Изоляция и Иммуноокрашивание лимфоциты и дендритные клетки из мышиных Патчи Пейера

Резюме

Существует растущий интерес в понимании иммунологических функций конкретной субпопуляции клеток в Пейеровы бляшки (PPS), первичные индуктивных участков кишечника связанных лимфоидной ткани. Здесь мы наметим параллельных протоколов для подготовки PP одного клеточные препараты для проточной цитометрии анализа и PP cryosections для иммунной окраски.

Аннотация

Пейеровы бляшки (ПП) являются неотъемлемой частью кишечника, лимфоидной ткани (GALT) и играют центральную роль в кишечном иммунологического и гомеостаза. Частицы антигенов и микроорганизмов в просвете кишечника постоянно, отобранных PP клетки M в фолликул связанных эпителия (FAE) и транспортируется в основной сети дендритные клетки (ДК), макрофаги и лимфоциты. В этой статье мы опишем протоколы, в которых мышиные ПП являются: (I) распадается на одном суспензии клеток и подвергали проточной цитометрии и (II), подготовленный для cryosectioning и иммунной. Для проточной цитометрии, PPS механически диссоциированных и затем фильтруют через 70 мкм мембран для создания одного клеточные суспензии бесплатно эпителиальных клеток и крупного мусора. Начиная с 20-25 PPS (от четырех мышей), этот быстрый и воспроизводимый метод дает населению> 2,5 х 10 ⁶ клеток с> 90% жизнеспособность клеток. Для cryosectioning, свежиеют изолированным PPs погружены в оптимальной температуры резания (ОКТ) среды, оснастки замороженной в жидком азоте, а затем разрезе использования cryomicrotome. Срезы тканей (5-12 мкм), сушат на воздухе, фиксировали ацетоном или метанолом, а затем подвергают иммунного.

Введение

Пейеровы бляшки (ПП) являются макроскопические агрегаты организованных лимфоидных фолликулов присутствует во всем тонком кишечнике людей и мышей (рис. 1) и составляют основные сайты, на которых слизистых иммунных ответов, возбужденное в отношении диетических антигенов, синантропных бактерий, патогенных микроорганизмов, а также пероральных вакцин ^1-4. В отличие от других периферических лимфоидных тканей, таких как мезентериальных лимфатических узлов, PPS не хватает афферентные лимфатические сосуды. Таким образом, адаптивный иммунный ответ в PPs приводятся в ответ на антигены, полученные из просвета кишечника. Выборка просвета антигенов осуществляется по фолликула связанных эпителия (FAE), который состоит как из энтероцитов и антиген-отбор проб клеток, известных как М-клетки. Под FAE, в суб-эпителиальные купола (SED) области, лежит сети дендритные клетки (ДК) смешались с макрофагами, В-клетки и CD4 ⁺ Т-клетки ^5-9. В основе каждой PP лимфоидной folliclе, фолликулярные дендритные клетки (ФСКН) и В-клеток, богатых центрального зародышевого центра, в окружении Т-клеток богатых зон интерфолликулярной. Антиген отбора образцов, ПП результатов в развитии IgA + В-клеток plasmablasts и CD4 ^{+-эффекторов} и клеток памяти, что семена окружающих ргорпа пластинки и обеспечивает иммунитет к широкому спектру к слизистой оболочке захватчиков.

Пройдя сложные события, связанные с иммунологической антиген выборки, обработки и представления в PPs является непростой задачей, учитывая, что PP клетки составляют лишь малую долю от общего лимфоидных клеток в слизистой оболочке кишечника. Чтобы помочь в в пробирке характеристика клеток в этой среде, мы предоставляем протокол для подготовки общего мыши PP ячеек для проточной цитометрии и функционального анализа, а также протокол для подготовки PP cryosections для иммунофлуоресцентного микроскопии и immunohistology. Наш протокол для выделения, характеристика и иммуноокрашивания МоВэлектронной PP клеток не нова сама по себе, о чем свидетельствует тот факт, что имеются многочисленные ссылки насчитывает более 25 лет, что привести эти методы ^5,6,9-11. Скорее всего, наш протокол обеспечивает обтекаемый (и визуальный) метод для следователей сбора PPs в первый раз. Методы мы опишем легко освоили и легко получить большое количество клеток с> 90% жизнеспособность клеток. Cryosectioning протокол дает высокую воспроизводимость серийных срезов идеально подходит для окрашивания иммунофлуоресценции и конфокальной микроскопии. Кроме того, наш протокол дополняет два других недавних статей Юпитера. Во-первых, Фукуда и коллег, описывает использование лигированную подвздошной анализы цикла для оценки поглощения патогенных бактерий PP клетки M ^12. Другой, Geem и коллег, описывает выделение и характеристика ДК и макрофагов мыши слизистой оболочки кишечника, но явно исключает ПП от их анализ ¹³.

протокол

Животные были размещены в обычных, специфических патогенов без условий и лечились в полном соответствии с институциональной животных Wadsworth центра по уходу и использованию комитета (IACUC) руководящих принципов.

1. Желудочный зонд

1. (Необязательно) зонд мыши штамма выбор с антигеном или микробов интерес помощью 22 G x1.5-в. тупой конец иглы кормления (Popper научных, New Hyde Park, NY). Объемы поставок не должна превышать 400 мкл на мышь.

2. Изоляция PP Клетки для проточной цитометрии

1. Усыпить мышей CO ₂ удушья, в соответствии с институциональными и использования животных комитета (IACUC) руководящих принципов.
2. Очисти живота с 70% этанола или бетадин до операции. Выполните стандартную лапаротомию, которая включает одну (1 см) разреза с использованием хирургических ножниц класса по средней линии начала около 1,5 см от основания грудной клетки. Expose вitoneal полости и определить слепой кишки. Надрез терминал тонкой кишки в подвздошную-слепой кишки соединения и осторожно удалить кишечник в полном объеме. Будьте осторожны, не hyperextend кишечной ткани, как это будет удален из брюшной полости.
3. Положите тонкую кишку на кровати влажные бумажные полотенца или Kimwipes. Смочить тонкий кишечник мягко физиологическим раствором, чтобы предотвратить обезвоживание тканей. Визуально определить индивидуальный PPs расположен на анти-брыжеечной стороне кишки (рис. 1). Как правило, один мышь имеет от 5 до 10 видимых PPs, которые равномерно распределены из двенадцатиперстной кишки (проксимального) в подвздошной кишки (дистальный). В среднем, четыре мышей даст 23 ПЗ.
4. Используя изогнутые хирургические ножницы, аккуратно акцизного отдельные ПЗ и поместить их в сбалансированный солевой раствор холодным Хэнка (HBSS). Обратите внимание, ножницы должны быть размещены кривой вверх чуть выше PP, а затем аккуратно наносят на ткань. Акцизный только PP (не surroundiнг ткани) и трансфер в холодном HBSS.
   Примечание: Все инкубации и центрифугирования шаги с этого момента в разделе 2 должно быть сделано при 4 ° С, чтобы сохранить жизнеспособность клеток.
5. Передача PPs в 5 мл селезенки Диссоциация средних и инкубировать в течение 15-20 мин при 37 ° С при интенсивном встряхивании при 250 оборотах в минуту. Больше времени инкубации отрицательно скажется на жизнеспособности клеток.
6. Для создания суспензии отдельных клеток, место PPs на стерильную (автоклавного) 70 мкм нейлоновый фильтр ячейки сетки и насильно молоть ткани в сетку, используя базу поршень от 1 мл шприца. Кроме того, сэндвич-ПП между двумя матовыми стерильные стеклянные предметные стекла (автоклаве в конвертах) и осторожно растереть тканей с возвратно-поступательное движение. С помощью стерильной пипетки передачи для передачи клеточной суспензии в 5 мл трубки Falcon.
7. Добавить ЭДТА до конечной концентрации 1 мМ к клеточной суспензии. Выдержите на качалку для5 мин при комнатной температуре.
8. Слейте клеточной суспензии через второе сито 70 мкм ячейки для удаления остатков сотовых агрегатов или ткани мусора. Сбор клеток в 15 или 50 мл коническую трубку.
9. Тема клеток нежной центрифугированием (5 мин при 500 мкг). Слейте супернатант и ресуспендирования клеток в потоке буфер, который является фосфатным буферным раствором (PBS), содержащим 1% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS).
10. Для определения количества клеток и жизнеспособности, разбавления клеток в 1:10 трипанового синего и осмотрите клетки с помощью светового микроскопа и гемоцитометра. Кроме того, счетчик графиня клетки (Invitrogen) или аналогичный прибор может быть использован для автоматического перечисления числа клеток и жизнеспособность.
    Начиная с 20-25 ПП, этот протокол должен дать> 2,5 х 10 ⁶ общего числа клеток. Это соответствует ~ 0.8-1.2 х 10 ⁶ клеток на мышь.

Антитела маркировки Клетки для проточной цитометрии

<ПР начала = "11">

Внесите клеток (10 ⁵ на лунку) в лунки 96-луночных круглым дном тарелку.

Тема пластину нежно центрифугированием (5 мин при 1000 мкг), а переливать супернатант осторожно обращения пластины.

Ресуспендируют клеток в буфере блока Fc и инкубировать на льду в течение 15 мин. Хотя есть ряд коммерчески доступных буферов Fc блока (например, антимышиным CD16/CD32, BD Biosciences), мы просто используем провели среды от крыс В-клеток гибридомы (ATCC 2.4.G2), которая выделяет моноклональных IgG ₁ против мышиных Fcγ рецепторами для этого шага.

Тема пластину нежно центрифугированием (5 мин при 1000 мкг), как указано выше, и переливать супернатант осторожно обращения пластины.

Добавить флуорофор-конъюгированных антител непосредственно к суспензии клеток в нужном разведении, и инкубировать на льду в течение 30 мин с непрерывным качалке.

Тема пластину нежно центрифугированием (5 мин при 1000 мкг), а переливатьсупернатант осторожно обращения пластины.

Вымойте клеток с 100 мкл буфера потока.

Центрифуга пластины при 1000 х г в течение 5 мин и супернатант сливают, осторожно обращения пластины.

Ресуспендируют клеток 400 мкл буфера фиксации, которая состоит из 300 мкл буфера потока и 100 мкл 1% параформальдегидом в PHEM буфера (60 мм труб, 25 HEPES мм, 10 мм EGTA, 4 мМ MgCl ₂ при рН 6).

Тема клеток проточной цитометрии с использованием FACSCalibur или эквивалент. Анализ результатов с помощью Cell Quest Pro версии 5.2.

3. Подготовка PP Cryosections

1. В преддверии ткани коллекции, добавить Оптимальная температура резания (ОКТ) соединения 7x7x5 мм пластиковых форм базы. Также подготовить бассейн жидкого азота (> 750 мл) в ведре Дьюара или льда.
2. Усыпить мыши и выполните laparotamy, как описано выше. Удалить кишечника и место на мокрые бумажные полотенца.
3. Кизолировать PPs для cyrosectioning, нарезать 0,5 см поперечного сегмента тонкой кишки, содержащие один PP и передачу ткани на чашку Петри, содержащую PBS. Аккуратно промойте полость из этих сегментов с PBS для удаления нежелательных фекальных мусора.
4. Поместите кишечные сегменты ткани вертикально внутри базы форм содержащие октября Погрузитесь форм в жидкий азот и позволяет ткани, чтобы заморозить полностью (1-2 мин). Цвет октября будет меняться от прозрачного до белого, когда ткань полностью заморожены. . Для более постепенным охлаждением (например, для уменьшения растрескивания OCT), погрузить плесень в ванной изопентана охлаждается жидким азотом паров Примечание: Носить соответствующие защитные очки при работе с жидким азотом.
5. Удалить замороженных форм базы с жидким азотом с помощью пинцета и позволит формы согреться при комнатной температуре достаточно долго (~ 10-15 сек), чтобы краям блока октября, чтобы смягчить. Чтобы затем удалить замороженные блоком октября отпресс-формы, переверните форму и аккуратно нажмите на спине, чтобы извлечь блок на чистое 4 х 4 см кусок алюминиевой фольги. Сразу обернуть тканью в фольгу и положить в сумку помечены образцы хранятся в жидком азоте или с сухим льдом. Кроме того, передача тканей в морозильной камере (<-20 ° C). Использование ткани в течение недели, в противном случае блоки становятся ломкими с возрастом.

Cryosectioning

6. Cryosection ткани с помощью Leica CM3050S cryomicrotome или эквивалент. Температура в камере на криостата должны быть установлены до -21 ° C.
7. Стремитесь к разделам, которые являются 12-14 мкм в толщину.
8. Сбор разделов на Fisher SuperFrost Plus (или эквивалент) предметные стекла микроскопа и визуального осмотра с использованием стандартной низкой световой микроскоп власти. Если несколько разделов, которые собираются на слайде, чтобы они сгруппированы вместе для последующих применений окрашивания.
9. Магазин тОн скользит при комнатной температуре в режиме слайд-бокс и, в идеале, использовать их в течение нескольких дней.

Антитела маркировки Cryosections и конфокальной микроскопии анализа

10. Погрузитесь слайды в ацетоне (или метанол) в тканях банку окрашивания или стеллажи на 2 мин. Длительная инкубация может привести к тканям оторваться от слайда.
11. Передача слайдов в новом банке окрашивания и промыть 3 раза PBS-T (1X PBS с 0,05% Tween-20) в течение 3 минут каждый.
12. Окружите участки с гидрофобным перо ImmEdge. Это гарантирует, что реагенты и антитела останутся ограничивается этой области во время инкубации.
13. Инкубируйте слайды в блоке буфера (2% козьей сыворотки в PBS) в течение 30 мин при 37 ° С в увлажненной камере, защищенном от света месте.
14. Инкубируйте слайды с Fc блок буфера (см. выше) в течение 10 мин при 37 ° C.
15. Dip слайдов в PBS-T и сухой области вокруг разделы, используя Kimwipes или другие абсорбирующие ткани.Будьте осторожны, не прикасайтесь к фактической срезов.
16. Наложение срезов ткани с первичным решением антител и инкубировать в течение 30 мин при 37 ° С в увлажненной камере. Первичные антитела, как правило, разводят в блоке буфера до конечной концентрации 20 мкг / мл. Использование непосредственно-меченые антитела первичного желательно, потому что целых три антитела могут быть объединены непосредственно на этот шаг. Непосредственно-меченых антител также устраняет необходимость в дополнительных шагов инкубации антитела.
17. Wash горки 3 раза (5 мин каждая) путем погружения в PBS.
18. Если необходимо, инкубировать слайды с соответствующими вторичными антителами в течение 30 мин при 37 ° C в камере влаги.
19. Wash горки 3 раза (5 мин каждая) путем погружения в PBS.
20. Инкубируйте слайды в течение 4 минут в 1% параформальдегидом в буфер PHEM, как описано выше.
21. Промыть слайдов с PBS в течение 1 мин.
22. Сухая зона вокруг разделы, используя Kimwipes или другие поглощаютных тканей. Будьте осторожны, не прикасайтесь к фактической срезов. С помощью пипетки или капельницы, аккуратно поместите каплю продлить Золотой монтажа средних непосредственно на раздел. Применить стекло покровное на монтажной средой заботясь, чтобы избежать пузырей. Используйте промокательной бумаги, чтобы поглотить излишки монтажной среды.
23. Печать покровные для микроскопа слайды с коммерческими лак для ногтей и дайте высохнуть на воздухе.
24. Просмотр слайдов с Leica TCS SP5 или эквивалентной конфокальной микроскопии.

Результаты

Проточной цитометрии анализа монодисперсных суспензий от общего числа клеток PP показывает четкое различие между хорошей и плохой подготовкой клетки. В хорошем клеточные препараты с более чем 80% жизнеспособность, подавляющее большинство клеток демонстрируют высокую рассеяния вперед...

Обсуждение

В этой статье мы предоставили параллельных протоколов для подготовки PP одного клеточные препараты для проточной цитометрии и функционального анализа и cryosections для иммунной окраски. Оба метода являются высокая воспроизводимость и легко доступны, при условии, цитометра и криостат имею?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Пункт	Компания	Кат. #	Комментарии (по желанию)
Соединение октября	Tissue-Tek	4583
7x7x5 мм Формы базы	Fisherbrand	22-363-552
ImmEdge Pen	Vector Labs	H-4000
Superfrost Plus Слайды	Thermo Scientific	4951
Пограничный Rite лезвия	Thermo Scientific	4280L
Anti-мышь CD11c-PE	eBioscience	17-0114-82
Anti-мышь CD45R/B220-APC	BD Pharmigen	553092
Anti-мышь CD3-FITC	BD Pharmigen	561798
Anti-мышь CD4-PE	BD Pharmigen	553652
Anti-мышь CD8-PE	BD Pharmigen	553032
Anti-мышь CD19-PerCP	BioLegend	115531
Сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS) без фенола красного	Fisher Scientific	14175-079
70 мкм ячейки фильтра	BD Falcon	352350
Средний селезенки Диссоциация	Стволовые клетки технологий	7915
Коза сыворотке	Invitrogen	16210-072
Fc блока	ATCC 2.4.G2	HB-197	Supes получить из ячейки 2.4.G2 линии
Изогнутые ножницы	FST	14061-09
Криостат	Leica	3050S
FACS Calibur	BD
Графиня Счетчик клеток	Invitrogen
Гематоксилин	Richard Allan	7211
Эозин	Richard Allan	71304
Формалин	Starplex Научные	3661
			Таблица 1. Реагенты и оборудование, используемые в этом исследовании.