Isolierung und Immunfärbung Lymphozyten und dendritische Zellen aus Murine Peyer-Plaques

Zusammenfassung

Es gibt ein wachsendes Interesse für das Verständnis der immunologischen Funktionen von bestimmten Subpopulationen von Zellen in Peyer-Plaques (PP), die primären induktiven Seiten des Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe. Hier beschreiben wir parallele Protokolle zur Herstellung PP Einzelzelle Zubereitungen für die durchflusszytometrische Analyse und PP Kryoschnitten für Immunfärbung.

Zusammenfassung

Peyer-Plaques (PP) sind integraler Bestandteil der Darm-assoziierten lymphatischen Gewebe (GALT) und spielen eine zentrale Rolle in der intestinalen Immunüberwachung und Homöostase. Teilchenförmigen Antigene und Mikroben im Darmlumen werden kontinuierlich von PP M Zellen im Follikel-assoziierten Epithel (FAE) abgetastet und transportiert zu einer darunterliegenden Netz von dendritischen Zellen (DCs), Makrophagen und Lymphozyten. In diesem Artikel beschreiben wir, Protokolle, in denen murine PPs sind (i) dissoziiert in einzelne Zellsuspensionen und einer Durchflusszytometrie und (ii) für Kryoschneiden und Immunfärbung vorbereitet. Für Durchflusszytometrie, sind PPs mechanisch dissoziiert und dann durch 70 um Membranen zu Einzelzellsuspensionen frei von Epithelzellen und Großabfallfördereinrichtung erzeugen. Beginnend mit 20-25 PPs (von vier Mäusen), ergibt dies eine schnelle und reproduzierbare Methode eine Bevölkerung von> 2,5 x 10 ⁶ Zellen mit> 90% der Lebensfähigkeit der Zellen. Für Kryoschneiden, frischely isolierten PPs werden in Optimal Cutting Temperature (OCT)-Medium, Snap-in flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend geschnitten mit einem cryomicrotome eingetaucht. Gewebeschnitte (5-12 um) sind luftgetrocknet, fixiert mit Aceton oder Methanol, und dann zu Immunmarkierung unterziehen.

Einleitung

Peyer-Plaques (PP) sind makroskopische Aggregate der organisierten lymphatischen Follikel in der kleinen Darm von Menschen und Mäusen (Abbildung 1) und bilden die primären Standorten, an denen mukosalen Immunantworten gegen diätetische Antigene, symbiotischer Bakterien, mikrobielle Pathogene und orale Impfstoffe ausgelöst werden ^1-4. Im Gegensatz zu anderen peripheren lymphatischen Gewebe wie den Mesenteriallymphknoten fehlt PPs afferenten Lymphgefäße. Als solche adaptive Immunantworten in PPs werden in Reaktion auf Antigene aus dem Darmlumen abgeleitet angetrieben. Die Abtastung wird die luminale Antigene durch den Follikel-assoziierten Epithel (FAE), die sowohl aus Enterozyten und Antigen-Sampling-Zellen als Zellen bekannt M besteht bewerkstelligt. Unterhalb des FAE im subepithelialen Kuppel (SED) Region liegt ein Netz von dendritischen Zellen (DCs) mit Makrophagen, B-Zellen und CD4 ⁺ T-Zellen ^5-9 vermischt. Im Kern jedes PP lymphatischen follicle sind follikulären dendritischen Zellen (FDC) und einem B-Zell-reiche zentrales Keimzentrum, durch T-Zell-reichen Zonen interfollikulären flankiert. Antigen Abtasten durch PPs führt zur Entwicklung von IgA + B-Zellen und CD4 ⁺ Plasmablasten Effektorzellen und Gedächtniszellen dass Saatgut der umgebende Lamina propria und bereitzustellen Immunität gegenüber einem breiten Spektrum an mukosalen Eindringlinge.

Sezieren die komplexen immunologischen Ereignissen mit Antigen Probenahme, Aufbereitung und Präsentation in PPs verbunden ist eine gewaltige Aufgabe, wenn man bedenkt, dass PP-Zellen nur einen winzigen Bruchteil der gesamten lymphatischen Zellen in der Darmschleimhaut bilden. Um in der in-vitro-Charakterisierung der Zellen in diesem Umfeld zu erleichtern, bieten wir ein Protokoll für die Vorbereitung insgesamt Maus PP-Zellen für die durchflusszytometrische und funktionelle Analyse, sowie ein Protokoll für die Vorbereitung PP Kryoschnitten für Immunfluoreszenz und Immunhistologie. Unser Protokoll für die Isolierung, Charakterisierung und Immunfärbung von mouse PP-Zellen ist an sich nicht neu, wie die Tatsache, dass es zahlreiche Hinweise aus mehr als 25 Jahren, dass diese Techniken zu nennen ^5,6,9-11 belegt. Vielmehr bietet unser Protokoll eine optimierte (und visuelle)-Methode für Ermittler sammeln PPs für die erste Zeit. Die Techniken, die wir beschreiben, sind leicht zu beherrschen und leicht nachgeben große Anzahl von Zellen mit> 90% der Lebensfähigkeit der Zellen. Die Kryoschneiden-Protokoll liefert reproduzierbare Schnittserien ideal für Immunfluoreszenzfärbung und konfokale Bildgebung eignet. Darüber hinaus ergänzt unser Protokoll zwei anderen kürzlich JoVE Artikel. Das erste, von Fukuda et al, beschreibt die Verwendung von ligierten ilealen Schleife Assays um die Aufnahme von pathogenen Bakterien, die durch M PP Zellen ¹² zu beurteilen. Die andere, von Geem und Kollegen, beschreibt die Isolierung und Charakterisierung von DCs und Makrophagen aus der Maus Darmschleimhaut, sondern schließt ausdrücklich PPs aus ihrer Analyse ¹³.

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Protokoll

Die Tiere wurden unter konventionellen, specific pathogen-freien Bedingungen untergebracht und wurden in voller Übereinstimmung mit Institutional Tier des Wadsworth Center Care und Use Committee (IACUC) Richtlinien behandelt.

Ein. Schlundsonde

1. (Optional) Gavage Mausstamm der Wahl mit Antigen oder Mikroben von Interesse mit einem 22 G x1.5-in. blunt-end Fütterung Nadel (Popper Scientific, New Hyde Park, NY). Liefermengen nicht überschreiten sollte 400 ul pro Maus.

2. Isolierung von PP Cells für die Durchflusszytometrie

1. Einschläfern Mäuse durch CO ₂ Ersticken nach institutionellen Pflege der Tiere und die Nutzung Ausschuss (IACUC) Richtlinien.
2. Reinigen Sie die Bauch mit 70% Ethanol oder betadine vor der Operation. Durchführen einer Standard-Laparotomie, die einen einzelnen (1 cm) unter Verwendung chirurgischer Qualität Einschnitt Scheren entlang der Mittellinie Anfang etwa 1,5 cm von der Basis der dem Brustkorb verbunden ist. Setzen Sie das proitoneal Hohlraum und Identifizierung der Blinddarm. Snip das Terminal Dünndarm bei der Ileum-cecal Kreuzung und entfernen Sie vorsichtig den Darm in seiner Gesamtheit. Darauf, nicht das Darmgewebe überstreckt, während es aus der Bauchhöhle entfernt wird.
3. Legen Sie den Dünndarm auf einem Bett aus feuchtem Küchenpapier oder Kimwipes. Befeuchten Sie den Dünndarm vorsichtig mit Kochsalzlösung, um Gewebe Austrocknung zu verhindern. Visuell identifizieren einzelnen PPs auf die anti-mesenterialen Seite des Darms (Abbildung 1). Typischerweise hat ein einziges Maus 5 zu 10 sichtbaren PPs die gleichmäßig aus dem Duodenum (proximal) an Ileum (distalen) verteilt. Im Durchschnitt werden vier Mäuse Ausbeute 23 PPs.
4. Mit gebogenen chirurgischen Schere vorsichtig Verbrauchsteuern einzelnen PPs und legen Sie sie in Balanced Salt kalten Hanks Solution (HBSS). Hinweis, sollte die Schere curve-Seite platziert werden bis knapp oberhalb der PP und dann sanft auf das Gewebe aufgebracht. Excise nur die PP (nicht umlieng Gewebe) und Transfer zum kaltem HBSS.
   Hinweis: Alle Inkubationen und Zentrifugationsschritte ab diesem Zeitpunkt in Abschnitt 2 bei 4 erfolgen ° C, um die Zellviabilität zu bewahren.
5. Übertragen PPs in 5 ml Spleen Dissoziation Medium und Inkubation für 15-20 min bei 37 ° C unter kräftigem Schütteln bei 250 Umdrehungen pro Minute. Längere Inkubationszeit wird sich negativ auf die Lebensfähigkeit der Zellen.
6. Um eine einzelne Zellsuspension, erfolgt PPs auf einem sterilen (autoklaviert) 70 um Nylonnetz Zellsieb erzeugen und zwangsweise mahlen das Gewebe in das Netz mit Hilfe der Basis eines Kolbens aus einem 1 ml-Spritze. Alternativ Sandwich PPs zwischen zwei frosted sterile Objektträger aus Glas (autoklaviert in Umschläge) und schonend zu mahlen Geweben mit einer hin-und herbewegt. Verwenden Sie eine sterile Pipette, um die Zellsuspension in ein 5 ml-Falcon-Röhrchen übertragen.
7. Hinzufügen EDTA bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zu der Zellsuspension. Inkubieren auf einer Wippe5 min bei Raumtemperatur.
8. Dekantieren Zellsuspension durch einen zweiten 70 um Zellsieb zu entfernen alle verbleibenden zellulären Aggregaten oder Gewebereste. Sammeln Sie Zellen in einer 15 oder 50 ml konischen Röhrchen.
9. Betreff Zellen sanfte Zentrifugation (5 min bei 500 xg). Dekantieren Überstand und resuspendieren Zellen in Strömungsrichtung Puffer, der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 1% fötalem Kälberserum (FCS) ist.
10. Um die Zellzahl und Lebensfähigkeit zu bestimmen, zu verdünnen Zellen 01.10 in Trypanblau und Sichtprüfung Zellen mit einem Lichtmikroskop und ein Hämozytometer. Alternativ kann ein Gräfin Zellenzähler (Invitrogen) oder ein ähnliches Instrument verwendet, um automatisch aufzuzählen Zellzahlen und Lebensfähigkeit werden.
    Beginnend mit 20-25 PPs, sollte dieses Protokoll Ausbeute> 2,5 x 10 ⁶ Zellen insgesamt. Dies entspricht ~ 0,8-1,2 x 10 ⁶ Zellen pro Maus.

Antibody Labeling der Zellen für die Durchflusszytometrie

11. Verzichten Zellen (10 ⁵ pro Vertiefung) in die Vertiefungen einer 96-well Rundboden Platten.
12. Betreff Platte sanfte Zentrifugation (5 min bei 1.000 xg) und dekantieren durch vorsichtiges Umdrehen der Platte.
13. Die Zellen in Fc Blockpuffer und inkubieren auf Eis für 15 min. Zwar gibt es eine Anzahl von kommerziell erhältlichen Fc Blockpuffer (zB Ratten-Anti-Maus-CD16/CD32, BD Biosciences) sind, verwenden wir einfach verbrauchte Medium aus einer Ratten-B-Zell-Hybridom (ATCC 2.4.G2), die einen monoklonalen IgG ₁ absondert gegen murine Fcy-Rezeptoren für diesen Schritt.
14. Betreff Platte sanfte Zentrifugation (5 min bei 1.000 xg) wie oben, und dekantieren Überstand durch vorsichtiges Umdrehen der Platte.
15. Hinzufügen fluorophorkonjugierten Antikörper direkt an Zellsuspensionen an gewünschten Verdünnung und Inkubation auf Eis für 30 min unter ständigem Schaukelstuhl.
16. Betreff Platte sanfte Zentrifugation (5 min bei 1.000 xg), und dekantierenÜberstand durch vorsichtiges Umdrehen der Platte.
17. Waschen der Zellen mit 100 ul Flusspuffer.
18. Zentrifuge Platte bei 1.000 xg für 5 min und dekantieren durch vorsichtiges Umdrehen der Platte.
19. Die Zellen 400 ul Fixation Puffer, der von 300 ul der Strömung Puffer und 100 ul 1% Paraformaldehyd in PHEM Puffer (60 mM PIPES, 25 mM HEPES, 10 mM EGTA, 4 mM MgCl ₂ bei pH 6) besteht.
20. Gegenstand Zellen Durchflusszytometrie unter Verwendung eines FACSCalibur oder gleichwertig. Analyse der Ergebnisse mit Cell Quest Pro Software Version 5.2.

3. Herstellung von PP Kryoschnitte

1. Im Vorfeld des Gewebes Sammlung hinzuzufügen Optimal Cutting Temperature (OCT)-Verbindung zu 7x7x5 mm Kunststoff-Basis Formen. Bereiten auch einen Pool von flüssigem Stickstoff (> 750 ml) in einem Dewar oder Eiskübel.
2. Euthanize Maus und führen eine laparotamy, wie oben beschrieben. Entfernen Darm und auf feuchten Papiertüchern.
3. Aufisolieren PPs für cyrosectioning, schneiden 0,5 cm quer Segmenten des Dünndarms mit einer einzigen PP und Transfer Gewebe bis zu einer Petrischale mit PBS. Vorsichtig spülen Lumen dieser Segmente mit PBS, um unerwünschte fäkale Verschmutzungen zu entfernen.
4. Zeigen Darmgewebe Segmente vertikal innerhalb Bodenformen enthalten Oktober Tauchen der Formen in flüssigem Stickstoff und erlauben Gewebe vollständig zu erstarren (1-2 min). Die Farbe des OCT wird von klar bis weiß wechseln, wenn das Gewebe vollständig gefroren ist. Für eine allmähliche Abkühlung (z. B. zu reduzieren Rissbildung des OCT), Hinweis tauchen Form in einem Bad von Isopentan mit flüssigem Stickstoff Dämpfe gekühlt:. Tragen Sie geeignete Schutzbrille bei der Arbeit mit flüssigem Stickstoff.
5. Entfernen gefroren Bodenform aus dem flüssigen Stickstoff mit einer Pinzette und erlauben die Form bei Raumtemperatur gerade lang genug ist (~ 10-15 sec) erwärmen, damit sich die Ränder der OCT-Block zu erweichen. Um dann den gefrorenen Block Oktober ausdie Form, Invertzucker der Form und drücken Sie sanft auf den Rücken, um den Block auf ein sauberes 4 x 4 cm Stück Aluminiumfolie auszuwerfen. Unmittelbar wickeln Sie das Gewebe in der Folie und in einer markierten Probe Tasche in flüssigem Stickstoff oder mit Trockeneis gelagert. Alternativ zu übertragen Gewebe in einem Gefrierschrank (<-20 ° C). Verwenden Sie das Gewebe innerhalb einer Woche, sonst werden die Blöcke spröde mit dem Alter.

Kryoschneiden

6. Kryoschnitt das Gewebe mit Hilfe eines Leica CM3050S cryomicrotome oder gleichwertig. Die Kammer Temperatur auf der Kryostat sollte bis -21 ° C eingestellt werden
7. Bemühen Sie sich um Abschnitte, die 12-14 um dick sind.
8. Sammeln Sie Schnitte auf Fisher SuperFrost Plus (oder gleichwertig) Objektträger aus Glas und Sichtprüfung mit einem Standard-Lichtmikroskop geringer Stärke. Wenn mehrere Abschnitte auf einer Folie gesammelt werden, sicherzustellen, dass sie gemeinsam für nachgeschaltete Färbung Anwendungen geclustert.
9. Shop trutscht er bei Raumtemperatur in einer Diashow box und im Idealfall nutzen sie innerhalb von ein paar Tagen.

Antibody Labeling der Kryoschnitte und konfokale Mikroskopie Analyse

10. Objektträger in Aceton (oder Methanol) in Gewebefärbung jar oder Racks für 2 min. Längerer Inkubation kann Gewebe vom Schlitten zu lösen.
11. Übertragen Folien neue Küvette überführen und 3 x waschen mit PBS-T (1X PBS mit 0,05% Tween-20) für 3 min je.
12. Umkreisen Sie die Abschnitte mit einem ImmEdge hydrophoben Stift. Dadurch wird sichergestellt, daß Reagenzien und Antikörper zu diesem Bereich werden während Inkubationen beschränkt bleiben.
13. Die Objektträger in Blockpuffer (2% Ziegenserum in PBS) für 30 min bei 37 ° C in einer feuchten Kammer, vor Licht geschützt.
14. Die Objektträger mit Fc-Block-Puffer (siehe oben) für 10 min bei 37 ° C.
15. Dip Slides in PBS-T und trocken Gegend um Abschnitte mit Kimwipes oder andere saugfähige Gewebe.Achten Sie darauf, die tatsächlichen Gewebeschnitten berühren.
16. Overlay Gewebeschnitte mit primärer Antikörperlösung, Inkubation 30 min bei 37 ° C in einer befeuchteten Kammer. Primärantikörper wird typischerweise in Blockpuffer zu einer Endkonzentration von 20 ug / ml verdünnt. Die Verwendung von direkt-markierten primären Antikörper ist wünschenswert, da so viele wie drei Antikörper auch direkt bei diesem Schritt kombiniert werden. Direkt-markierten Antikörpern auch die Notwendigkeit für zusätzliche Antikörperinkubation Schritte.
17. Waschen Sie die Slides 3 mal (5 min jeweils) durch Eintauchen in PBS.
18. Falls erforderlich, inkubieren mit relevanten Sekundärantikörper für 30 min bei 37 ° C in einer feuchten Kammer.
19. Waschen Sie die Slides 3 mal (5 min jeweils) durch Eintauchen in PBS.
20. Die Objektträger 4 min in 1% Paraformaldehyd in PHEM Puffer, wie oben beschrieben.
21. Objektträger mit PBS für 1 min.
22. Dry Umgebung Abschnitte mit Kimwipes oder andere absorbierenent Gewebe. Achten Sie darauf, die tatsächlichen Gewebeschnitten berühren. Mit einer Pipette oder Pipette vorsichtig einen Tropfen verlängern Gold-Eindeckmedium direkt auf den Abschnitt. Tragen Sie eine Deckglas auf dem Eindeckmedium kümmern, um Blasen zu vermeiden. Verwenden Löschpapier, um überschüssiges Eindeckmedium absorbieren.
23. Seal Deckgläsern auf Objektträger mit kommerziellen Nagellack und an der Luft trocknen.
24. Anzeigen Dias mit einem Leica TCS SP5 oder gleichwertig konfokalen Mikroskop.

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Ergebnisse

Die durchflusszytometrische Analyse von monodispersen Suspensionen von insgesamt PP Zellen zeigt eine klare Unterscheidung zwischen guten und schlechten Zellpräparaten. In guten Zellpräparationen mit über 80% Lebensfähigkeit zeigen die überwiegende Mehrzahl der Zellen mit hoher Vorwärtsstreuung (FSC), ein Indikator für eine hohe Zellvolumen und Low-Side-Scatter (SSC), ein Indikator für niedrige Zelle Granularität (Abbildung 2A). Bei diesem Experiment haben wir auch absichtlich eine "schlec...

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Diskussion

In diesem Artikel, wir haben parallele Protokolle zur Herstellung PP Einzelzelle Zubereitungen für die durchflusszytometrische und Funktionsanalyse und Kryoschnitten zur Immunfärbung vorgesehen. Beide Methoden sind sehr gut reproduzierbar und ohne weiteres zugänglich, vorausgesetzt ein Durchflußzytometer und Kryostat zur Verfügung. Erstmals Ermittler es sei darauf hingewiesen, dass, wenn im Vergleich zur Milz, insgesamt Zellausbeuten von PPs relativ mager sind. Dennoch, das Protokoll skizzieren wir in der Regel Ren...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artikel	Firma	Cat. #	Kommentare (optional)
Oktober Compound	Tissue-Tek	4583
7x7x5 mm Bodenform	Fisherbrand	22-363-552
ImmEdge Pen	Vector Labs	H-4000
Superfrost Plus Objektträger	Thermo Scientific	4951
Edge-Rite Klinge	Thermo Scientific	4280L
Anti-Maus CD11c-PE	eBioscience	17-0114-82
Anti-Mouse CD45R/B220-APC	BD Pharmigen	553092
Anti-Maus CD3-FITC	BD Pharmigen	561798
Anti-Maus CD4-PE	BD Pharmigen	553652
Anti-Mouse CD8-PE	BD Pharmigen	553032
Anti-Mouse CD19-PerCP	BioLegend	115531
Hanks balanced salt solution (HBSS) ohne Phenolrot	Fisher Scientific	14175-079
70 um Zellsieb	BD Falcon	352350
Spleen Dissoziation Medium	Stem Cell Technologies	7915
Ziegenserum	Invitrogen	16210-072
FC-Baustein	ATCC 2.4.G2	HB-197	Supes von Zelllinie 2.4.G2 erhalten
Curved Scissor	FST	14061-09
Kryostat	Leica	3050S
FACS Calibur	BD
Gräfin Cell Counter	Invitrogen
Hematoxylin	Richard Allan	7211
Eosin	Richard Allan	71304
Formalin	Starplex Scientific	3661
			Tabelle 1. Reagenzien und Ausrüstung in dieser Studie verwendet.