaşça tüketim bireysel PPs ve soğuk Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) koyun kullanma. Not, makas sadece PP yukarıda eğri tarafı yukarı yerleştirilir ve daha sonra yavaşça dokuya uygulanmalıdır. Tüketim sadece PP (değil surrounding doku) ve soğuk HBSS transfer.
   Not: İleri Bölüm 2'de bu noktadan tüm inkübasyonlar ve santrifüj adımları ° C hücre canlılığı korumak için 4 yapılmalıdır.
5. 37 az 15-20 dakika için 5 ml Dalak Ayrılma Orta ve inkübe içine PPs aktarın ° C kuvvetlice 250 rpm'de sallayarak ise. Daha uzun inkübasyon süresi olumsuz hücre canlılığı etkileyecektir.
6. Steril (otoklav) 70 mikron naylon örgü hücre süzgecinden tek bir hücre süspansiyonu, yer PPs oluşturmak ve zorla bir 1 cc şırınga bir pistonun tabanı kullanılarak örgü içine doku öğütmek için. Alternatif olarak, iki buzlu steril cam mikroskop slaytlar (zarf içinde otoklava) ve hafifçe ileri geri hareket ile dokulara öğütmek arasında sandviç PPs. Bir 5 ml Falcon tüp içine hücre süspansiyonu aktarmak için bir aktarma steril pipet kullanın.
7. Hücre süspansiyonu ile 1 mm arasında bir nihai konsantrasyon için EDTA ekleyin. Bir rocker üzerinde inkübeOda sıcaklığında 5 dakika.
8. İkinci bir 70 mikron hücre süzgecinden Durusu hücre süspansiyonu kalan hücresel toplamları veya doku enkaz kaldırmak için. 15 ya da 50 ml konik tüp hücreleri toplayın.
9. Nazik santrifüj Konu hücreleri (500 x g'de 5 dakika). Fosfat salin (PBS)% 1 dana fetus serumu (FCS) içeren tamponlu bir akış tampon içinde tekrar süspansiyon ve süpernatant Durusu hücreler.
10. Hücre sayısı ve canlılığı belirlemek için, tripan mavisi içinde 1:10 hücrelerin sulandırmak ve görsel bir ışık mikroskobu ve bir hemasitometre kullanarak hücrelerin kontrol edin. Alternatif olarak, bir Kontes hücre sayacı (Invitrogen) veya benzer bir cihaz otomatik hücre numaralarını ve canlılığı numaralandırmak için de kullanılabilir.
    20-25 PPs ile başlayarak, bu protokol> 2.5 x 10 ⁶ total hücre boyun eğmek zorundadır. Bu ~ 0.8-1.2 fare başına x 10 ⁶ hücre eşittir.

Akış sitometrisi için Hücrelerinin Antikor Etiketleme

11. Bir 96-kuyu yuvarlak tabanlı bir plakanın kuyularına hücreleri (çukur başına 10 ⁵⁾ dağıtın.
12. Nazik santrifüj (1.000 x g'de 5 dakika) ve yavaşça tersine plaka ile süzün süpernatant Konu plakası.
13. Fc blok tampon içinde tekrar süspansiyon ve hücreler 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Piyasada bulunan Fc blok tampon bir dizi (örneğin Sıçan anti-fare CD16/CD32, BD Biosciences) olmakla birlikte, biz sadece murin karşı monoklonal IgG ₁ salgılar bir sıçan B hücresi hibridoma (ATCC 2.4.G2) harcanan orta kullanmak Bu adım için Fcγ reseptörleri.
14. Yukarıdaki gibi nazik santrifüjleme (1.000 x g'de 5 dakika) ve yavaşça tersine plaka ile süzün süpernatant Konu plakası.
15. İstediğiniz dilusyondaki hücre süspansiyonları doğrudan fluorofor konjuge antikorlar ekleyin ve sürekli sallanan ile 30 dakika süreyle buz üzerinde inkübe edin.
16. Konu nazik santrifüj plaka (1.000 x g'de 5 dakika) ve süzünyavaşça tersine plakası tarafından süpernatant.
17. Akış tampon 100 ul hücreleri yıkayın.
18. Yavaşça tersine plakası ile 5 dakika ve süzün süpernatant 1.000 xg'de plaka santrifüjleyin.
19. Yeniden süspanse hücre akış tamponu 300 ul ve PHEM tampon içinde% 1 paraformaldehid (60 mM PIPES, 25 mM HEPES, 10 mM EGTA, 4 mM pH 6 _MgCl2) 100 ul oluşan 400 ul tespit tampon,.
20. Konu bir FACSCalibur hücreleri ya da denk kullanılarak akış sitometrisi. Hücre Görev Pro yazılımı sürüm 5.2 kullanarak sonuçları analiz edin.

3. PP Cryosections hazırlanması

1. Doku toplanması öncesinde, 7x7x5 mm plastik taban kalıpları Optimal Kesme Sıcaklık (OCT) bileşiği ekleyin. Ayrıca bir Dewar veya buz kovasının içinde sıvı azot (> 750 ml) bir havuz hazırlamak.
2. Fare Euthanize ve yukarıda tarif edildiği gibi, bir laparotamy gerçekleştirir. Islak kağıt havlu üzerine bağırsak ve yer çıkarın.
3. Karşıcyrosectioning için PPs yalıtmak, PBS içeren bir Petri kabı tek PP ve transfer doku içeren ince bağırsak 0,5 cm transvers segmentler kesti. Yavaşça istenmeyen fekal enkaz kaldırmak için PBS ile bu segmentlerin lümen durulayın.
4. Dikey Ekim içeren taban kalıpları içine bağırsak dokusundan segmentleri yerleştirin. Sıvı azot içinde kalıp daldırın ve doku (1-2 dk) tamamen dondurmak için izin verir. Doku tamamen donduğunda OCT rengi berrak beyaza dönüşecektir. . Daha kademeli bir soğutma (örneğin OCT çatlama azaltmak için) için, sıvı azot buharı ile soğutulur izopentan bir banyo daldırın kalıp Not: sıvı nitrojen ile çalışırken uygun güvenlik gözlükleri takın.
5. Forseps kullanarak sıvı azot dondurulmuş taban kalıpları çıkartın ve kalıp OCT blok kenarları yumuşatmak için izin yeterince uzun oda sıcaklığında (~ 10-15 sn) az ısınmasını bekleyin. O andan itibaren OCT donmuş blok kaldırmak içinkalıp, kalıp ters çevirin ve alüminyum folyo temiz bir 4 x 4 cm parça üzerine blok çıkarmak için tekrar üzerine hafifçe bastırın. Hemen sıvı azot veya kuru buz üzerinde depolanan bir etiketli numune torbaya folyo ve yerde doku sarın. Alternatif olarak, bir dondurucu (<-20 ° C) içinde doku aktarın. Bir hafta içinde doku kullanın, aksi blokları yaş kırılgan olacak.

Cryosectioning

6. Cryosection bir Leica CM3050S cryomicrotome ya da eşdeğerini kullanarak doku. Kriyostat üzerindeki odasının sıcaklığı -21 ayarlanmış olmalıdır ° C
7. Kalınlığı 12-14 mikron olan bölümler için çalışıyoruz.
8. Fisher SuperFrost Plus (veya eşdeğer) cam mikroskop Slaytlarınıza bölümleri toplayın ve standart bir düşük güç ışık mikroskobu kullanılarak görsel inceleyin. Birden çok bölümlü bir slayt üzerinde toplanan ediliyor, onlar aşağı boyama uygulamaları için bir araya kümelenmiş emin olun.
9. Mağaza to bir slayt kutusunda oda sıcaklığında slaytlar ve ideal bir kaç gün içinde bunları kullanmak.

Cryosections Antikor Etiketleme ve Konfokal Mikroskop Analizi

10. 2 dakika süreyle doku boyama kavanoz ya da raflar aseton içinde daldırın slaytlar (ya da metanol). Uzun süreli inkübasyon slayt ayırmak dokularda neden olabilir.
11. Yeni boyama kavanoza slaytlar aktarın ve 3 dk her PBS-T (% 0.05 Tween-20 ile 1X PBS) ile 3 kere yıkayın.
12. Bir ImmEdge hidrofobik kalemle bölümleri çevreler. Bu reaktifler ve antikor inkubasyon sırasında bu alanı sınırlı kalır sağlayacaktır.
13. Işıktan korumalı bir nemlendirilmiş bir oda içinde 37 ° C sıcaklıkta 30 dk için, blok tamponunda slaytlar (PBS içinde% 2 keçi serumu) inkübe edin.
14. 37, 10 dakika için Fc blok tamponu (yukarı bakınız) ile inkübe slaytlar ° C.
15. PBS-T ve Kimwipes veya diğer emici dokusu kullanılarak bölümler çevresinde kuru alanda Dip slaytlar.Gerçek doku kesitlerinde dokunmamaya özen gösterin.
16. Kaplama 37 doku 30 dakika için birincil antikor çözeltisi ile inkübe ° nemlendirilmiş bir oda içinde C ile bölümleri. Primer antikor tipik olarak 20 ug / ml 'lik nihai bir konsantrasyona blok tamponu içinde seyreltilir. En çok üç antikorlar bu aşamada direkt olarak kombine edilebilir, çünkü doğrudan doğruya-etiketli primer antikorların kullanılması arzu edilir. Doğrudan etiketli antikorlar ek antikor inkübasyon aşaması için ihtiyacı ortadan kaldırır.
17. Yıkama PBS batırılarak 3 kez (5 dk her) kayar.
18. Eğer bir nem odasında 37 ° C 'de 30 dakika süre ile ilgili ikincil antikor ile gerektiğinde inkübe kayar.
19. Yıkama PBS batırılarak 3 kez (5 dk her) kayar.
20. Yukarıda açıklandığı gibi PHEM tampon içinde% 1 paraformaldehid içinde 4 dk için slaytlar inkübe edin.
21. 1 dakika boyunca PBS ile slaytlar durulayın.
22. Kuru Kimwipes kullanarak bölümleri çevresindeki alanı veya diğer absorbeent doku. Gerçek doku kesitlerinde dokunmamaya özen gösterin. Bir pipet veya damlalık kullanarak, yavaşça bölümüne doğrudan Altın montaj orta Prolong bir damla yerleştirin. Kabarcıkları önlemek için dikkat çekici montaj ortam üzerine bir cam lamel uygulayın. Herhangi bir aşırı montaj orta absorbe kurutma kağıdı kullanın.
23. Ticari oje ve kurumaya bırakın ile mikroskop slaytlar Seal lamelleri.
24. Leica TCS SP5 veya eşdeğeri konfokal mikroskop ile slaytlar görüntüle.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Toplam PP hücreleri monodisperse süspansiyonlarının akış sitometrik analizi, iyi ve kötü hücre hazırlıkları arasında net bir ayrım ortaya koymaktadır. % 80'in üzerinde canlılığı ile iyi cep hazırlıkları, hücreler büyük çoğunluğu yüksek ileri saçılım (FSC), yüksek hücre hacmi bir göstergesi ve düşük yan dağılım (SSC), düşük hücre granülarite (Şekil 2A) bir göstergesi gösterir. Bu deneyde, biz de kasıtlı (yerine PHEM PBS artı% 1 FCS ile hücreler ku...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu yazıda, immün akım sitometri ve fonksiyonel analiz ve cryosections için tek hücre hazırlıkları PP hazırlamak için paralel protokolleri sağlamıştır. Her iki yöntem bir akış sitometresinin ve kriyostat olarak sağlanır, yüksek oranda tekrarlanabilir ve kolayca erişilebilir. Ilk kez araştırmacılar için bu dalak göre, santrallerin toplam hücre verimleri nispeten yetersiz olduğuna işaret edilmelidir. Bununla birlikte, protokol biz genellikle tek bir fare 0,8-1,2 x 10 ⁶ toplam PP hüc...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Madde	Şirket	Kedi. #	Yorumlar (isteğe bağlı)
Ekim Bileşik	Tissue-Tek	4583
7x7x5 mm Taban Kalıpları	Fisherbrand	22-363-552
ImmEdge Kalem	Vektör Labs	H-4000
Superfrost Artı Slaytlar	Thermo Scientific	4951
Kenar Rite Blade	Thermo Scientific	4280L
Anti-Fare CD11c-PE	eBioscience	17-0114-82
Anti-fare CD45R/B220-APC	BD Pharmigen	553092
Anti-fare CD3-FITC	BD Pharmigen	561798
Anti-fare CD4-PE	BD Pharmigen	553652
Anti-fare CD8-PE	BD Pharmigen	553032
Anti-Fare CD19-PercP	BioLegend	115531
Fenol kırmızısı olmaksızın Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS)	Fisher Scientific	14175-079
70 mikron hücre süzgecinden	BD Falcon	352.350
Dalak Ayrışma Orta	Hücre Teknolojileri Stem	7915
Keçi serumu	Invitrogen	16210-072
Fc Blok	ATCC 2.4.G2	HB-197	Supes hücre hattı elde 2.4.G2
Kavisli Makas	FST	14061-09
Kriyostat	Leica	3050S
FACS Calibur	BD
Kontes Hücre Sayacı	Invitrogen
Hematoksilen	Richard Allan	7211
Eosin	Richard Allan	71304
Formalin	Starplex Bilimsel	3661
			Tablo 1. Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipman.