فحوصات اللونية السريعة للتمييز نوعيا RNA والحمض النووي في العينات البيولوجية

Summary

ووصف مجموعة من فحوصات اللونية المميزة للبروتين بسرعة، RNA، DNA، وإعادة ducing السكريات في عينات غير متجانسة الجزيئية البيولوجية المحتملة.

Abstract

التجريب البيوكيميائية عموما يتطلب معرفة دقيقة، في مرحلة مبكرة، من الحمض النووي والبروتينات، ومكونات أخرى الجزيئية البيولوجية في عينات غير متجانسة محتملة. ويمكن الكشف عن الأحماض النووية عبر العديد من الأساليب المتبعة، بما في ذلك الطرق التحليلية التي هي الطيفي (على سبيل المثال، A _260)، فلوروميتريك (على سبيل المثال، ملزمة من الأصباغ الفلورية)، أو اللونية (نوكليوزيد محددة التفاعلات الكيميائية مولد اللون) ¹ على الرغم من أنه لا يمكن التمييز بسهولة RNA DNA من وA ₂₆₀ / A يعمل عادة نسبة _280، كما يوفر بسيطة وسريعة ² تقييم المحتوى النسبي للحامض النووي، التي تمتص في الغالب بالقرب من 260 نانومتر والبروتين، والتي تمتص في المقام الأول بالقرب من 280 نانومتر. نسب <تؤخذ كمؤشر إلى 0،8 'نقية' عينات البروتين، في حين يتميز الحمض النووي النقي (NA) بنسب> 1.5 ^3.

حويفر، وهناك سيناريوهات فيه نسبة البروتين / NA لا يمكن أن يكون كما هو واضح أو موثوق الاستدلال على ذلك من قياسات الأشعة فوق البنفسجية في مواجهة بسيطة الطيفي. على سبيل المثال، (ط) قد تحتوي على عينات واحد أو أكثر من البروتينات التي تخلو نسبيا من الأحماض الأمينية العطرية المسؤولة عن امتصاص نانومتر في 280 ≈ (TRP، صور، الفنيل ألانين)، كما هو الحال مع بعض البروتينات RNA ملزم الصغيرة، و (الثاني) يمكن أن تظهر العينات المتوسطة A ₂₆₀ / A نسب ₂₈₀ (~ 0.8 <~ 1.5)، حيث محتوى البروتين / NA هو أقل وضوحا بكثير، وربما حتى بعض تعكس عالية تقارب بين الجمعيات ومكونات البروتين NA. لمثل هذه السيناريوهات، ونحن هنا تصف مجموعة من فحوصات اللونية للتمييز بسرعة RNA، DNA، والحد من السكريات في عينة مختلطة من المحتمل الجزيئات الحيوية. أساليب تعتمد على حساسية من الفرق pentoses والكربوهيدرات الأخرى للبنديكت، في بيال (أورسينول)، والكواشف لDische (ثنائي فينيلامين)، ويمكن أن تكون مبسطة البروتوكولات كومpleted في غضون دقائق، من دون أي خطوات إضافية من الاضطرار إلى عزل المكونات. لا يمكن أن يؤديها في المقايسات بالتوازي للتمييز بين الحمض النووي الريبي DNA و، كذلك تشير إلى وجود السكريات المختزلة مجانا مثل الجلوكوز، والفركتوز، والريبوز (الشكل 1).

Introduction

الكثير من بيولوجيا الخلية يحدث عبر التفاعلات الجزيئية التي تنطوي على الحمض النووي RNA و.. ⁴ هذه الأحماض النووية التي تحدث بشكل طبيعي (ناس) تتفاعل مع بعضها البعض، ⁵ مع البروتينات و ⁶ و مع مجموعة من المركبات الصغيرة جزيء ويغاندس في الجسم الحي (على سبيل المثال، الكاتيونات ثنائي التكافؤ ^7). التفاعلات قد تكون قصيرة أو طويلة الأجل (مصطلحات البحث)، قد تتراوح بين معتدلة إلى عالية لتقارب منخفضة (قوة الحرارية)، ويمكن أن تظهر أيضا اختلاف كبير في الخصائص الكيميائية والنوعية - بعض الجمعيات هي محددة جدا (على سبيل المثال، DNA · · · عوامل النسخ، RNA · · · عوامل الربط)، في حين لا تزال بعيدة التفاعلات الأخرى بالضرورة أكثر عمومية (مثل DNA · · · البكتيرية مثل البروتينات هيستون HU ^8). يمكن غير محددة التفاعلات مع ناس لها عواقب عملية لتجارب المختبر في إشراك خليط من biomolecules، كما أنه من الممكن، والمحتمل حتى أن بعض الوافدين الجدد سوف تقترن مع الجزيئات الحيوية التي تهم، على الأقل في بعض فرعية من الظروف التجريبية المستخدمة (قوة الأيونية، ودرجة الحموضة الحل، الخ).

تنظر، على سبيل المثال، إنتاج بروتين من الفائدة (POI) عن طريق الإفراط في التعبير مغايرة من البروتين المؤتلف في القولونية ثقافة الخلية؛ يتم تنفيذ هذا الإجراء روتيني في مختبر البيولوجيا تقريبا أي الهيكلي ⁹ في الإعداد لمزيد من التجارب، من هذا القبيل. كما توصيف البيوكيميائية / البيوفيزيائية، تبلور، وما إلى ذلك، تركز الجهود الأولية عموما على الحصول على كمية كافية من POI في شكل نقي وممكن، من الناحية المثالية كعينة متجانسة كيميائيا وmonodisperse biophysically. بعد تعطيل الخلايا المضيفة، المراحل المبكرة من سير عمل نموذجية تهدف إلى تنقية عزل POI من E. البروتينات القولونية، الأحماض النووية، خلية الحطام الجدار،وغيرها من عناصر المحللة الخلوية. ومع ذلك، قد المضيف مع الوافدين الجدد POI لأسباب عدة الفيزيائية شارك تنقية-- نقطة مهمة للغاية الأساسية قد غير وجه التحديد المنسدلة المضيف DNA / RNA، وPOI قد يكون لها عام NA-ملزمة النشاط (على سبيل المثال، HU المذكورة أعلاه)؛ قد يكون POI محددة إلى حد ما NA-ملزمة البروتين ولكن المعرض للتفاعل مع عبر الرناوات المضيف أو السلطات الوطنية المعينة؛ المضيف قد تتفاعل مع الوافدين الجدد مصفوفة اللوني وبالتالي ببساطة شارك في أزل مع POI، وهلم جرا. يمكن العشوائية، وارتفاع تقارب ملزم من الوافدين الجدد إلى المضيف POI تشكل مشكلة محيرة لأن الشوائب NA سوف تتداخل مع تجارب المرجح المصب (على سبيل المثال، المقايسات تباين مضان من الحمض النووي الريبي ملزمة POI • ^10). بدلا من ذلك، POI غير متوقعة · · · الجمعيات NA ويمكن أيضا أن ينظر إليها مصادفة، وهذه التفاعلات لإلقاء الضوء على POI الحمض النووي ملزم القدرات. وفي كلتا الحالتين، سواء الوافدين الجدد هي المكونات الرئيسية أو الملوثات، يجب على المرء أولا وتحديدتحديد نوع (DNA، RNA) للمشاركين في تنقية ناس في التحضير للتجارب المصب.

الطرق التحليلية للكشف عن وجود عدة وquantitating ناس في عينة. معظم الطرق المتاحة هي في الأساس إما الطيفي (على سبيل المثال، قيم الامتصاصية A ₂₆₀ و A ₂₆₀ / A نسب _280)، فلوروميتريك (على سبيل المثال، ملزمة من البرتقال أو ثيازول الأصباغ الفلورية الأخرى إلى NA)، أو اللونية (حساسية النيوكليوسيدات إلى التفاعلات الكيميائية أن العائد chromophores امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في المنطقة في مواجهة من الطيف الكهرومغناطيسي)، كما وصفها مؤخرا وآخرون دي مي آل. ¹ إلا أن الخطوة الحاسمة لتحديد نوع RNA أو عديد النوكليوتيد كما DNA خارج نطاق العديد من هذه الكميات النهج. هنا نقدم مجموعة من فحوصات لتحديد اللونية سريعا أنواع المكونات NA في عينة البروتينية.

وصف بروتوكولات هنا جيتم تنفيذها بكفاءة ودون خطوات إضافية لعزل الشوائب المحتملة NA، والاعتماد على الفحص بنديكت السادس عشر للحد من السكريات ^11، الفحص أورسينول لpentoses ^{12،13، 14،15} وردود الفعل ثنائي فينيلامين من deoxypentoses-2'(الشكلان 1 و 2) . اختبار بنديكت السادس عشر (الشكل 2A) يستخدم قدرة النموذج، الخطي المفتوح سلسلة (ألدهيد) من السكر الدوسي للحد من النحاس ^{2 +،} مع الأكسدة يصاحب ذلك من الكربونيل السكر في لشاردة الكاربوكسيلات وإنتاج النحاس ₂ O باعتبارها راسب أحمر غير قابلة للذوبان. وهذا التفاعل الإيجابي مع خدمة اختبار السكريات المختزلة مثل aldoses وketoses (التي تحول إلى aldoses المقابلة عبر وسيطة enediol)، ولكن ليس مع السكريات البنتوز أن يتم تأمين في شكل دوري كجزء من العمود الفقري التساهمية من الحمض النووي RNA أو عديد النوكليوتيد بسبب شرط أضيق الحدود وظائف على هيمي آسيتال مجانا، وشارك أخرىmpounds التي يمكن اختبار إيجابية في هذا الاختبار - وبالتالي يكون بمثابة interferents المحتملة - تشمل α هيدروكسي الكيتونات وoligosaccharides قصيرة (مثل المالتوز ديساكهارايد). كل من في بيال أورسينول (الشكل 2B) وتستند Dische لثنائي فينيلامين (الشكل 2C) ردود الفعل على تدمير الأولي من العمود الفقري عديد النوكليوتيد، عن طريق نزع البورينات من نوكليوزيد وحمض أو مزيد المحفز القاعدة التحلل من النيوكليوتيدات الأم، لانتاج الفيوران-2 -carbaldehyde (فورفورال) مشتقات، وهذه المشتقات تتفاعل بعد ذلك مع polyhydroxy إما الفينول مثل أورسينول (في بيال) أو ثنائي فينيلامين (في Dische) الكواشف لتشكيل منتجات التكثيف الملون من التركيب الكيميائي غير معروف إلى حد كبير. الحمض النووي RNA من خصوصية مقابل الفحص وDische تنبع من حقيقة أن السكر البنتوز يجب أن تكون 2'-امؤكسج من أجل أن تكون عرضة للأكسدة لω-hydroxylevulinyl ألدهيد، الذي يتفاعل مع مزيد من ثنائي فينيلامينفي ظل الظروف الحمضية لانتاج المكثفات زرقاء زاهية (الشكل 2C). باستخدام بروتوكولات مبسطة وصفها هنا، وجدنا أن هذه التفاعلات السكر محددة اللونية يمكن التفريق بين RNA والحمض النووي، وسوف تبين أيضا وجود السكريات المختزلة مجانا مثل الجلوكوز، والفركتوز، أو الريبوز في عينة الجزيئية البيولوجية.

Protocol

1. بنديكت الفحص للحد من السكريات

1. إعداد كمية مناسبة من كاشف بنديكت السادس عشر - 940 مم كربونات الصوديوم اللامائية، 588 سترات الصوديوم يذوى مم، 68 مم pentahydrate كبريتات النحاس (II). يمكن تخزين هذا كاشف في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة لا تقل عن ستة أشهر مع عدم وجود تغيير ملحوظ في النشاط.
2. الكاشف أعلاه هو 6X. وهكذا، ل 600 ميكرولتر ردود الفعل، إضافة 100 ميكرولتر من كاشف بنديكت السادس عشر إلى 1.5 مل نظيفة أنبوب microcentrifuge (على سبيل المثال، إيبندورف العلامة التجارية)، في أن يعاير العينة.
3. إضافة 10 ميكرولتر من أي مكان إلى 500 ميكرولتر من العينة لهذا الأنبوب، ويمكن تحديد حجم الأمثل يعتمد على كثافة اللون في تشكيل التشغيل التجريبي الأولي. إذا عينة كافية متوفرة ثم تبدأ التجارب السريرية في حجم عينة ممكن القصوى (أي خمسة أسداس من حجم رد الفعل العام، و 500 ميكرولتر من العينة في هذه الحالة)، ومن ثم تمييع في المقايسات اللاحقة.
4. إضافة DDH ₂ O إلى تويكون لتبرزي حجم النهائي إلى 600 ميكرولتر؛ مزيج من الحل أو vortexing pipetting.
5. احتضان العينات لمدة 20 دقيقة في حمام ماء مغلي.
6. إزالة عينة من الحمام الساخن والسماح لتبرد في RT لمدة 10 دقيقة.
7. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب عينة> 9300 XG (~ 10،000 دورة في الدقيقة في الدوار FA45-24-11 الزاوية الثابتة إيبندورف) لمدة 5 دقائق من أجل الرواسب الجسيمات أي مادة، وهذا هو الخطوة الأهم للدراسات الكمية بدلا من النوعية.
8. قسامة طاف من هذا الأنبوب إلى كوفيت نظيفة.
9. والأشعة فوق البنفسجية الطيف فارغة في مواجهة مع الماء.
10. قياس الامتصاص من هذه العينة في 475 نانومتر.

2. بيال الفحص أورسينول للسكر البنتوز

1. إعداد كمية مناسبة من كاشف بيال الطازج - 24.2 ملم أورسينول مونوهيدرات (انظر الشكل 2B لهيكل هذا المركب)، 6 M حمض الهيدروكلوريك، 0.025٪ وزن / حجم هيدرات كلوريد الحديديك ملاحظة:لتخزين طويلة، يمكن أن تكون على استعداد كاشف للبيال عن اثنين من الحلول الأسهم منفصلة: (ط) الكاشف A [0.05٪ W / V FeCl3 • 6H ₂ O في حمض الهيدروكلوريك تتركز] و (الثاني) الكاشف B [422 ملي مونوهيدرات أورسينول أعد في 95 الإيثانول٪]. ويمكن تخزين كاشف A RT في لمدة ستة أشهر، ويمكن تخزين B C الكاشف في ° 4 لمدة شهر، مع تغطية احباط للحد من التعرض للضوء. يتم خلط هذه الحلول الأسهم في 15 (A): 1 (B) ت / ت نسبة قبل استخدامها.
2. الكاشف أعلاه هو 2X. وهكذا، على ردود فعل مل 1.0، إضافة 500 ميكرولتر من كاشف بيال إلى 1.5 مل نظيفة أنبوب microcentrifuge، في أن يعاير العينة.
3. إضافة 10 ميكرولتر من أي مكان إلى 500 ميكرولتر من العينة لهذا الأنبوب. وفقا لمذكرة 1.3 (أعلاه)، إذا ما يكفي من عينة متاحة ثم تبدأ المحاكمة ردود الفعل باستخدام أقصى حجم العينة ممكن (أي نصف حجم رد الفعل العام، و 500 ميكرولتر من العينة في هذه الحالة) وتخفيف من هناك.
4. إضافة DDH ₂ O إلى أنبوب لجلب وحجم إينال لمل 1.0؛ مزيج من الحل أو vortexing pipetting.
5. احتضان العينات لمدة 20 دقيقة في حمام ماء مغلي.
6. إزالة عينة من الحمام الساخن والسماح لتبرد في RT لمدة 10 دقيقة.
7. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب عينة> 9300 XG (~ 10،000 دورة في الدقيقة في الدوار FA45-24-11 الزاوية الثابتة إيبندورف) لمدة 5 دقائق من أجل الرواسب الجسيمات أي مادة، وهذا هو الخطوة الأهم للدراسات الكمية بدلا من النوعية.
8. قسامة طاف من هذا الأنبوب إلى كوفيت نظيفة للتفتيش البصري.
9. لشبه التحليل الكمي، ومعمل الأشعة فوق البنفسجية فارغة في مواجهة مع الماء وقياس الامتصاصية من العينة في كوفيت 660 نيوتن متر.

3. Dische لثنائي فينيل أمين الفحص ل2'-deoxypentose السكريات

1. إعداد كمية مناسبة من كاشف ثنائي فينيلامين Dische ل- 60 مم ثنائي فينيلامين، 11 M حمض الخليك الجليدي، 179 ملي مول حامض الكبريتيك، 62٪ V / V الايثانول. يمكن هذا كاشف مسبقاقلص مسبقا وتخزينها في وعاء RT في الظلام، أو مغطاة بورق، للحد من التعرض للضوء. ينبغي بسبب الحساسية للضوء كاشف لا يمكن تخزينها لأجل غير مسمى، على الرغم من الناحية العملية يمكن أن تكون مستعدة في كل شهرين أو ثلاثة أشهر دون أي تغيير واضح في التفاعل.
2. الكاشف أعلاه هو 2X. وهكذا، على ردود فعل مل 1.0، إضافة 500 ميكرولتر من كاشف لDische نظيفة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، في أن يعاير العينة.
3. إضافة 10 ميكرولتر من أي مكان إلى 500 ميكرولتر من العينة لهذا الأنبوب. وفقا لمذكرة 1.3 (أعلاه)، إذا ما يكفي من عينة متاحة ثم تبدأ المحاكمة ردود الفعل باستخدام أقصى حجم العينة ممكن (أي نصف حجم رد الفعل العام، و 500 ميكرولتر من العينة في هذه الحالة) وتخفيف من هناك.
4. إضافة DDH ₂ O إلى أنبوب لتبرزي حجم النهائي لمل 1.0؛ مزيج من الحل أو vortexing pipetting.
5. احتضان العينات لمدة 20 دقيقة في حمام ماء مغلي.
6. إزالة عينة من الحمام الساخن وألوث لتبرد في RT لمدة 10 دقيقة.
7. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب عينة> 9300 XG (~ 10،000 دورة في الدقيقة في الدوار FA45-24-11 الزاوية الثابتة إيبندورف) لمدة 5 دقائق من أجل الرواسب الجسيمات أي مادة، وهذا هو الخطوة الأهم للدراسات الكمية بدلا من النوعية.
8. قسامة طاف من هذا الأنبوب إلى كوفيت نظيفة للتفتيش البصري.
9. لشبه التحليل الكمي، ومعمل الأشعة فوق البنفسجية فارغة في مواجهة مع الماء وقياس الامتصاصية من العينة كوفيت في 600 نانومتر.

4. ملاحظات استخدام مزيد

1. للفئات التالية من الجزيئات هي مركبات إشارة مناسبة للتحكم التفاعلات الإيجابية والسلبية لكل الفحص:
   • بنديكت السادس عشر - الإيجابية = مجانا الريبوز وسكر الفواكه والجلوكوز، السلبية = RNA، DNA، ATP، الخ. (أي ساكاريد تفتقر إلى وظائف خالية السكر الحد)
   • بيال - = RNA (مثل استخراج بيكر خميرة)، الريبوز، ATP، UMP الإيجابية؛ السلبية = سر البقريأم الزلال (BSA) أو أي بروتين أخرى
   • Dische ل- الإيجابية = DNA (مثل الغدة الصعترية العجل)؛ السلبية = RNA، ATP، الخ. (أي النوكليوتيدات غير 2'-امؤكسج)
2. تم العثور على هذه المقايسات على الصمود إلى حد ما لمركبات غالبا ما تستخدم في تنقية البروتين، على سبيل المثال، وأملاح الشائعة مثل كلوريد الصوديوم، (NH _{4) 2 4} SO، وK ₂ SO ₄ لم تتدخل، وتظهر ردود الفعل تتأثر عادة من قبل محتويات مخفف. قد المنظفات أو وكلاء chaotropic مثل اليوريا تؤثر على تفاعل من المقايسات إذا كان الرقم الهيدروجيني الأساسية للغاية؛ محايد لنطاق الأس الهيدروجيني الحمضية بشكل عام الأمثل لفي بيال والمقايسات Dische لأن من الكيمياء رد فعل الأساسية (انظر النص والبروتونات في في الشكل 2B، ج). ظروف التفاعل الأمثل يحتمل، interferents المشتبه بهم، وما إلى ذلك. وينبغي اختبار على أساس كل حالة على حدة، وذلك باستخدام الإيجابية والسلبية السيطرة التجارب ثمركبات الإشارة إيث.

النتائج

وتظهر النتائج في الشكل 3 لتطبيق هذه المقايسات اللونية لمركبات مرجعية معروفة. وتظهر البيانات النوعية للممثل البابا (أ)، بيال أورسينول (ب)، وDische في المقايسات (ج) ثنائي فينيلامين، وتظهر منحنيات القياسية لهذه المقايسات الثلاثة في الشكل 4. في لوحات 3 (AC)، ل...

Discussion

قدم المقايسات اللونية هنا نقدم مقاربة بسيطة لتقييم بسرعة الطبيعة الكيميائية للمخاليط الجزيئية البيولوجية، مثل واجهت عند تنقية البروتينات، أو المجمعات الرناوات من خلية كاملة المحللة استعدادا لمزيد من الدراسات. كما تسعى الجمعيات البيولوجيا الهيكلية أكثر الأصلي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
كاشف أو المعدات	المورد / الشركة	كتالوج رقم	التعليقات والملاحظات
كربونات الصوديوم اللامائية	فيشر العلمية	S263
سيترات الصوديوم ثنائي الماء	سيجما	S-4641
pentahydrate كبريتات النحاس (II)	VWR	VW3312-2
أورسينول مونوهيدرات	سيغما الدريخ	O1875
حمض الهيدروكلوريك المركزة	VWR	BDH3030
الحديديك كلوريد هيدرات	سيجما	F-2877
ثنائي فينيلامين	الدريتش	112763
حمض الخليك الجليدية	فيشر العلمية	A28
حمض الكبريتيك	سيغما الدريخ	258105
الإيثانول	Koptec	V1101
الريبوز	سيجما	R-7500	الإعدادية بنسبة 1٪ ث / ت في H 2 O
حمض النووي الريبي من خميرة الخباز (S. خميرة)	سيجما	R6750	الإعدادية في 10 ملغ / مل في H 2 O؛ المحل في -20 درجة مئوية
حمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (ملح الصوديوم)، من الغدة الصعترية العجل	سيجما	D1501	الإعدادية في 10 ملغ / مل في H 2 O؛ المحل في C ° 4
			الكواشف والمعدات والسلامة وترد في المواد FOالنماذج التالية في جدول الترتيب الذي تظهر في قسم البروتوكول. ما لم يذكر خلاف ذلك (أعلاه)، يمكن تخزين كافة الكواشف في درجة حرارة الغرفة والإضاءة المحيطة. ل أي مادة غير مدرجة أدناه (على سبيل المثال، أنابيب microcentrifuge)، يمكن استخدام تكوين المعتاد / نموذج / متنوعة وجدت في مختبر الكيمياء الحيوية القياسية (مثل العلامة التجارية إيبندورف 1.5 مل أنابيب microfuge). وينبغي استخدام معيار أنابيب البلاستيك لmicrofuge الخطوات التي تنطوي على الطرد المركزي (على سبيل المثال، إلى المواد الجسيمية الرواسب بالقرب من نهاية كل بروتوكول). لا سيما المواد هو الأفضل، ما دام يمكن أن تكون أنابيب مختومة، وأنابيب البولي بروبلين نموذجية وجدت في مختبرات الكيمياء الحيوية تعمل بشكل جيد. من حيث مخاوف تتعلق بالسلامة والتخلص من النفايات، ينبغي توخي الاحتياطات المختبر القياسية (نظارات السلامة، أغطية الدخان) في مرحلة ما قبل التقشير، والعمل مع، والتخلص من محاليل تحتوي على الخل المركز، الهيدروكلوريك، أو أحماض الكبريتيك. لوالمواد الكيميائية العضوية مثل أورسينول أو diphenylamine، قفازات النتريل هي أفضل من المطاط المشترك (المطاط الطبيعي) متنوعة.