マウスのパイエル板のリンパ球や樹状細胞を単離し、免疫染色

要約

パイエル板の細胞の特定の亜集団（PPS）、腸管関連リンパ組織の主要な誘導部位の免疫学的機能を理解する上で関心が高まっている。ここでは、フローサイトメトリー解析と免疫染色のためのPPの凍結切片のための単一細胞調製物を調製するためのPPのパラレルプロトコルの概要を説明します。

要約

パイエル板（PPS）は腸管関連リンパ組織（GALT）の不可欠な構成要素であり、腸の免疫監視と恒常性に中心的な役割を果たします。腸管腔における粒子状抗原や微生物を連続濾胞関連上皮にPP M細胞によってサンプリング（FAE）と樹状細胞（DC）、マクロファージ、リンパ球の基盤となるネットワークに輸送される。この記事では、我々は、マウスのPPは、（i）単一細胞懸濁物に解離され、フローサイトメトリーにかけ、（ii）の凍結セクショニングと免疫染色のために準備されているプロトコルについて説明します。フローサイトメトリーのために、PPは機械的に解離され、次に上皮細胞と大きな破片の自由な単一の細胞懸濁液を生成するために70μmの膜を通して濾過した。 20から25 PPS（4匹から）以降では、この度は迅速かつ再現性のある方法は、> 90％の細胞生存率> 2.5×10 ⁶細胞集団が得られます。凍結セクショニングのため、新鮮なLY孤立PPはcryomicrotomeを使用して、最適切断温度（OCT）培地、液体窒素で瞬間凍結し、切片に浸漬される。組織切片（5-12μm）は、アセトンやメタノールで固定し、空気乾燥され、その後免疫標識を行った。

概要

パイエル板（PPS）は、ヒトおよびマウスの小腸（ 図1）を全体に存在する組織化されたリンパ濾胞の巨視的凝集体であると粘膜免疫応答は食物抗原、共生細菌、病原微生物、及び経口ワクチンに対して開始されるときの主要な部位を構成^1-4。このような腸間膜リンパ節など他の末梢リンパ組織とは異なり、PPは、輸入リンパ管を欠いている。このように、PPSに適応免疫応答は、腸管腔に由来する抗原に応答して駆動されています。管腔の抗原のサンプリングは、腸およびM細胞として知られている抗原のサンプリングセルの両方で構成されている濾胞関連上皮（FAE）によって達成される。 FAEの下に、サブ上皮ドーム（SED）の領域では、マクロファージ、B細胞、CD4 ⁺ T細胞は^5月9日と混ざり樹状細胞（DC）のネットワークがあります。各PPリンパfolliclの中核にeは、濾胞樹状細胞（FDCS）とT細胞が豊富な濾胞ゾーンが隣接のB細胞が豊富な中央の胚中心である。のIgA + B細胞plasmablastsとCD4 ⁺エフェクターとメモリセルの開発にPPSの結果による抗原サンプリングその種子周囲の粘膜固有層および粘膜侵略に広い範囲への耐性を提供します。

PPSの抗原サンプリング、処理、プレゼンテーションに関連する複雑な免疫学的事象を解剖すると、PP細胞が腸管粘膜における総リンパ球様細胞のごく一部を構成することを考えると、大変な作業です。この環境における細胞の in vitro での特性評価で支援するために、我々は、フローサイトメトリーおよび機能解析だけでなく、免疫蛍光顕微鏡および免疫組織学のための凍結切片を調製するためのPPのプロトコルのために全マウスのPP細胞を調製するためのプロトコルを提供する。覚書の分離、特性評価、および免疫染色のために、我々のプロトコル電子PPの細胞は、これらの技術を^5,6,9-11を引用^し 、25年以上さかのぼる多くの参照があるという事実によって証明されるように、 それ自体は小説ではありません。むしろ、我々のプロトコルは、初めてPPを集める研究者のための合理化された（とビジュアル）メソッドを提供します。私たちが説明する技術を容易に習得し、容易に> 90％の細胞の生存率を持つ細胞を大量に産出されています。凍結セクショニングプロトコルは、理想的には、免疫蛍光染色し、共焦点イメージングに適した再現性の高い連続切片が得られます。さらに、我々のプロトコルは、2つの他の最近のJoveの記事を補完します。最初は、福田らは^、12のPP M細胞による病原細菌の取り込みを評価するためにライゲート回腸ループアッセイの使用について説明します。もう一つは、Geemらによる、マウスの腸粘膜からの樹状細胞やマクロファージの単離および特性を説明していますが、明示的に分析¹³からPPを除外。

プロトコル

動物は、従来、特定の病原体を含まない条件下で飼育し、ワズワースセンターの機関動物実験委員会（動物実験委員会）のガイドラインに完全に準拠して処理した。

1。経口胃管栄養法

1. 22 G 1.5倍インを使用して、目的の抗原や微生物との選択（任意）強制経口マウス系統。平滑末端給餌針（Popperの科学、ニューハイドパーク、ニューヨーク州）。配達ボリュームはマウス当たり400μlを超えないようにしてください。

2。フローサイトメトリー用のPP細胞の単離

1. 制度的動物のケアと使用委員会（IACUC）のガイドラインによると、CO ₂窒息によりマウスを安楽死させる。
2. 70％エタノールまたは手術前ベタジンで腹部を清める。胸郭の底から1.5cm約正中線に沿って始まり外科グレードのはさみを使用して、単一の（1cm）に切開を伴う標準的な開腹手術を行います。当たりを公開itoneal空洞と盲腸を識別します。回腸、盲腸の接合部に端子小腸を切り取ると優しくその全体が腸を削除します。それは腹膜腔から除去されるように腸組織を過度に伸ばすないように注意してください。
3. 湿ったペーパータオルやキムワイプのベッドの上で小腸を築く。組織の脱水を防ぐために、生理食塩水で軽く小腸を濡らす。視覚的に腸の抗腸間膜側（ 図1）の、其々のPPを識別します。一般的に、単一のマウスは均等に回腸（遠位）に十二指腸（近位）から配布される5から10目に見えるPPを持っています。平均して、4匹は23 PPをもたらすでしょう。
4. 湾曲した手術用のハサミ、優しく物品個々のPPを使用していて、冷たいハンクス平衡塩類溶液（HBSS）中に置いてください。 注 、はさみだけでPPの上にカーブ側を上に配置する必要があり、その後穏やかに組織に適用される。消費税​​PPのみ（ないsurroundingの組織）と冷HBSSに転送されます。
   注：前方に第2節では、この点から全てのインキュベーション及び遠心操作は°Cの細胞の生存を維持するために4で行われる必要があります。
5. 37℃で15〜20分間、5 mlの脾臓解離ミディアムとインキュベートにPPを転送℃で精力的に250rpmで振とうしながら。長いインキュベーション時間がマイナスに細胞の生存に影響を与えます。
6. 滅菌（オートクレーブ）を70μmナイロンメッシュセルストレーナー上の単一の細胞懸濁液を、場所のPPを生成して、強制的に1ccの注射器からプランジャーのベースを使用してメッシュに組織を粉砕する。あるいは、サンドイッチ2すりガラス滅菌ガラス顕微鏡スライドの間にPPS（封筒でオートクレーブ）、穏やかに前後に運動と組織を挽く。 5ミリリットルファルコンチューブに細胞懸濁液を転送するために滅菌ピペットを使用しています。
7. 細胞懸濁液に最終濃度1mMとなるようにEDTAを追加します。用ロッカーでインキュベート室温で5分間。
8. 残りの細胞凝集塊または組織片を除去するための第270μmのセルストレーナーを通してデカント細胞懸濁液。 15または50 mlコニカルチューブに細胞を回収する。
9. 穏やかに遠心（500×gで5分）の対象セル。 1％ウシ胎児血清（FCS）を含む生理食塩水（PBS）、リン酸緩衝化されているフロー·バッファ内の上清をデカントして細胞を懸濁。
10. 細胞数と生存率を決定するために、トリパンブルーに1時10細胞を希釈し、視覚的に光学顕微鏡と血球計数器を用いて細胞を検査します。代わりに、伯爵セルカウンター（Invitrogen社）または類似の測定器を自動的に細胞数と生存率を列挙するために使用することができます。
    PPは20から25で始まる、このプロトコルは> 2.5×10 ⁶総細胞が得られるはずです。これは、マウスあたり約0.8から1.2×10 ^6個の細胞に相当します。

フローサイトメトリー用の細胞の抗体ラベリング

<オールスタート= "11">

96ウェル丸底プレートのウェルに細胞（ウェル当たり10 ^5）を分注します。

穏やかな遠心分離（1,000×gで5分）、ゆっくりと反転板で上清をデカントの対象とプレート。

のFcブロックバッファーに細胞を再懸濁し、氷上で15分間インキュベートする。市販のFcブロックバッファの数（ 例えばラット抗マウスCD16/CD32、BD Biosciences社）がありますが、我々は、単にマウスに対するモノクローナルIgG _1を分泌ラットB細胞ハイブリドーマ（ATCC 2.4.G2）から使用済み培地を使用このステップのためのFcγ受容体。

静かに転倒板で上記のように穏やかに遠心（1,000×gで5分間）、上清をデカントの対象とプレート。

所望の希釈で細胞懸濁液に直接蛍光色素標識抗体を追加して、連続的な揺らしながら氷上で30分間インキュベートする。

件名穏やかに遠心（1,000×gで5分間）にプレートし、デカント静かに転倒板による上澄み。

フローバッファー100μlで細胞を洗浄します。

静かに転倒プレートで5分、そして上清をデカントし、1,000×gでプレートを遠心分離する。

フローバッファー300μlとPHEM緩衝液中の1％パラホルムアルデヒド（60mMのPIPES、25mMのHEPES、10mMのEGTA、pH6で4mMのMgCl _2）を100μlから成り再懸濁し、細胞を400μl固定バッファ、。

FACSキャリバーまたは同等品を使用したフローサイトメトリーの対象となる細胞。セルクエストプロソフトウェアバージョン5.2を使用して結果を分析します。

3。 PPの凍結切片の作製

1. 組織採取に先立ち、7x7x5ミリメートルプラスチック基金型に最適切断温度（OCT）の化合物を追加します。また、デュワーや氷のバケット内の液体窒素（> 750ミリリットル）のプールを用意しております。
2. マウスを安楽死させると上記のように、laparotamyを実行します。湿ったペーパータオルの上で腸と場所を削除します。
3. へcyrosectioning用のPPを分離し、PBSを含むペトリ皿に単一PPと伝達組織を含む小腸の0.5センチメートル横セグメントをカットします。優しく不要な糞破片を除去するためにPBSでこれらのセグメントの内腔を洗浄してください。
4. 垂直に10月を含むベース金型内腸組織セグメントを配置します。液体窒素中で金型を浸し、組織を完全に止めることができるように（1〜2分）。組織が完全に凍結しているときに10月の色は透明から白色に変わります。 。より緩やかな冷却（ 例えば 10月の割れ低減する）ために、液体窒素で冷却したイソペンタンの蒸気槽に浸す型注意：液体窒素を扱うときに、適切な安全ゴーグルを着用する。
5. ピンセットを用いて液体窒素から凍結ベース金型を外し、金型は10月ブロックのエッジが柔らかくできるようにするために必要な時間だけ、室温（約10から15秒）で温めることができます。その時から10月の冷凍ブロックを削除するには金型は、金型を反転させ、アルミ箔のきれいな4×4cmの部分にブロックを取り出すときに背中を軽く押してください。直ちに液体窒素やドライアイス上に格納されているラベルの付いた標本袋に箔と場所にティッシュを包む。あるいは、（<-20℃）の冷凍庫に組織を移す。週間以内に、組織を使用、それ以外のブロックは、年齢とともにもろく​​なります。

凍結セクショニング

6. 凍結切片ライカCM3050S cryomicrotomeまたは同等品を使用して組織を。クライオスタット上のチャンバー温度-21に設定する必要があり℃に
7. 厚さが12から14ミクロンであるセクションに努めています。
8. フィッシャーSuperFrostプラス（または同等品）ガラス顕微鏡スライド上のセクションを収集し、標準的な低消費電力の光顕微鏡を用いて視覚的に検査する。複数のセクションをスライド上に収集されている場合は、それらが下流染色アプリケーションのために一緒にクラスタ化されていることを確認してください。
9. ストアトン彼は理想的には、スライドボックスに室温でスライドして、数日以内にそれらを使用しています。

凍結切片および共焦点顕微鏡分析の抗体標識

10. 2分間組織染色jarまたはラック内のアセトンに浸しスライド（またはメタノール）。長時間のインキュベーションは、スライドからデタッチする組織を引き起こす可能性があります。
11. 新しい染色瓶にスライドを移し、3分間ずつ、PBS-T（0.05％Tween-20を含む1×PBS）で3回洗浄する。
12. ImmEdge疎水性ペンでセクションを取り囲んでいます。これは、試薬および抗体はインキュベーションの間にその区域に限定されたままであることが保証されます。
13. 光から保護加湿チャンバー内で37℃で30分間ブロックバッファのスライド（PBS中2％ヤギ血清）をインキュベートする。
14. 37℃で10分に対するFcブロックバッファ（上記参照）を使用してスライドをインキュベート
15. PBS-Tとキムワイプまたは他の吸収性組織を使用してセクションの周りの乾燥した場所にスライドを浸します。実際の組織切片を触れないように注意してください。
16. 37℃で30分間加湿チャンバー内のCのための一次抗体溶液とインキュベートするオーバーレイ組織切片。一次抗体は、典型的には、20μg/ mlの最終濃度になるようにブロックバッファー中に希釈されています。最大3つの抗体は、この段階で直接結合することができるため、直接標識一次抗体の使用は、望ましいです。直接標識された抗体はまた、追加の抗体インキュベーション工程の必要性を排除します。
17. 洗浄はPBS中に浸漬することにより3回（各5分間）をスライドします。
18. もし水分チャンバー内で37℃で30分間、関連する二次抗体を用いて、必要に応じて、インキュベートスライド。
19. 洗浄はPBS中に浸漬することにより3回（各5分間）をスライドします。
20. 上記のようにPHEMの緩衝液中の1％パラホルムアルデヒド中で4分間スライドをインキュベートする。
21. 1分間PBSでスライドを洗浄します。
22. キムワイプまたは吸収する他のを使用してセクションの周りにドライエリア耳鼻咽喉科組織。実際の組織切片を触れないように注意してください。ピペットやスポイトを使って、優しくセクションに直接メディアをマウント延長ゴールドのドロップを置きます。気泡がないように注意しながら取り付け媒体上にカバーガラスを適用します。余分な封入剤を吸収するあぶらとり紙を使用しています。
23. 商業マニキュアと顕微鏡スライドにカバースリップを密封し、空気乾燥することができます。
24. ライカTCS SP5または同等の共焦点顕微鏡を用いてスライドを表示します。

結果

合計PP細胞の単分散懸濁液を用いたフローサイトメトリー解析は良いと貧しい細胞調製の間に明確な区別を明らかにする。 80％以上の生存率との良好な細胞調製では、細胞の大半は高い前方散乱（FSC）、高細胞容積の指標、および低側方散乱（SSC）が、低い細胞粒度（ 図2A）のインジケータを示しています。この実験では、我々はまた、意図的に（代わりPHEMのPBSプラス1％FCSを含?...

ディスカッション

この記事では、我々は免疫染色、フローサイトメトリーおよび機能解析および凍結切片のための単一細胞調製物を調製するためのPPのパラレルプロトコルを提供してきました。どちらの方法でも、フローサイトメーターとクライオスタットが利用可能である限り、再現性の高い、容易にアクセス可能です。初めての調査官のためには、脾臓と比較すると、PPSからの全細胞収量が比較的貧弱で?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
アイテム	会社	猫。 ＃	コメント（オプション）
OCTコンパウンド	組織 - Tek社	4583
7x7x5 mmベース金型	Fisherbrand	22-363-552
ImmEdgeペン	ベクトルラボ	H-4000
Superfrostプラススラ​​イド	サーモサイエンティフィック	4951
エッジ儀式ブレイド	サーモサイエンティフィック	4280L
抗マウスのCD11c-PE	eBioscience社	17-0114-82
抗マウスCD45R/B220-APC	BD Pharmigen	553092
抗マウスCD3-FITC	BD Pharmigen	561798
抗マウスCD4-PE	BD Pharmigen	553652
抗マウスCD8-PE	BD Pharmigen	553032
抗マウスCD19-PercP	BioLegend	115531
フェノールレッドを含まないハンクス平衡塩溶液（HBSS）	フィッシャー·サイエンティフィック	14175-079
70μmのセルストレーナー	BDファルコン	352350
脾臓解離ミディアム	電池技術を食い止める	7915
ヤギ血清	インビトロジェン	16210-072
FCブロック	ATCC 2.4.G2	HB-197	細胞株から得られた2.4.G2 Supes
湾曲したシザー	FST	14061から09
低温保持装置	ライカ	3050S
FACSソウルキャリバー	BD
伯爵セルカウンター	インビトロジェン
ヘマトキシリン	リチャード·アラン	7211
エオシン	リチャード·アラン	71304
ホルマリン	Starplex科学	3661
			表1本研究で使用した試薬および装置。